Name: 동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 학습하세요 동위원소 태그 질량 분광법을 사용하여 토마토 식물의 티올 산화환원 프로테옴을 프로파일링하는 방법을 배우세요. Pseudomonas syringae 감염에 따른 산화환원 조절 단백질 변화를 분석하여 식물 스트레스 반응 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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저자 DC3000 스트레인, 토마토 종자 및 조언을 제공하는 닥터 그렉 마틴 (코넬 대학)와 그의 그룹을 감사드립니다. 또한 박사 Zhonglin은 그 방법 개발 지원을위한 바이오 연구 University of Florida는 학제간 센터에서 DAB 프로토콜 및 Proteomics 부문과 관련하여 도움이 MOU 체결 감사드립니다. 단백질 추출을위한 프로토콜은 Hurkman와 다나카 16 일부터 바뀌었습니다. 6 cysTMT 라벨, 4 단계의 프로토콜은 원래 써모 피셔 과학 피어스 제품 설명서를 17 일 기준으로 적응되었다. 이 작품은 국립 과학 재단 (S 첸에 MCB 0,8​​18,051)에 의해 재정 지원되었다.

1. 성장하는 모종 및 준비 박테리아 <ol><li> 모종은 성장 챔버 (22 8 시간 빛의 photoperiod 160 μmol 광자 m -2 s의 -1에서의 MetroMix 500 토양 혼합물 (BWI ​​회사)에 germinated되는 20 어두운 ° C와 16시간 ° C에서 1 주일. 상대 습도는 70 %로 설정되었다. 건조되기에서 토양을 유지하기 위해 필요에 따라 모종은 수돗물로 물이나되었다. </li><li> 유사한 크기의 두 모종 그 다음 MetroMix 500 토양을 포함한 4 &quot;직경 냄비에 이식 및 1.1과 같은 조건에서 추가로 3 주동안은 성장하고 있습니다. </li><li> 모나스 syringae (PST)는 킹스 B 중간 (KBM) 접시 (리터 당 20g Proteose 펩톤, 0.1975 g MgSO 4, 1 % 글리세롤, 1.5 g K 2 HPO 4, 18g 한천)에 처음 T-streaked이며위한 성장 28 이틀은 ° C. 하나의 식민지가 300μl 액체 킹스로 혼합, 수집되는 B 매체 (20g Proteose 펩톤, 0.1975 g MgSO 4 </sub&gt;을, 10 ML의 글리세롤, 100x K 2 HPO 4 주식의 10 ML (H 2 O의 10 ML의 K 2 HPO 4 1.5 g) 및 킹스 B 중간 판에 퍼졌다. 이것은 28 ° C.에 밤새도록 배양해 있습니다 </li><li> 박테리아의 inoculum 20 ML H 2 O.로 KBM 접시에서 교양 박테리아를 부서에 의해 준비가되어 있습니다 0.03의 OD 600이 (~ 10 6 cfu / ml) 쇼핑 (10 밀리미터 MgCl 2 + 400 μL Silwett-70) 접종 버퍼 1 패에 준비가되어 있습니다. 접종 버퍼 마이너스 박테리아는 제어 솔루션을 위해 작성됐다. </li></ol> 2. PST 및 H 2 O 2 토마토의 접종 얼룩 Histochemical <ol><li> 포 주 오래된 식물은 30 초 동안 위의 접종 솔루션 파버으로 주사되었다. 투명 비닐 봉투는 즉시 접종 후 식물을 통해 거쳐야했다. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB)은 11가 (H 2 O 1 밀리그램 / ML DAB, 산도 3.8 (HCL)) 세 d 개의 준비되었다 얼룩ays 전에 완전한 solubilization을 달성하기 위해 사용합니다. 솔루션은 상온에서 혼합하라고 누볐어되었다. </li><li> 24 시간 밖에 치료 후 완전히 확장 잎은 표피 쪽을 얼룩 DAB에 배치, 제거 및 진공은 15 분 동안에 침투되었다. 잎은 그러면 염색법을위한 밤 내내 실내 온도에서 어두운 넣어되었습니다. </li><li> 잎은 10 분 95 % 에탄올에 삶은 후 75 % 에탄올에 보관되었다. </li></ol> 3. 단백질 추출 <ol><li> 수확 후에는 토마토 잎은 박격포와 유봉을 사용하여 액체 질소와 미세 분말로 외출했다. </li><li> 조직 0.5 g 들어, 페놀 1.25 ML 트리스 산도 8.8 버퍼에 추가 및 추출 버퍼의 1.25 ML / 0.5 g (0.1 M 트리스-HCL pH는 8.8, 10 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.9 M의 자당)는 다음의 몇 분 동안 분쇄 계속 퓸 후드. </li><li> Oakridge의 원심 분리기 튜브 (써모 피셔 과학 Nalgene 회사)에 추출물을 전송하고 실온에서 2 시간 동안 선동. </li><li> 5,000 XG에 원심 분리기15 ° C ~ 10 분입니다. 새로운 깨끗한 튜브로 가기 페놀 위상을 전송합니다. </li><li> 동일한 볼륨 백 추출 수성 단계는 페놀 버퍼를 추출, 30 분 대한 흔드는에 선동. 원심 분리기와 새로운 팔콘 튜브에 추출물을 전송. </li><li> 위의 단계를 한 번 더 시간을 반복하고 새로운 Oakridge 튜브에 추출물을 전송. </li><li> 100 % 메탄올 (-20 ° C에 저장된)에서 0.1 M의 암모늄 아세테이트의 5 볼륨을 추가하여 페놀 추출한 단백질을 침전. 하룻밤을위한 -20 ° C에서 소용돌이와 부화. </li><li> 20 분 동안 20,000 XG, 4 ° C에서 원심 분리하여 단백질 펠릿를 수집합니다. </li><li> 80% 차가운 아세톤과 메탄올과 2 번의 차가운 0.1M의 암모늄 아세테이트와 펠릿 2 번 씻으십시오. 펠렛에 1.​​5 ML 차가운 70 % 에탄올을 추가하고 일시 중지합니다. 20 분 동안 2 ML의 microcentrifuge 튜브 (미국 과학) 및 14,000 rpm으로 원심 분리기, 4 ° C로 전송합니다. 에탄올을 제거합니다. </li><li> Speed​​Vac 농축기에 펠렛에 간단히 말리도록하며 단백질 extr에 녹아작업 버퍼 예 ReadyPrep 단백질 추출 키트 시약 3 (8 M의 요소, 4 % 챕스, 40 MM 트리스베이스, 2 M 티오 우레아) (바이오 방사선). 펠렛을 형성하기 위해 30 분 동안 14,000 RPM, 20 ° C에서 원심 분리기. 표면에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 제조 업체의 설명서 (제노 기술)에 따라 CB-X 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. </li></ol> 4. cysTMTs과 샘플 준비 및 펩타이드의 라벨링 <ol><li> 2-5 μg / μL의 농도에 단백질 샘플을 준비합니다. 자, 각 대규모 태그를 20 μl-50 μL 샘플을 단백질 100 μg을 사용합니다. 본 실험에서는 모두 6 태그가 사용되었습니다. </li><li> 무료 thiol 그룹을 차단하는 단백질 샘플로 알킬화 버퍼의 동일 부피 (100 MM 트리스-HCL pH7.5, 200 MM iodoacetamide)를 추가합니다. 버퍼는 신선 준비되어야한다. 알킬화는 1 시간 동안 37 ° C에서 수행됩니다. </li><li> 하룻밤을위한 -20 ° C에서 차가운 80 % 아세톤 1 ML을 추가하여 단​​백질을 침전. 14,000에서 centrifuging에 의해 펠릿 단백질RPM, 4 ° C에서 20 분입니다. 매번 vortexing 80 % 아세톤으로 펠릿 3 번 씻으십시오. 표면에 뜨는를 제거하고 얼음에 건조 잠시 일입니다 수 있습니다. </li><li> 50 μL 용해 완충액 (6 M의 요소, 50 MM 트리스베이스, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 펠렛을 Resuspend. 100 MM 트리스 (2 - Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) 0.5 μL 그런 다음 실온에서 한 시간 만이라도 잠복기하여 이황화 채권을 줄이기 위해 추가됩니다. </li><li> 태그를 solubilize하는 시약 튜브에 acetonitrile 20 μL를 추가하여 태그를 준비합니다. 와동하고 아래로 내려 봐. </li><li> Microcon 3KD 원심 필터 장치 (Millipore)을 사용하여 추가 TCEP을 씻으십시오. Microcon 3KD 칼럼 50 μL 시료를 추가하고 컬럼 50 μL 용해 완충액. 10,000 XG와 4 ° C.에 15 분 동안 원심 세 번 총 대해이 단계를 반복합니다. 컬럼을 제거하고 깨끗한 튜브로 바꾸란. 1,000 XG와 4 ° C.에서 5 분 동안 원심 </li><li> 산도를 확인합니다. 필요한 경우 1 M HCL과 7.0-8.0에 산도를 조정합니다. </li><li> cysTM 5 μL를 추가하십시오각 샘플 (cysTMT 시약 키트는 최대 500 μg 단백질려면 20 μL 태그를 제공합니다.이 방법은 우리가 태그 중 하나 - 다섯 번째를 사용하므로, 100 μg 단백질을 사용합니다.)에 T 시약. 상온에서 2 시간 동안 진행하는 반응을 허용합니다. </li><li> 샘플은 1:1 비율로 Laemmli 샘플 버퍼 (바이오 방사선)와 결합되었다. </li></ol> 5. 비 반응 태그 샘플 분획화 제거 <ol><li> 샘플은 5 분 동안 끓인와 사전 캐스트 12 % polyacrylamide 겔 (바이오 방사선)에서 분리되었다. 겔은 걸러 H 2 O 5 분 간격으로 세 번 씻어서 1 시간 정도 Coomassie 파랑 (바이오 방사선) 물들일되었습니다. 겔은 H 2 O를 함께 하룻밤 드 묻은였다 </li><li> 정오 분수는 각 겔 차선에서 수집되었다. 분수는 단백질 밴드 농도에 의해 결정됩니다. 분수는 1mm의 조각으로 잘게와 1.5 ML 튜브에 수집되었다. </li><li> 젤 조각 H 2 년 50 % acetonitrile과 0.1 M의 탄산수 소 암모늄을 사용하여 드 묻은 있었다 </서브&gt; O. 블루 색상이 젤 조각 (~ 3-4 회, 15 분마다)에서 제거될 때까지이 단계를 반복해야합니다. </li><li> 드 묻은 겔 조각 15 뜨는 제거한 분, 그리고 Speed​​Vac를 사용하여 건조 조각에 대한 100 % acetonitrile을 (겔 조각을 포함)를 사용하여 건조되었다. </li><li> 25 밀리미터 탄산수 소 암모늄의 동일한 볼륨 (같은 풀링된 레이블 샘플)의 비율 : 1시 10분에서 트립신 (Promega) (단백질의 트립신)를 해산. 예를 들어, 500 μL의 볼륨과 600 μg 단백질 샘플이 25 밀리미터 탄산수 소 암모늄 500 μL에 녹아있는 60 μg의 트립신 필요합​​니다. </li><li> 겔 조각 트립신 솔루션을 추가하고 rehydrate하기 위해 얼음을 설정합니다. 조각이 포함되지 않은 경우 50 밀리미터 탄산수 소 암모늄 버퍼를 추가합니다. rehydration 후 12-16 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> incubated 샘플에서 액체 단백질 추출물을 제거합니다. </li><li> 반응을 중지 5 % 개미의 염산, 50 % acetonitrile과 젤 조각을 포함하여 남아있는 단백질 소화를 제거 .. 객실 테에서 20 분 동안 겔 조각을 흔들어mperature. 5.7에서 추출한 단백질 샘플 튜브에 뜨는을 전송합니다. 두 번 추출 절차를 반복합니다. Speed​​Vac를 사용하여 압축을 푼 펩티드를 건조합니다. </li></ol> 6. cysTMT 라벨-펩티드의 샘플 농축 <ol><li> 50 % 슬러리를위한 0.5 ML 튜브에 안티 - TMT 수지의 그라데이션을 추가합니다. (그라데이션은 분획화 젤의 밴드 농도에서 산출된 것입니다. 분획 컬렉션 어두운 밴드로 구성되어있다면, 더 수지가 필요합니다. 적은 단백질가로 약한 밴드와 분수 덜 수지가 필요합니다.) </li><li> 수지는 다음 1X 중 하나 열 볼륨으로 세 번 씻어있다 트리스 버퍼 염분 (TBS) (25 MM 트리스, 0.15 M NaCl, 산도 7.2) (써모 과학 피어스 단백질 연구 제품). </li><li> 각 시료 200 μL 1xTBS를 추가합니다. 샘플 그런 다음 안티 - TMT 수지 (써모 과학 피어스 단백질 연구 제품)에 추가 및 4 ° C.에서 하룻밤 출렁 이는 다음에 2 시간 동안 실온에서 교반하고 </li><li> 열 (에 샘플을 추가rmo 과학 피어스 단백질 연구 제품). </li><li> 1X 200 μL TBS와 함께 각 열에 세 번 씻는다. 이 후 0.05 %의 챕스 (1X TBS에 녹아있는)로 세 번 세척과 함께옵니다. </li><li> 열은 후 1X TBS 4 M의 요소로 세 번 씻어있다. H 2 O의 이백 microliters 그런 다음 열 세 번 씻어 사용됩니다. </li><li> 각 시료는 200 μL 50 % 용리 완충액 (50 % acetonitrile, 0.4 % TFA)를 세 번 eluted있다. </li><li> 샘플은 다음 진공 농축기로 건조됩니다. </li></ol> 7. 질량 분광법 분석 <ol><li> 0.1 % 개미의 산성으로 3 % acetonitrile 12 μL에서 샘플을 Resuspend하고 Eksigent NanoLC-1D 고압 액체 크로마 토그래피 칼럼 (AB SCIEX, 미국)에 직접 5 μL를 주입. </li><li> 펩티드는 Proteopep II C18 컬럼 75 μm의 ID를 구분됩니다 4-60% 기울기를 (사용 X 20cm (새로운 목표, 미국) : 3 % acetonitrile, 0.1 % 개미의 산성, B : 97 %의 acetonitrile, 0.1 %의 개미 산성)3 μL / 60 분여 분. </li><li> 써모 과학 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기는 단일 스테이지 MS 구성된 × 3의 실험은 3 MS이어서 높은 에너지 C-트랩 분리 (HCD) 단편화와 MS / MS 스펙트럼 3의 인수 다음에 가기 2를 사용하여 펩티드를 검색하는 데 사용되었다 단백질 식별을위한 충돌 유발 분해 (CID)와 / MS. 이 모드에서 매개 변수가 있었다 : 절연 폭 : 3.0 M / Z, 충돌 에너지 : 50 % (두 단계로 10 %). 오직 두 곱으로 및 triply - 충전 펩티드는 조각으로 선택되었다. 동적 제외 매개 변수로 설정되었습니다 = 1 세어 반복, 반복 기간 = 60; 제외 목록의 크기 = 500; 제외 기간은 = 28. 다음과 같이 대상 값은 다음과 같습니다 MS = 5 전자 5; MS / MS (HCD) = 1 E 5. 이온 전송 시간은 MS / MS (HCD)에 대한 FTMS 300 500로 설정되었다. 두 microscans은 HCD 스펙트럼이 필요했다. </li></ol> 8. 데이터베이스 검색 및 Quantitation <ol><li> 인수 CID와 HCD 데이터 있었다비율을 수치 리포터 이온 양자 화기 (조각 이온 20 PPM 질량 공차)를 구현 측쇄 워크플로우를 통해 써모 과학 프로테옴의 Discoverer가 소프트웨어 1.2 (써모 과학 피어스 단백질 연구 제품)을 사용 nalyzed. 별도의 세그먼트는 스펙트럼 선택기, 스펙트럼 Normalizer 및 스펙트럼 그룹화 노드를 통해 MS 두 스펙트럼이 처리되었습니다. </li><li> 데이터는 다음 SEQUEST 검색 엔진으로부터 검색되었습니다. 20 PPM 질량 공차가 사용되었습니다. 정적 수정은 cysTMT 시약으로 설정 (304.18 다) 및 동적 수정 인산화 및 메티오닌의 산화를 (15.99 다) 포함되었습니다. Solanum lycopersicum에 대한 사용자 정의 데이터베이스는 RNA 데이터 (하버드 대학에서 약 350,000 항목과) 13이 두 경우에 사용되었다를 사용하여 구성되었습니다. </li></ol> 9. 대표 결과 제어 토마토 식물 잎과 모나스 주사 나뭇잎의 대표 이미지입니다그림 1에 표시된. 처리 제어 및 모나스 취급 나뭇잎 사이의 차이가 관찰된다. 나뭇잎을 제거하고 드 염색법 프로세스가 잎 조직에서 ROS의 흔적 (그림 2)를 표시 histochemical 얼룩을 허용합니다. DAB를 사용 물들일 후 그림 2A 아무 염색법과 제어 나뭇잎의 대표입니다. 그림 2B는 대표 H 2 O 2 생산을위한 모나스와 긍정적인 염색법으로 취급 나뭇잎의. differentially 산화 환원 규제 단백질의 프로테옴 디스 데이터 출력의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 이 단백질은 알려진 산화 환원 조절 단백질 ferredoxin-1 14이며, 모나스 syringae PV 토마토 15에 대한 방어 역할을 보여줘왔다. 제어 및 주사 샘플 사이의 피크 강도는 ferredox에 상당한 변화를 보여 상대적 부량를 얻기 위해 사용됩니다에서-1 산화 환원 조절 (P &lt;0.05). 높은 강도 봉우리는이 단백질은 병원균 치료에 대한 응답으로 산화되는 것을 권해드립니다. 그림 4는 컨트롤과 주사 샘플 사이에 단백질의 산화 환원 유사한 규정을 가지고 단백질의 프로테옴 디스 데이터 출력의 예입니다. 유사한 강도의 봉우리는 치료의 변화에​​ 의해 규제되지 이황화 채권의 존재를 제안합니다. 방법은 과학자들이 산화 환원 반응 cysteines 및 disulfides 10을 감지하는 방법 대변혁을 가져올 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> 그림 1. 주사 토마토의 대표 이미지 제어 솔루션 ()와 모나스 (B)로 떠난다. &lt;스팬 클래스 = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> 그림 2. 주사 토마토의 DAB의 염색법의 대표 이미지 제어 솔루션 ()와 모나스 (B)로 떠난다. 낙엽은 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine을 사용 물들어 있었다. 엽록소는 95 % 에탄올에 끓고하여 나뭇잎에서 제거되었습니다. 다크 염색법은 H 2 O 2의 존재를 나타냅니다. 단 박테리아 문화는 어두운 염색법을 보여주 함께 주사 떠난다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> 그림 3. ferredoxin-1의 프로테옴 디스 데이터 출력, differentially 산화 환원 규제 단백질 14 예. 각 피크 위에 피크 강도는 절대 부량에 사용됩니다. 제어 및 주사 샘플 사이의 피크 강도가 사용됩니다상대 부량을 수행합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> 그림 4. 컨트롤과 주사 샘플 간의 유사 피크 강도를 가진 단백질의 프로테옴 디스 데이터 출력의 예. 유사한 강도의 봉우리는 치료의 변화에​​ 의해 규제되지 이황화 채권의 존재를 제안합니다.

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<li>Cysteine-Reactive Tandem Mass Tag®(cysTMT®) Reagents. , Thermo Scientific Pierce Biotechnolgy. Rockford, IL. Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.piercenet.com/instructions/2162220.pdf">http://www.piercenet.com/instructions/2162220.pdf</a> (2011).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜은 DAB의 염색법을 수행 관한 정보뿐만 아니라 cysTMT 분류 산화 환원 시스테인 부량를 제공합니다. 이러한 절차는 ROS의 생산뿐만 아니라 Solanum lycopersicum는 모나스 syringae으로 주사되는 단백질 규제에 대한 영향을 조사에 유용합니다. 이 프로토콜에 제시된 방법은 잎 조직 손상의 최소 금액을 일으키는 방식으로 전체 잎 샘플에서 ROS를 검사하는 방법을 제공합니다. 라벨 절차는 시스테인 라벨링 방법을 이용하여 잠재적으로 산화 환원 규제 단백질을 검사하는 방법을 제공합니다. 스트레스 반응의 초기 단계 검사 때 유용합니다. 이러한 동위 원소 코딩된 친화 태그 (ICAT)와 cysTMT 같은 방법은 생물 학적 샘플에서 잠재적인 산화 환원 조절 단백질 검사에 사용될 수 있습니다. ICAT는 라벨 두 샘플 12 비교 있습니다. 두 방법 모두 무료 cysteine​​s을 라벨과 quantific 단백질에 사용할 수ation 10,12. 그러나 cysTMT 방법은 실험적인 변형의 감소뿐만 아니라 10 멀티플렉싱을 허용합니다. 사용 가능한 태그의 수는 연구자들이 실험적인 디자인으로 복제하거나 여러 샘플을 포함시킬 수 있습니다. 샘플이 더 많다는 것은 확인된 단백질의 높은 숫자의 가능성을 제공합니다. cysTMT 기법의 가장 큰 단점은 그것 때문에 cysTMT 표시된-펩티드 (6.5-6.6)에 대한 선택적 농축 단계의 단백질 식별의 전반적인 품질을 떨어뜨리고있다는 것입니다. 단백질 식별을위한 펩티드의 수는 단백질 시퀀스에있는 시스테인 잔류물의 수에 따라 크게 달라집니다. 이 문제는 질량 분광법 단백질 식별을 위해 농축 전에 tryptic 샘플의 일부를 제출하여 극복할 수 있습니다. 실험적인 디자인뿐만 아니라 cysTMT 메서드가 활용하는 레이블링 메커니즘의 특성으로 인해 특정 단계가 중요합니다. 단백질 preci을 수행하는 동안pitation 및 펠렛 washings (3.9)은 단백질 저하를 줄이기 위해 얼음을 차게 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. 샘플 역방향 라벨을 받다 수 있으므로 cysTMT 라벨 동안 줄이는 시약 (4.6)의 제거가 중요합니다. 시약을 줄이는 것은 표본에 남아있다면 역방향 라벨이 가능합니다. 샘플 라벨 이후에 감소하는 경우 cysTMT 태그는 제거할 수 있습니다. 레이블 샘플에 추가됩니다되면 ph 수준은 최적의 레이블링 효율성을 위해 (4.7) 확인되어야합니다. 또한, 데이터 분석은 연구자와 프로토콜을 사용하는 궁극적인 목표는 요구되는 무엇에 따라 달라집니다. 또한 각각의 소프트웨어가 서로 다른 알고리즘을 가지고 사용중인 소프트웨어에 따라 달라집니다. 이 실험은 토마토의 반응 산화 종 향상된 생산을위한 elicitor와 같은 병원체 활용되지만, 기타 산화 환원 조절 반응이 적절하게 측정할 수 있습니다. 이 실험 설계는 다른 식물과 동물 시스템에 적용할 수있다. </P&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI 회사 </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-Diaminobenzidine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep 선형 추출 키트 시약 3 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X 단백질 분석 </td><td> 제노 기술 </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT 시약 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 90,071 </td></tr><tr><td> Laemmli 샘플 버퍼 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> 바이오 안전 Comassie (G-250 얼룩) </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD 칼럼 </td><td> Millipore </td><td> 42,403 </td></tr><tr><td> 고정화 방지 TMT 수지 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 90,076 </td></tr><tr><td> 원심 칼럼 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 89,896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 컬럼 </td><td> 새로운 목표 </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90,389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> 써모 과학 </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> Speed​​Vac </td><td> Labconco </td><td> 7,812,013 </td></tr><tr><td> 프로테옴 Discoverer가 1.2 소프트웨어 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge의 원심 분리기 튜브 </td><td> 써모 과학 NalgeNE 회사 </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브 (2ml) </td><td> 미국 과학 </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% 미니 프로 테우스 TGX 프리 캐스트 젤 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> 양식의 맨 위로 양식&gt; 바이오 안전 Coomassie StainBottom </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT 농축 키트 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 90,077 </td></tr></tbody></table>

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

모나스 syringae PV. 토마토 스트레인 DC3000은 Arabidopsis thaliana, 유전적으로 취급하기 쉬운 호스트 식물 1,2에 Solanum lycopersicum에서뿐만 아니라 Brassica 종의 세균성 반점 질환의 원인뿐만 아니라뿐만 아니라. DC3000으로 주사 cotyledons의 반응성 산소 종 (ROS)의 축적 토마토 3의 세균성 반점 병 중에 modulating 괴사성 세포 사망의 ROS의 역할을 나타냅니다. 과산화수소, ROS의 구성 요소는 모나스 3 토마토 식물의 접종 후 제작합니다. 과산화수소는 histochemical 얼룩 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB) 4를 사용하여 감지가 가능하다. DAB의 염색법은 잎 조직 4 얼룩 갈색을 생성하는 과산화수소와 반응. ROS는 5 특정 단백질의 산화 환원 상태를 변경할 수 세포 산화 환원 환경의 규제 역할을하고 있습니다. 시스테인은에 민감한 중요한 아미노산이다산화 환원 변경됩니다. 온화한 산화에서 시스테인 sulfhydryl 그룹의 가역 산화은 생리적 과정 6,7의 다양한 규제 산화 환원 센서 및 신호 변환기 역할을한다. 탠덤 질량 태그 (TMT) 시약이 동시 신분증을 활성화하고 탠덤 질량 분광법 8,9를 사용하여 서로 다른 샘플에서 단백질의 quantitation를 멀티플렉싱. 시스테인, 반응 TMT (cysTMT) 시약은 선택 라벨링과 상대적 quantitation 시스테인 함유 여섯 생물 학적 샘플이 최대의 펩티드을 가능하게합니다. 각 isobaric cysTMT 태그는 같은 명목 부모가 질량을 가지고 있으며, sulfhydryl, 반응 그룹, MS-중립 스페이서 팔과 MS / MS 기자는 10로 구성되어 있습니다. 라벨 후, 샘플 테아제 소화에 따라 달라질 수 있었다. 시스테인-라벨이 펩티드는 안티 TMT 항체를 포함하는 수지를 사용하여 풍부하게되었다. MS / MS 분석을하는 동안 기자 이온 일련의 (예 : 126-131 다)는 상대적 quantitation에 대한 정보를 제공하고, 낮은 대량 지​​역에서 등장.작업 흐름, 샘플 복잡도를 줄이고 동적 범위 향상과 시스테인 수정 사항을 공부에 대한 효과적입니다. 여기서 우리가 PST DC3000 취급 토마토의 산화 환원 proteomic 분석을 제시 (리오 그란데) cysTMT 기술을 사용하여 떠난다. 이것은 높은 처리량 방법은 다른 산화 환원 - 규제 생리적 과정을 연구에 적용할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

세포가 스트레스 조건을 만났을때 반응 산소 종 수준이 상승하고 있습니다. 여기 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine의 염색법의 예제뿐만 아니라 산화 환원 프로테옴을 프로파일하기 위해 cysTMT 라벨 및 질량 분광법을 보여<em&gt; 모나스 syringae</em&gt; 토마토 잎사귀를 치료.

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 균주는 Solanum lycopersicum뿐만 아니라 Brassica 종, 그리고 ...에서도 세균성 점무늬병을 유발합니다.

본 실험의 전반적인 목적은 토마토 식물의 산화환원 조절 단백질에 미치는 pseudomona siro PV tomato의 영향을 관찰하는 것입니다. 먼저, 병원균 감염과 단백질 반응을 유도하기 위해 토마토 식물에 pseudomona siro PV PV tomato를 접종합니다. 이어서 DIAM benzine으로 염색하여 활성 산소종의 변화를 관찰합니다.그 다음, 단백질 내의 산화환원 조절 시스테인을 분석하기 위해 시스테인 TMT 표지를 수행합니다. 이를 통해 얻은 결과로 처리군과 대조군 샘플 간의 변화를 측정할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 플로리다 대학교 생물학과 단백질체학 시설의 Chen입니다.ASCA로도 알려진 동위원소 코팅 핀 태그와 같은 기존 방법과 비교하여 본 CTMT 태깅의 장점은 대규모로 산화환원 응답성 단백질을 분석하는 동시에 다중 분석이 가능하다는 점입니다. 본 시연은 병원균 감염에 반응하는 토마토의 산화환원 조절 단백질에 대한 통찰을 제공하겠지만, 이 실험은 조류, 생쥐, 다른 식물 및 스트레스 조건 제어와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 저희는 단 두 개의 태그만 사용할 수 있어 ICAD 실험 간에 뚜렷한 편차가 발생하는 것을 관찰한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.라벨링 및 농축 단계는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 VIR 시연이 매우 중요합니다. 효율적인 라벨링을 위해 라벨링된 샘플 간의 실험적 변동을 최소화하고 제거되는 부위를 줄여야 합니다. 이제 시작하겠습니다. 접종 배양을 위해 유사한 크기의 이식된 토마토 묘 2개를 지름 4인치 화분에서 재배하십시오.KBM 플레이트 상의 *Pseudomonas* single lawn입니다. 박테리아를 긁어 20 milliliters의 물에 넣고, milliliter당 약 10⁶ colony forming units 정도의 박테리아 접종액을 준비합니다. 1 liter의 접종 완충액에서 4주 된 식물을 박테리아 접종 용액에 30초 동안 담급니다.그런 다음 즉시 투명 플라스틱 백으로 덮습니다. 원하는 접종 시간이 지나면, 완전히 전개된 잎을 수확하여 표피 쪽이 위로 향하게 하여 1 mg/mL DAB 염색액에 넣고 15분 동안 진공 침투시킵니다. 이후 잎을 실온의 암소에서 하룻밤 동안 배양합니다.이제 염색된 잎을 95% ethanol에서 10분 동안 끓인 후 75% ethanol에 보관하십시오. 수확한 잎을 액체 질소에서 막자를 사용하여 미세한 분말로 갈아냅니다. 그다음 동봉된 텍스트에 설명된 대로 페놀 추출을 수행합니다.다음으로, 100% methanol 내의 차가운 0.1 molar ammonium acetate 5배 부피를 사용하여 페놀 추출 단백질을 침전시킵니다. 원심분리로 단백질을 회수한 후, 펠렛 세척을 수행합니다. 그 다음 시료를 차가운 70% ethanol 1.5 milliliters에 재현탁하여 2 milliliters 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.원심분리 후, 에탄올 상층액을 버리고 스피드백(speed vac)으로 펠릿을 짧게 건조합니다. 변성 단백질 추출 버퍼에 샘플을 용해한 후, 원심분리하여 펠릿을 형성시키고 상층액을 수집하여 제조사 매뉴얼에 따라 단백질 농도를 측정합니다. 6개의 질량 태그 각각에 대해, 100 µg의 단백질 샘플을 갓 준비한 200 mM IO 아세트아미드 알킬화 버퍼와 동일한 부피로 혼합하여 유리 티올기를 차단하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 단백질을 침전시키기 위해 차가운 80% 아세톤 1 mL를 첨가하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.원심분리를 통해 단백질을 펠렛화하고 80% acetone으로 3회 세척합니다. 얼음 위에서 시료를 공기 건조시킨 후, 펠렛을 50 µL의 lysis buffer에 다시 현탁합니다. 그 다음, 이황화 결합을 환원시키기 위해 100 mM TCEP 0.5 µL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다.시약 튜브에 아세토니트릴 20 µL를 첨가하여 태그를 가용화합니다. 볼텍싱 후 원심분리하여 침전시킵니다. 다음으로, 과량의 TCEP를 제거하기 위해 50 µL의 시료를 MicroCon 3 KD 컬럼에 로딩합니다. 용해 버퍼 50 µL를 첨가하고 4 °C에서 10,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.시료를 수집하려면 컬럼을 제거하여 깨끗한 튜브에 뒤집어 넣고 원심분리합니다. 필요에 따라 시료의 pH를 확인하십시오. 1 M 염산을 사용하여 pH 7에서 8 사이로 조정합니다.TMT 시약 5 µL를 추가하고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 샘플들을 혼합하고 동일한 부피의 lysis 샘플 버퍼를 추가하여 5분간 가열합니다. 이후 precast 12% polyacrylamide 젤에서 분리합니다. 필터링된 물로 젤을 3회 세척한 후 Coomassie Blue로 1시간 동안 염색하고, 단백질 밴드 농도에 따라 물에서 하룻밤 동안 탈색합니다. 젤 레인당 12개의 분획으로 나눕니다. 각 분획을 1 mm 크기로 절단하여 1.5 mL 튜브에 넣습니다.0.1 M 암모늄 바이카보네이트와 50% 아세토나이트릴 혼합액에 겔 조각들을 완전히 담급니다. 그다음 100% 아세토나이트릴로 조각들을 15분 동안 덮어줍니다. 액체를 제거하고 speed vac을 사용하여 조각들을 건조시킵니다.다음으로, 동일한 부피의 tripsin 용액을 첨가하고 얼음에 두어 재수화시킵니다. 그 다음, trypsin 소화를 위해 37 °C에서 12~16시간 동안 배양합니다. 이어서, 배양된 샘플에서 액체 단백질 추출물을 제거합니다.5% formic acid와 50% acetonitrile로 겔 조각을 덮어 반응을 중단시키고 남은 단백질 소화물을 제거합니다. 그다음 실온에서 20분 동안 겔 조각을 흔들어줍니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 추출한 후 상층액을 단백질 샘플 추출 튜브로 옮깁니다.0.5 milliliter 튜브에 담긴 시료를 speed vac으로 건조합니다. 각 단백질 밴드의 강도에 비례하는 농도로 TBS 내에 anti TMT resin 50% 슬러리를 준비합니다. resin을 1배 TBS 1컬럼 부피로 3회 세척한 후, 각 시료에 200 microliters의 TBS를 첨가합니다.그런 다음 anti-TMT 수지로 옮겨 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 4°C에서 하룻밤 동안 쉐이킹(rocking)합니다. 각 샘플을 컬럼에 로딩합니다. 200 µL씩 컬럼 세척을 수행합니다.그 다음, 각 샘플을 200 µL의 50% 용출 완충액으로 3회 용출하고 진공 상태에서 건조합니다. 샘플을 0.1% formic acid가 포함된 3% acetonitrile 12 µL에 현탁시킨 후, 5 µL를 HPLC 컬럼에 직접 주입합니다. 첨부된 텍스트에 상세히 기술된 바와 같이, acetonitrile 농도를 높이는 구배(gradient)를 사용하여 펩타이드를 용출합니다.top two by three 워크플로우에서 질량 분석법을 사용하여 펩타이드를 검출하십시오. 단일 단계 ms로 시작합니다. 그런 다음 고에너지 C trapped dissociation 단편화를 통해 3개의 Ms.Ms 스펙트럼을 획득하고 이어서 3개를 수행합니다.단백질 식별을 위해 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)를 이용한 Ms.MS를 수행합니다. 분기형 워크플로우를 사용하여 질량 분석 데이터를 분석합니다. 비율을 정량화하기 위해 리포터 철 정량기(reporter iron quantizer)를 구현합니다.또한 MSM MS 스펙트럼을 스펙트럼 선택기(spectrum selector), 스펙트럼 정규화기(spectrum normalizer) 및 스펙트럼 그룹화기(spectrum grouper) 노드를 통해 처리하고 seaquest 검색 엔진을 통해 데이터를 쿼리하십시오. 이 이미지는 DAB로 염색한 후, 왼쪽의 대조군 토마토 식물 잎과 오른쪽의 pseudomonas를 접종한 잎의 예를 보여줍니다. DES 염색 과정은 조직 화학적 염색을 통해 잎 조직 내의 활성 산소종의 징후를 나타낼 수 있게 합니다.예상대로 대조군은 유의미한 염색을 보이지 않는 반면, pseudomonas를 처리한 잎은 과산화수소 생성에 대해 양성으로 염색됩니다. 이 예시는 단백질체 발견 데이터 출력을 보여주며, 각 샘플에 대해 차등적으로 산화환원 조절된 단백질의 피크 면적을 통해 절대 정량이 가능함을 보여줍니다. 대조군과 접종군 샘플 간의 피크 면적은 상대적인 양을 나타냅니다.여기서 대조군과 접종 샘플 간의 단백질 산화환원 조절은 유사하게 나타납니다. 비슷한 강도의 피크는 처리 변화에 의해 조절되지 않는 이황화 결합의 존재를 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 일주일 이내에 적절하게 수행할 수 있습니다.샘플을 차갑게 유지하고 라벨을 체계적으로 정리하십시오. 또한, 페놀을 사용할 때는 실험용 장갑을 착용하고 후드 내에서 본 절차에 따라 작업하는 등의 예방 조치를 취하십시오. 오닉산(onic acid) 및 글루타티온 시뮬레이션과 같은 다른 시스템 변형을 결정하기 위해 번역 후 변형에 대한 특정 질량 분석법과 같은 추가 측정법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 DIB 스탠딩 CTMD 활성화 및 redox 16 퀄리피케이션을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

단백질 추출, 정량화, 강수량, 소화, 라벨링, 프로테오믹스 시설에 대한 제출, 데이터 분석 등 각 단계에 대한 자세한 정보를 포함하는 최적화된 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링 프로토콜을 제시합니다.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS)에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다.

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

학습하세요 동위원소 태그 질량 분광법을 사용하여 토마토 식물의 티올 산화환원 프로테옴을 프로파일링하는 방법을 배우세요. Pseudomonas syringae 감염에 따른 산화환원 조절 단백질 변화를 분석하여 식물 스트레스 반응 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

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