동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

이 실험의 전반적인 목표는 토마토 식물의 산화 환원 조절 단백질에 미치는 pseudomona siro PV tomato의 영향을 관찰하는 것입니다. 먼저 토마토 식물에 pseudomona siro PV PV tomato를 접종하여 병원체 감염과 단백질 반응을 유도합니다. 이어서 DIAM benzine으로 염색하여 활성 산소종의 변화를 관찰합니다.

그다음, 단백질 내의 산화환원 조절 시스테인을 조사하기 위해 cyst TMT 라벨링을 수행합니다. 이를 통해 얻은 결과로 처리군과 대조군 샘플 간의 변화를 측정할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 플로리다 대학교 생물학과 및 프로테오믹스 시설의 Chen입니다.

ASCA로도 알려진 동위원소 코팅 핀 태그와 같은 기존 방법과 비교했을 때, 당사의 CTMT 태깅이 갖는 장점은 대규모로 산화환원 반응성 단백질을 분석하면서 동시에 다중 분석(multiplex)이 가능하다는 점입니다. 이번 시연은 병원균 감염에 반응하는 토마토 산화환원 조절 단백질에 대한 통찰을 제공하겠지만, 이 실험은 잎, 생쥐 또는 다른 식물 및 스트레스 조건 제어와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우리는 단 두 개의 태그만 사용할 수 있어 ICAD 실험 간에 뚜렷한 편차가 발생하는 것을 관찰한 후 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.

표지 및 농축 단계는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 VIR 시연이 매우 중요합니다. 효율적인 표지를 위해 표지된 샘플 간의 실험적 변이를 최소화하고 제거되는 부위를 줄여야 합니다. 이제 시작하겠습니다. 접종 배양을 위해 지름 4인치 화분에서 비슷한 크기의 이식된 토마토 묘 2개를 재배하십시오.

KBM 플레이트 위의 Pseudomonas syringae 균총입니다. 박테리아를 긁어 20 milliliters의 물에 넣고 1milliliter당 약 10⁶ CFU(colony forming units)의 박테리아 접종액을 준비합니다. 1 liter의 접종 완충액에 4주 된 식물을 박테리아 접종 용액에 30초 동안 담급니다.

그 다음 즉시 투명 플라스틱 백으로 덮습니다. 원하는 접종 시간이 지난 후, 완전히 확장된 잎을 수확하여 표피면이 위로 향하게 하여 1 mg/mL DAB 염색액에 넣고 15분 동안 진공 침투시킵니다. 그런 다음 잎을 상온의 암소에서 하룻밤 동안 배양합니다.

이제 염색된 잎을 95% ethanol에서 10분 동안 끓인 후, 75% ethanol에 보관하며 막자사발을 사용하여 갈아줍니다. 수확한 잎을 액체 질소에서 미세한 분말로 갈아냅니다. 그런 다음 동반된 텍스트에 설명된 대로 페놀 추출을 수행합니다.

다음으로, 100% methanol 내의 5배 부피의 차가운 0.1 molar ammonium acetate를 사용하여 페놀 추출 단백질을 침전시킵니다. 원심분리를 통해 단백질을 회수하고 펠릿 세척을 수행합니다. 그런 다음 샘플을 1.5 milliliters의 차가운 70% ethanol에 다시 현탁하여 2 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후, 에탄올 상층액을 버리고 speed vac에서 펠릿을 짧게 건조합니다. 변성 단백질 추출 버퍼에 샘플을 녹인 후, 원심분리하여 펠릿을 형성시키고 상층액을 수집하여 제조사의 매뉴얼에 따라 단백질 농도를 측정합니다. 6가지 질량 태그 각각에 대해, 100 µg의 단백질 샘플을 갓 준비한 동일 부피의 200 mM IO acetamide 알킬화 버퍼와 섞어 유리 티올기를 차단하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 단백질을 침전시키기 위해 차가운 80% acetone 1 mL를 첨가하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.

원심분리를 통해 단백질을 펠렛화하고 80% acetone으로 3회 세척합니다. 얼음 위에서 샘플을 공기 건조시킨 후, 펠렛을 50 µL의 lysis buffer에 다시 현탁합니다. 그 다음 이황화 결합을 환원시키기 위해 100 mM TCEP 0.5 µL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

시약 튜브에 20 µL의 aceto nitrile을 첨가하여 태그를 용해시킵니다. Vortex 후 spin down 합니다. 다음으로 과량의 TCEP를 제거하기 위해 50 µL의 샘플을 MicroCon 3 KD 컬럼에 로딩합니다. 50 µL의 lysis buffer를 첨가하고 4 °C, 10,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.

시료를 수집하려면 컬럼을 분리하여 깨끗한 튜브에 거꾸로 넣고 원심 분리합니다. 필요한 경우 시료의 pH를 확인합니다. 1 M 염산을 사용하여 pH 7에서 8 사이로 조정합니다.

TMT 시약을 5 µL 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 시료들을 혼합하고 동일한 부피의 lysis sample buffer를 추가하여 5분간 가열합니다. 이후 precast 12% polyacrylamide gel에서 분리합니다. 정제수로 젤을 3회 세척한 후 Coomassie blue로 1시간 동안 염색하고, 단백질 밴드 농도에 따라 수중에서 하룻밤 동안 탈색합니다. 젤 레인당 12개의 분획으로 나눕니다. 각 분획을 1 mm 크기로 절단하여 1.5 mL 튜브에 넣습니다.

0.1 M 중탄산암모늄이 포함된 50% 아세토니트릴로 겔 조각들을 완전히 침지합니다. 그런 다음 100% 아세토니트릴로 조각들을 15분 동안 덮어줍니다. 액체를 제거하고 SpeedVac을 사용하여 조각들을 건조시킵니다.

다음으로, 동일한 부피의 tripsin 용액을 첨가하고 얼음에 두어 재수화시킵니다. 그 후, triptych 소화를 위해 37 degrees Celsius에서 12-16시간 동안 배양합니다. 이어서, 배양된 시료에서 액체 단백질 추출물을 제거합니다.

5% formic acid와 50% acetonitrile로 겔 조각을 덮어 반응을 중지시키고 남아 있는 단백질 소화물을 제거합니다. 그 후 실온에서 20분 동안 겔 조각을 흔들어 줍니다. 두 번 더 추출을 반복한 후, 상층액을 단백질 추출 시료 튜브로 옮깁니다.

0.5 milliliter 튜브에 담긴 시료를 speed vac으로 건조합니다. 각 단백질 밴드의 강도에 비례하는 농도로 TBS 내의 anti TMT resin 50% 슬러리를 준비합니다. resin을 1배수 TBS 1컬럼 부피로 3회 세척한 후, 각 시료에 200 microliters의 TBS를 첨가합니다.

그 다음 anti TMT resin으로 옮겨 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 4°C에서 하룻밤 동안 rocking 합니다. 각 샘플을 컬럼에 로딩합니다. 200 µL씩 컬럼 세척을 수행합니다.

그 후 각 샘플을 200 µL의 50% elution buffer로 3회 용출시키고 진공 상태에서 건조합니다. 샘플을 0.1% formic acid가 포함된 3% aceto nitrile 12 µL에 현탁한 다음, 5 µL를 HPLC 컬럼에 직접 주입합니다. 동반 텍스트에 상세히 기술된 대로 aceto nitrile 농도를 높이는 구배(gradient)를 사용하여 펩타이드를 용출시킵니다.

질량 분석법을 사용하여 top 2 by 3 워크플로우로 펩타이드를 검출하십시오. 먼저 단일 단계 ms를 수행합니다. 그런 다음 higher energy C trapped dissociation 단편화를 통해 3개의 Ms.Ms 스펙트럼을 획득하고, 이어서 3개를 더 획득합니다.

단백질 식별을 위해 충돌 유도 해리(collision induced dissociation) 방식의 Ms.MS를 수행합니다. 분기형 워크플로우를 사용하여 질량 분석 데이터를 분석합니다. 비율 정량을 위해 리포터 이온 정량기를 구현합니다.

또한, 스펙트럼 선택기, 스펙트럼 정규화 및 스펙트럼 그룹화 노드를 통해 MSM MS 스펙트럼을 처리하고 seaquest 검색 엔진을 통해 데이터를 쿼리하십시오. 이 이미지는 DAB로 염색한 후의 대조군 토마토 식물 잎(왼쪽)과 pseudomonas를 접종한 잎(오른쪽)의 예를 보여줍니다. DES 염색 과정은 조직 화학적 염색을 통해 잎 조직 내의 활성 산소종 징후를 나타내게 합니다.

예상대로 대조군은 유의미한 염색을 보이지 않는 반면, pseudomonas 처리된 잎은 과산화수소 생성에 대해 양성 반응으로 염색됩니다. 이 예시는 각 시료의 차등적으로 산화환원 조절되는 단백질 피크 면적에 대한 프로테옴 발견 데이터 출력이 절대 정량을 가능하게 함을 보여줍니다. 대조군과 접종 시료 간의 피크 면적은 상대적인 양을 나타냅니다.

여기서는 대조군과 접종 샘플 간의 단백질 산화환원 조절이 유사하게 나타납니다. 비슷한 강도의 피크는 처리 조건의 변화로 조절되지 않는 이황화 결합의 존재를 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 1주일 이내에 적절히 수행할 수 있습니다.

시료를 계속 차갑게 유지하고 라벨을 체계적으로 관리하십시오. 또한, 이 절차에 따라 흄 후드 내에서 작업하고 내화학성 장갑을 착용하는 등 페놀 사용 시 주의사항을 준수하십시오. 오닉산(onic acid) 및 글루타치온 실뮬레이션과 같은 다른 시스템 수정 사항을 결정하기 위해 번역 후 변형에 대한 특정 질량 분석법 분석과 같은 추가 측정법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 DIB standing CTMD 활성화 및 redox 16 검증을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.