리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

이 동영상은 원형질막에서 단백질의 활성을 조작하기 위해 UV 광선을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이를 위해 세포는 membrane anchored FRB 단백질과 관심 있는 FK BP 융합 단백질로 cot transfection됩니다. 사진 케이지 라파마이신 유도체가 매체에 추가됩니다.

그런 다음 살아있는 세포 이미징 중에 UV 광선이 세포의 특정 영역에 가해집니다. 라파마이신(rapamycin)과 비오틴(biotin) 사이의 링커(linker)는 절단되어 화학적 이량체를 방출하고 그 부산물인 방출된 이량체는 세포로 확산되어 FKBP 표지 관심 단백질과 조사된 영역에 고정된 FRB인 원형질막 사이의 이합체화를 유도합니다. 자외선이 없으면 FKBP와 FRB가 연결되지 않으므로 효과가 없습니다.

데이터 분석은 생리학적 효과에 따라 관심 있는 FKBP 융합 단백질의 고도로 국소적인 동원을 보여줍니다. 약리학 및 유전학 접근법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 장점은 작용 속도, 표적 특이성 및 공간 해상도의 조합입니다. 이 기술의 의미는 암세포에 의한 이동의 결과인 전이성 암 치료로 확장됩니다.

그러므로, 주요 이동 인자의 활성을 조작하면 정확한 분자 메커니즘을 밝힐 수 있으며, 이는 치료 및 치료의 전제 조건입니다. 시연자는 대학원생인 크리스 폴 마이어(Chris Paul Meyer)와 제 연구실의 기술자인 밥 드 로즈(Bob de Rose)입니다. 멸균 마이크로 원심분리기 튜브, 플라스미드, DNA, 멤브레인 테더링된 FRB, 형광 태그가 지정된 FKBP, TIA 1 및 탈이온수에 1마이크로리터의 몇 가지 유전자 HD를 혼합물과 와류에 결합하여 이 프로토콜을 시작합니다.

튜브를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 유리 8 우물 챔버 측면의 각 우물에 50 마이크로 리터의 폴리 드 리신을 추가하고 1 분 동안 배양하여 표면을 코팅 한 다음 용액을 흡인하고 각 우물의 중심을 50의 탈 이온수로 세척합니다. 다음 트립신은 80-85%confluent NIH 3 T 3 세포입니다.

세포가 분리된 후 10%FBS가 포함된 DMEM 10ml를 첨가하면 375마이크로리터의 현탁액을 15ml 멸균 튜브에 넣고 1, 500G에서 3분 동안 원심분리합니다. 스핀을 따라 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 750마이크로리터의 DMEM에 10%FVS 및 Resus를 첨가합니다.

여러 번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 매달아 놓습니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 형질주입 용액에 첨가하고 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 저어주며, 챔버의 각 웰에 250마이크로리터의 세포 형질주입 현탁액을 첨가합니다. 밀어서 배양하십시오.

섭씨 37도에서 15-18시간 동안. 케이지 rapamycin, 비오틴 부가물을 합성합니다. 먼저 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브의 멸균 fuge 튜브에 DMSO의 CRB 1밀리몰 스톡 용액을 준비하고 250마이크로리터의 PBS에 1mg의 아바돈을 용해시킵니다.

다음으로 케이지 부분을 rapamycin에 활용합니다. 0.5 μl의 CRB 원액을 용존 AVID에 여러 번 반전하여 혼합 한 다음 15 분 동안 실온에서 배양하십시오. 결합체 용액에서 CRB AVID를 생성하고, 결합되지 않은 소분자를 배제하고 CRBA를 정제하기 위해, G 25 크기 배제 컬럼을 300마이크로리터의 PBS로 평형화합니다.

열이 평형을 이룬 후 5번 반복합니다. 125마이크로리터의 CRBA 용액을 컬럼의 중앙 베드에 로드합니다. 그런 다음 800G에서 2분 동안 용액을 스핀다운하고 실온에서 세포를 형질 주입한 후 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 흐름을 수집합니다.

배지를 FBS가 없는 DMEM으로 교환하여 혈청을 굶주리게 하고 세포를 12시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지를 부드럽게 흡인하고 준비된 1 마이크로 몰 CRBA 용액 250 마이크로 리터를 첨가한다. 살아 있는 세포의 단백질 역학을 시각화하기 위해 UV 조명이 있는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 365나노미터의 UV LED 광을 위한 광학 장치를 결합하십시오.

에피 형광 조명으로. UV 광선에 의해 여기된 형광 염료로 코팅된 유리판을 사용하여 조명 스폿의 좌표와 크기를 정의합니다. 이를 통해 조사할 영역을 미세 조정할 수 있습니다.

세포와 함께 챔버 슬라이드를 100 x 대물렌즈와 에피 형광을 사용하여 스테이지에 놓습니다. 세포에 초점을 맞추고 세포를 찾습니다. 이미징의 경우, 생리학적 효과의 배경 수준을 결정한 후 세포 이미징을 시작합니다.

여기서, 멤브레인 주름 장식은 세포의 선택된 한 사분면에서 자외선을 조사하고, 케이지되지 않은 상태로 용해되어 DMSO에서 원래 라파마이신을 분해 한 다음 PBS에서 400 나노 몰의 최종 농도로 측정합니다. 100마이크로리터의 용액을 이미징 챔버에 추가하여 전체적인 효과를 유도합니다. 20분 동안 15초마다 형광 이미지를 캡처하여 RAC의 국소 활성화가 국소 주름 형성을 유도할 수 있는지 여부를 확인합니다.

NIH 3 T 3 세포는 YFP 표지 RAC 활성제 FK bp, TIA 1 및 고정된 막인 LDR로 형질주입되었습니다. 노란색 원으로 표시된 세포의 가장자리에서 FRB의 국소 방사선 조사는 1063초부터 1초 동안 수은 램프로 전체 조명을 수행했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 처음에는 멤브레인 주름이 거의 없었습니다.

그러나, 국부적 조명에 이어 전체 조명과 라파마이신의 첨가 후 공간적으로 제한된 러플링이 관찰되었으며, 이는 FK bp TIA one을 원형질막으로 전좌시킵니다. 세포는 전체적으로 주름 형성을 보였는데, 이는 이전에 관찰된 국소 주름 형성이 랙의 공간적으로 제한된 활성화에 의해 발생했음을 나타냅니다. 정량적 분석을 위해 표적 세포를 4개의 사분면으로 나누고 이 그래프에서 볼 수 있듯이 국소 자극 및 전체 자극에 따른 각 사분면의 주름 형성 빈도를 결정했습니다.

관찰된 세포 중 어느 것도 자외선 또는 국소 자외선 없이 CRBA와 함께 주름 형성을 보여주지 않았으며, 이는 벌크 배지에서 Aden이 있거나 없는 방사선입니다. 그러나 CRBA를 추가하고 자외선 조사를 수행했을 때 러플 형성은 거의 동일하게 보였으며, 1 사분면에만 조사되었을 때 전체 방사선으로 모든 사분면에서 약 90 %였으며, 러플 형성 빈도는 100 %였으며 2 사분면에서 4 사분면에서는 30 % 25 % 및 30 %였습니다. 이러한 결과는 라파마이신의 국소화된 언케이징이 단일 세포에서 고도로 국소화된 생리학적 효과를 유도하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다.

이 경우 랙 활성화로 인한 멤브레인 러플링이 발생합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 빛에 의한 작은 g TPA 활동의 공간적 제어를 달성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 원형질막으로 전위되는 특정 단백질에 의존하는 모든 생리학적 과정에 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 각 절차에 대해 용액, 시약 및 세포를 새로 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 자외선 안경과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.