Culturing 및 벽면 선박 생물 반응기를 회전의 응용은 3D 상피 세포 모델을 유래

이 비전형적인 프로토콜은 인간 상피 세포를 인체 내 생체 조직을 재현하는 기관 유사 3D 모델로 배양할 수 있는 쉽고 견고한 시스템을 제시합니다. 먼저, 상피 세포를 조직 배양 플라스크에서 단층으로 합쳐질 때까지 배양하여 수확한 다음, STLV 생물 반응기 내의 마이크로 캐리어 비드와 결합합니다. 플랫폼 위에서 STLV를 회전시켜 낮은 유체 전단력이 발생하는 지속적인 자유 낙하 환경을 조성하면, 세포가 비드에 부착 및 성장하여 96시간 후 및 그 이후 약 매일 세포 응집체를 형성하게 됩니다.

응집체 형성 후, 세포 대사를 충족시키기 위해 SDLV의 배지를 보충하십시오. 응집체 형성과 세포 분화가 완전히 이루어지면, 발달 과정을 모니터링하기 위해 매주 광학 현미경으로 샘플 이미지를 촬영하십시오. 이후 후속 실험 분석 및 어세이를 위해 응집체를 분주하십시오. 궁극적으로, 이 시스템은 다양한 과학적 연구를 위한 생체 내 유사 장기형 모델 시스템을 생성할 수 있습니다.

기존의 일반적인 세포 배양과 같은 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 상피 세포가 조직과 유사한 응집체로 분화 및 극성화를 이루어, 형태학적 및 기능적으로 실제 인체 조직과 유사하게 행동한다는 점입니다. 이러한 3D 모델 시스템은 상피 세포 생물학, 숙주-병원체 상호작용, 그리고 시스템에 도입될 수 있는 다양한 세포 유형 간의 복잡한 상호작용에 대한 추가적인 통찰을 제공합니다. Dr.Andrea Radkey.

저희 실험실의 박사후 연구원이 저속 회전 측면 혈관 바이오리액터를 독성 제거하는 절차를 시연하겠습니다. 열려 있는 포트를 루어 캡으로 덮습니다. STLV를 95% ethanol로 채우고 24시간 동안 평형 상태를 유지합니다.

에탄올을 제거한 후, 멸균된 증류수를 채우고 공급업체에서 제공한 도구를 사용하여 24시간 동안 배양하십시오. 모든 나사를 풀고 STLV에서 중앙 플러그를 제거하십시오. 이를 멸균 파우치에 넣고 110 °C에서 20분 동안 오토클레이브 처리하십시오. STLV를 다시 조립하고 멸균 상태를 보장하기 위해 독성 제거 과정을 반복하십시오.

다음으로, STLV의 나사를 조입니다. 미리 멸균된 일방향 스톱콕을 각 포트에 연결합니다. 이제 10 mL 및 5 mL 루어락 주사기에서 플런저를 제거하고, 플런저를 포장지 안에 보관합니다.

멸균 상태를 유지하기 위해 주사기를 스톱 콕(stop stopcock)에 나사식으로 결합합니다. STLV가 가득 차고 5 milliliter 주사기에 액체가 들어가기 시작할 때까지 10 milliliter 주사기에 DPBS를 첨가합니다. 그런 다음 각 주사기에 멸균 플런저를 다시 끼우고, 주사기의 플런저를 교대로 밀어 바이오리액터 내의 잔류 기포를 제거합니다.

스톱콕을 닫고 STLV를 회전식 수직 플랫폼에 부착합니다. 50 milliliter 원추형 튜브에서 누출 여부를 모니터링하기 위해 최소 24시간 동안 회전시킵니다. 250 milligrams cyto dex microcar beads에 15 milliliters DPBS를 첨가하고 냉각 후 오토클레이브합니다.

상피 세포용 배양 배지를 사용하여 DPBS 세척액을 세 번 제거합니다. 튜브를 소용돌이치듯 흔들어 비드를 재부유시킵니다. 그런 다음 15 milliliters의 배양 배지에 비드를 재부유시킵니다.

먼저 10^7개의 상피세포를 조직 배양 플라스크에서 단층으로 배양합니다. 세포를 수확하여 수를 측정하고, 트라이판 블루 배제 염색법으로 세포 생존율을 결정합니다. 그런 다음, 세포를 준비된 비드에 첨가합니다.

모든 세포가 옮겨졌는지 확인하기 위해 원심분리관(conical tube)을 헹굽니다. 다음으로, STLV에서 DPBS와 주사기를 제거합니다. 또한, 10 mL serological pipette을 사용하여 중앙 포트의 플러그를 제거합니다.

상피세포 비드 현탁액을 STLV에 로딩합니다. 모든 세포와 비드가 옮겨지도록 원추형 튜브를 한 번 헹굽니다. 그런 다음 중앙 포트 플러그를 다시 끼웁니다.

다음으로, 5 mL 및 10 mL 주사기에서 플런저를 제거하고 래퍼(wrapper) 안에 보관하십시오. 멸균 상태를 유지하기 위해 개방형 스톱콕이 있는 주사기 인치 포트를 조이십시오. STLV를 배지로 채우십시오.

플런저를 교체하고 스탑콕을 닫습니다. 이제 새로 접종한 STLV 배양액을 37 °C 인큐베이터에서 회전 없이 30분 동안 평형화합니다. 인큐베이터에서 STLV를 꺼낸 후, 스탑콕을 엽니다.

플런저를 사용하여 기포를 모두 제거하고 스톱콕을 닫습니다. 그런 다음 인큐베이터 내에서 STLV를 20 RPM으로 연속 회전하도록 설정합니다. 96~120시간 후, 시린지를 제거하고 STLV의 양쪽 스톱콕을 열어 비드와 세포가 가라앉게 한 뒤 배지를 교체합니다.

세포가 안착되면, 주사기를 사용하여 측면 포트를 통해 배지의 약 75%를 따라내어 피딩 프로토콜을 수행합니다. 이후 세포 대사에 따라 필요에 맞춰 배지를 계속 보충하십시오. 또한 5~7일마다 응집체의 성장과 생존력을 모니터링하십시오.

응집체의 전단 파괴를 방지하기 위해, 끝에서 약 2cm 지점을 자르고 멸균한 1000 µL 피펫 팁을 사용하십시오. 중앙 포트에서 응집체 200 µL를 조심스럽게 제거하여 두 개의 1.5 mL 튜브에 나누어 담습니다. 분주한 시료 중 하나는 세포 생존율 모니터링에 사용합니다. 비드에서 세포를 분리한 후, trypan blue 배제법으로 생존율을 평가하십시오.

세포 응집체 이미징을 위한 염색 단계입니다. 두 번째 1.5 mL 응집체 분주액에 0.5~1 mL의 배지를 추가하고, 끝을 자른 1000 µL 피펫 팁을 사용하여 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 응집체를 이미징합니다.

일부 상피세포 모델의 경우 도립 광학 현미경을 사용하며, 응집체를 수확하기 약 일주일 전에 배양 통기성을 높이기 위해 응집체를 일회용 용기로 옮겨야 합니다. 분석을 위해 STLV에서 시린지를 제거하고 측면 포트를 통해 배지의 약 50%를 따라냅니다. 중앙 플러그를 제거하고 중앙 포트를 통해 모든 내용물을 50 milliliter 원심 분리 튜브에 조심스럽게 붓습니다.

STLV를 5 mL의 배지로 두 번 헹구고, 헹굼액을 수확한 응집체와 합칩니다. 다음으로, 50 mL 원추형 튜브에서 Harv로 응집체를 옮깁니다. 일주일 후, 잠재적 분석 형식, 분석 및 분석을 위해 응집체를 조심스럽게 수확하며, 분화된 인간 상피 응집체는 STLV 바이오리액터 시스템에서 배양되었습니다.

SEM 및 TEM 이미지는 STLV에서 39일 동안 배양한 인간 질 세포로부터 수집되었습니다. 3D 응집체가 조직과 유사한 초미세 구조적 특징인 미세 능선, 함입, 세포 내 분비 소포 및 정단 표면의 미세융모를 나타내는지 확인하십시오. 3D 질 세포의 공초점 면역형광 현미경 이미지는 뮤신과 상피 세포 및 최종 분화 특이적 마커의 발현을 나타냅니다. 이러한 생리학적으로 관련 있는 표현형은 화합물의 독성을 평가하기 위한 우수한 플랫폼 역할도 합니다.

세포 생존율, 대사 또는 증식을 측정하는 데 흔히 사용되는 MTT 분석법은 다양한 화학 물질 및 화합물에 대한 독성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또는, 트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 통해 시험 화합물 처리 후의 독성을 측정할 수 있습니다. 본 예시에서는 NONOXINOL nine 처리 후, 질 응집체가 자궁경부 X 외식편 모델과 유사한 독성 반응을 보였으나, 단층 배양 모델과는 다른 양상을 나타냈습니다.

3D 응집체는 기능적으로 반응하며, 예를 들어 toll-like 수용체에 의해 인식되는 미생물 유래 분자로 자극을 주었을 때 반응을 보입니다. 이 응집체들은 반응하여 IL six 단백질을 포함한 염증성 사이토카인을 분비하고 progesterone receptor의 전사 발현을 나타냅니다. 호르몬 자극에 반응하는 수용체 또한 질 세포에서 관찰될 수 있습니다.

3D 응집체는 병원체 및 호르몬 분자에 반응하는 능력을 갖추고 있을 뿐만 아니라, 단순포진바이러스 2형(herpes simplex virus Type two) 감염을 기능적으로 지원할 수 있습니다. HSV 2형에 감염된 3D 질 응집체의 공초점 현미경 이미지는 감염 상태를 보여줍니다. 응집체 내 개별 세포의 물리적 및 기능적 특성 또한 유세포 분석으로 정량화할 수 있으며, 예를 들어 개별 질 세포의 muc1 표면 발현을 측정하기 위해 유세포 분석법을 사용할 수 있습니다.

3D 질 vaginal aggregate는 배양 후 단층 배양(monolayer)에 비해 표면의 mucin 1 발현 비율이 더 낮게 나타났습니다. 이 기술을 통해 조직 생물학 및 감염 질환 분야의 연구자들은 구조적 특성과 자극에 대한 생리학적 반응을 연구할 수 있게 되었습니다. 이러한 장기 유사 모델(organotypic models)을 사용함으로써 인간의 생물학적 특성을 더 정확하게 모사할 수 있습니다.