Name: 유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: 학습하세요 DNA 가족 셔플링을 이용한 합성 AAV 캡시드 라이브러리 생성 및 진화 방법을. 이 기술은 유전자 치료용 맞춤형 벡터 개발에 필수적인 도구입니다.

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저자들은 기꺼이 그 하이 델베르크 대학에서 우수 CellNetworks의 클러스터에서뿐만 아니라 애인과 하인즈 Schaller (CHS) 재단이 뛰어난 자신의 실험실 지원, 팀 구성원 및 작품을 인정합니다. 유전자 가족 걸어갔다 3 년 전 우리의 첫 출간 이후 매우 활동적인 분야가되므로 작업으로 인해 공간상의 제약으로 여기서 따온 수없는 관련 서적의 모든 저자에게 사과했다 통해 우리는 그 분자 AAV 진화에 감사드립니다.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

모든 저자들은 공개할 게 없다는 것을 선언합니다.

여기서는 유전자 가족 걸어갔다 통해 그리고 세포 또는 동물의 진화에 필수적인 실험 단계와 AAV capsid 엔지니어링에 대한 지침을 마련했습니다. 본질적으로 이러한 프로토콜은 우리가 처음 2008 3 AAV 필드 내에 신고 절차의 표준 버전입니다. 다른 사람이 연구 후속의 한바탕 소동은 다양한 수법의 예를 들면, 10-13를보고했지만, 우리의 현재 버전 업 - 스케일링 및 기타 요구에 적응 의무하면서 재현성 결과를하였으며 기본적인 전략을 나타냅니다. 전체 절차를 표준화하기위한 노력에도 불구하고, 몇몇 단계는 아직도 재판 - 및 - 오류 기반 접근 방법을 필요로합니다. 이것은 특히 DNase 나 같은 배양 시간 등의 반응 조건, (그림 예제를 참조하십시오. 3)에 매우 민감했다는 사실로 인해 캡 유전자 조각에 적용됩니다. 우리의 범위에서 시작하는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polyethylenimine (PEI) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 408,727 </td></tr><tr><td> 제한 효소 </td><td> 코 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> T4의 DNA Ligase </td><td> 코 </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> 젤 추출 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,704 </td></tr><tr><td> Phusion II의 효소 키트 </td><td> Finnzymes (코) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar 고음질의 효소 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 202,602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (코) </td><td> F-540S (키트의 일부) </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (25 ㎜) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (키트의 일부) </td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> 로스 </td><td> 4855.2 </td></tr><tr><td> Ampicilin 나트륨 염 </td><td> 로스 </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTPs (10 밀리미터, 100 μl) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanol (OptiPrep) </td><td> 축 - 방패 </td><td> 1,114,739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td> 머크 </td><td> 107,241 </td></tr><tr><td> 플라스미드 메가 간이 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 12,181 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> 빠른 인감 원심 분리기 튜브 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 342,414 </td></tr><tr><td> Electroporation 단위 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> 열전달 자전거 타는 사람 </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo 보호 </td></tr><tr><td> 가열 블록 </td><td> BIOER </td><td> 메가바이트-102 </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACS 분석기 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B T1R 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> 머크 </td><td> 101,695 </td></tr><tr><td> 아데노 바이러스-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> 플라스미드 pBlueScript II KS (+) </td><td> Stratagene </td><td> 212,207 </td></tr><tr><td> cap5F (굵게 표시된 노란색, cap5 특정 시퀀스에서 PAC 제가 사이트) : GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> 사용자 정의 프라이머 </td></tr><tr><td> cap5R (녹색, 굵게 cap5 특정 시퀀스에서 ASC 제가 사이트) : GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> 사용자 정의 프라이머 </td></tr></tbody></table>

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 adeno-관련 바이러스의 진화 (aav) 유전자 치료 벡터

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터 인해 유익한 특성 1의 독특한 조합으로 치료 인간의 유전자 전달을위한 가장 강력하고 유망한 차량의 일부를 나타냅니다. 이들은 기본 wildtype 바이러스와 높은 titer, 고순도 및 임상 수준의 재조합 벡터 2의 생산을위한 고도의 방법론의 apathogenicity을 포함합니다. 다른 바이러스여 AAV 시스템의 더욱 특별한 장점은 자연스럽게 모두 쉽게 일반적인 프로토콜 1,2을 사용하여 벡터로 설계하실 수 있습니다 아직 필수 속성에 차이가 serotypes을 발생 풍부한의 가용성이다. 또한, 우리 자신을 포함한 그룹의 숫자가 최근 중 여러 입력 serotypes의 자산, 또는 어떤 분리 하나의 속성을 강화를 결합하여 합성 벡터의 생성을위한 템플릿으로 이러한 자연적인 바이러스를 사용하는 전략을 고안했습니다. 각각의 기술은 이러한 목표에게 AR를 달성하기전자 하나의 DNA 가족 걸어갔다 3 부분 homologies (일반적으로 대부분의 AAV의 serotypes을위한&gt; 80 %), 또는 4,5 펩타이드 디스플레이, 보통 일곱 아미노산, 즉 삽입로를 기반으로 자신을 다시 조립 뒤에는 다양한 AAV capsid 유전자의 예 조각화 원하는 세포 유형에 펩타이드가 이상적으로 mediates을 다시 타겟팅 바이러스 capsid의 노출 루프. 최대 성공을위한 두 가지 방법은 프로토콜 백만 번째를 둘러싸고 뚜렷한 capsid 변종의 라이브러리를 양보하도록 상향 조정됩니다 의하여 높은 처리량 방식으로 적용됩니다. 각 클론 그 후 수많은 부모 바이러스의 고유한 조합 (유전자 걸어갔다 접근 방식)으로 구성하거나 동일한 바이러스 백본 (펩타이드 디스플레이 방식) 내에서 독특한 펩타이드를 포함합니다. 이후 마지막 단계는 대부분 또는 선택 과정에 이상적으로 모든 요구 사항을 충족 개별 capsids에 대해 풍부하게하기 위해서는 대상 세포에 이러한 라이브러리의 선택을 반복합니다. 선호 빗 후기같은 반 AAV 항체와 반응 모든 capsids의 인스턴스 제거에 대한 부정적인 선택과 관심이 특정 세포 종류,,에 성장 등 아이 네스 긍정적인 압력. 이 조합은 선택을 이겨낸 합성 capsids은 아마 모든 자연적으로 발생하는 AAV 고립에서 발견되지 않았 방식으로 주어진 어플 리케이션의 요구와 일치하는 확률이 높아집니다. 여기서는 이론적으로 두 개의 기술을 실험적으로 많은 도전과 같은 DNA의 가족 걸어갔다 방법에 초점을 맞춥니다. 우리는 설명하고 보여주 단행 AAV 라이브러리 생성 및 선택 (그림 1)에 대한 모든 필수 단계를, 다음 하나는 이에 분자 AAV의 진화와 함께 성공하기 위해 알아야 할 것이 프로토콜의 함정과 중요한 측면을 논의합니다.

우리는 molecularly 유전자 가족 걸어갔다 통해 합성 Adeno-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료 벡터를 엔지니어이며 진화하는 기본적인 기법을 보여줍니다. 더욱이, 우리는 선택과 문화 혹은 생쥐의 표적 세포에 대한 향상된 특성을 가진 각각의 키메라 capsids의 분석을위한 일반 지침 및 대표 예제를 제공합니다.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 독특한... 특성 덕분에 인간의 치료적 유전자 전달을 위한 가장 강력하고 유망한 매개체 중 일부를 나타냅니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 원하는 특성을 가진 입자를 선택할 수 있도록 매우 다양한 합성 아데노 부속 바이러스(aav) 캡시드 라이브러리를 구축하는 것입니다. 이는 먼저 제어된 DNAse I 소화를 통해 복제된 aav 캡시드 유전자를 단편화함으로써, 이후 두 번의 PCR 반응을 통해 이들이 키메라 서열로 재조립될 수 있도록 유도하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 생성된 PCR 산물을 다시 복제 가능 aav 컨스트럭트에 클로닝하여 최소 100만 개의 서로 다른 aav 캡시드 유전자로 구성된 플라스미드 라이브러리를 제작합니다.다음으로, 이 플라스미드 라이브러리를 2 9 3 T 세포에 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드와 함께 트랜스펙션하여, 이후 표적 세포나 동물에서 선택 가능한 키메라 바이러스 라이브러리를 생성합니다. 결과는 배양 세포 또는 성체 마우스에서 강화되거나 더 특이적인 리포터 유전자 발현을 기반으로, 새로운 합성 A A V 벡터의 성공적인 분자 공학 및 진화를 보여줍니다. 펩타이드 디스플레이와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, DNA 패밀리 셔플링을 통해 세포 결합 및 세포 내 이동부터 탈외피 및 핵 내 유전자 발현에 이르기까지 AV 캡시드의 여러 특성을 동시에 변경하고 개선할 수 있는 잠재력이 있다는 점입니다.이 방법은 특정 치료 응용 분야에 적합한 이상적인 벡터를 얻는 방법이나, 특정 특성을 결정하는 바이러스 캡시드의 도메인을 분석하는 방법과 같이 유전자 치료 및 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 방법은 HIV를 위한 T-세포나 간염 바이러스를 위한 간세포와 같이 바이러스 표적 세포를 특이적이고 강력하게 감염시키는 AV 벡터의 분자 진화를 가능하게 하므로, 바이러스성 병원체 감염을 포함한 다양한 인간 질환의 치료로 그 영향력이 확대됩니다. 또한, 이 방법은 AV 생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있으며 유전자 치료를 위한 AV 벡터를 개선하는 데 사용될 수 있습니다.이 방법은 형광 단백질, 세 가지 리포터, 세포 효소 또는 RNA 간섭에 관여하는 단백질과 같이 기초 또는 응용 과학적으로 중요한 다른 유전자 가족에도 쉽게 적용될 수 있습니다. 저희는 성체 마우스의 조직 조각에 치료 유전자를 전달하기 위한 적절한 벡터를 찾는 과정에서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 자연적으로 발생하는 모든 AV 혈청형이 인간 집단에서의 높은 보급률로 인한 높은 면역

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt;1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

AAV 펩타이드 디스플레이 라이브러리 생성 및 차세대 AAV 생성을 위한 새로운 특성을 가진 후보 물질의 바코딩을 통한 후속 검증.

아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 변이체의 엔지니어링, 바코드 및 스크리닝을 통한 차세대 유전자 치료 벡터의 분리

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.

Unpurified Recombinant Adeno-associated Viral Vectors를 사용한 배양 세포에서의 전이유전자 발현

아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.

In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

이 프로토콜은 유전자 치료를 위한 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포 생체 모방제를 생산 및 정제하는 방법을 도입하는 것을 목표로 합니다. 나노소포는 MSC 유래 지질 이중층으로 제한되어 있으며, 관심 유전자를 가진 재조합 AAV를 내강에 캡슐화합니다. 이 나노소포는 생체 내 유전자 전달을 위한 향상된 벡터를 제공합니다.

유전자 전달 증진을 위한 간엽 줄기세포 막 감싸 나노소포 개발

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

학습하세요 DNA 가족 셔플링을 이용한 합성 AAV 캡시드 라이브러리 생성 및 진화 방법을. 이 기술은 유전자 치료용 맞춤형 벡터 개발에 필수적인 도구입니다.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

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