조합의 합성과 고분자 필름과 Nanoparticle 도서관에서 높은 처리량 단백질 출시

이 동영상은 생분해성 폴리 무수물 필름 및 나노 입자 라이브러리의 조합 합성과 이러한 라이브러리에서 단백질 방출의 고처리량 검출에 대해 설명합니다. 첫째, 고처리량 자동 증착 장치는 조성적으로 다양한 단량체 어레이를 유리 큐벳에 증착하는 데 사용됩니다. 폴리 응축 반응은 섭씨 180도 및 0.3 tor에서 1.5 시간 동안 수행됩니다.

이러한 반응 조건은 C-P-H-S-A 폴리 무수물 고분자 합성에 특이적입니다. 자동 증착 장치를 사용하여 캡슐화를 위한 용매 및 모든 구성 요소가 폴리머 라이브러리를 포함하는 큐벳에 증착됩니다. 폴리머의 완전한 용해와 추가 성분의 균일 한 분산을 보장하기 위해 초음파 처리를 시행 할 수 있습니다.

그런 다음 용해된 폴리머를 무용매 튜브로 옮겨 나노 침전에 의해 나노 입자 라이브러리를 제조합니다. 나노 입자는 진공 건조 또는 여과에 의해 회수된 다음 변형된 96 웰 릴리스 플레이트로 전달됩니다. 마지막으로, 단백질 적재 라이브러리는 생리학적 조건에서 배양되고 단백질 방출 역학은 형광 공간 검출 방법을 사용하여 평가됩니다.

궁극적으로, 단백질 방출 역학을 고분자 특성 또는 방출 환경 조건의 함수로 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 한 번에 하나의 샘플을 사용하는 기존의 다른 기술에 비해 이 접근 방식의 주요 장점은 여러 샘플을 동시에 합성할 수 있다는 것입니다. 그런 다음 이러한 샘플은 단백질 고분자 세포 고분자 또는 숙주 고분자 상호 작용에 대해 높은 처리량으로 스크리닝할 수 있습니다.

이를 통해 약물 전달 및 조직 공학을 위한 이러한 생체 재료의 합리적인 설계 및 개발을 촉진할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 수술 후 연구원인 La Tricia Peterson이 될 것입니다. 비디오의 이 섹션에서는 하얏트 스루풋 증착 장치를 사용하여 폴리머 합성 후 조성 변형 단량체 라이브러리를 증착합니다.

이 장치는 블랭크 또는 단백질 로딩 고분자 필름 또는 나노 입자의 조합 라이브러리를 제작하는 데 사용됩니다. 자동화 플랫폼은 2개의 프로그래밍 가능한 주사기 펌프와 3개의 선형 액추에이터로 구성되며, 컴퓨터의 컴퓨터에 직렬로 연결됩니다. LabVIEW 소프트웨어는 주사기 펌프 및 액추에이터에 명령을 전달하는 데 사용됩니다.

10cc 가스트 타이트 주사기는 루어 잠금 피팅을 통해 연결된 금속 모세관 튜브가 있는 주사기 펌프에 적재되어 폴리머 용액을 유리 큐벳에 분배합니다. 이 시연에서는 seic acid 또는 SA를 하나의 six Biss para oxy heane 또는 CPH와 함께 사용하여 Texas Red Boan 혈청 알부민을 캡슐화하는 나노 입자 라이브러리를 만듭니다. 이 비디오의 지침과 함께 제공되는 문서는 다양한 고분자 필름 및 나노 입자 라이브러리를 제작하고 테스트하도록 조정할 수 있습니다.

합성하기 위해 라이브러리는 각 단량체와 클로로포름을 유리 바이알에 밀리리터당 25mg의 최종 농도로 용해시키는 것으로 시작합니다. 다음으로, 주사기의 루어 잠금 끝을 통해 용액을 흡입하여 각 용액을 10cc 가스 밀폐 주사기에 로드합니다. 기포를 제거하십시오.

다음으로, 내용제성 루어 잠금 스테인리스 스틸 모세관 튜브를 주사기 끝에 부착합니다. cl에 모세관을 고정합니다.amps, 링 스탠드에 부착합니다. 그런 다음 두 모세관 튜브의 끝을 시작 베트에 배치합니다.

단량체 증착용. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 주사기를 놓고 lab view 소프트웨어의 제자리에 고정합니다. 리니어 액추에이터를 소프트웨어의 시작 위치로 설정합니다.

SA 및 CPH 단량체를 x, y 및 Z축의 유리 큐벳에 자동 증착을 시작합니다. 액추에이터는 모세관 튜브를 각 Q에 적절하게 배치하고, 각 단량체의 프로그래밍된 부피를 해당 튜브에 주입하여 구성적으로 변형된 단량체 라이브러리를 생성합니다. 단량체 증착 후.

단량체 라이브러리를 예열된 진공 오븐으로 옮기고 섭씨 180도, 0.3 투어에서 1.5시간 동안 배양하여 응축 중합이 가능합니다. 인큐베이션 후, 폴리머 라이브러리의 제작이 완료됩니다. 다음으로 단백질이 적재된 고분자 나노 입자가 생성됩니다.

단백질 로딩 고분자 필름 라이브러리 제작을 위한 동반 프로토콜을 참조하십시오. 단백질 로딩 나노 입자 라이브러리를 제작하기 위한 것입니다. 이 경우 단백질인 Texas red bovine serum albumin을 폴리머 라이브러리를 용해할 수 있는 적절한 용매에 추가합니다. 여기서, 메틸렌 클로라이드는 밀리리터당 2밀리그램의 농도로 사용된다.

10cc 주사기에 용제가 함유된 Texas Red BSA를 채우고 첫 번째 주사기 펌프에 넣습니다. 그런 다음 깨끗하고 비어 있는 2cc 주사기를 두 번째 주사기 펌프에 넣고 15ml의 비용제(이 경우 펜탄)가 들어 있는 튜브를 바이알 플랫폼에 인접한 튜브 홀더에 놓습니다. 다음으로 실험실에서 보기 소프트웨어는 프로그램을 선택하여 자동화된 용매 증착 프로세스를 시작합니다.

프로그램 시작 후, 용매는 폴리머 라이브러리를 포함하는 큐벳에 증착되어 폴리머 농도가 밀리리터당 20밀리그램이 됩니다. 모든 용매가 증착되면 1-5분 동안 폴리머를 용해시킵니다. 이를 통해 완전한 폴리머 용해와 균일한 단백질 분산을 보장하기 위해 선택적인 신디케이션

다음으로, 실험실 보기에서 샘플 이동 프로그램을 시작합니다. 그런 다음 라이브러리에 용해된 각 폴리머 샘플을 빈 주사기로 추출하여 샘플 홀더에 있는 해당 비용매 튜브에 분배합니다. 각 샘플이 전송되면 나노 입자 라이브러리를 10mm 수은 진공의 진공 챔버에 배치하거나 용매가 제거될 때까지 진공 여과를 사용하여 단백질이 로드된 나노 입자를 회수합니다.

캡슐화된 BSA의 방출을 조사하려면 플레이트에 있는 다른 모든 인접 컬럼의 각 웰 벽의 상단 절반 인치를 제거하여 수정된 딥 96 용접 폴리프로필렌 플레이트로 시작합니다. 열 A와 B, C, DENF 및 GNH 사이의 각 웰 상단을 제거하면 최대 부피 전달로 채워질 때 인접한 각 웰 쌍 사이의 액체 흐름이 허용됩니다. 밀리리터당 1000에서 10마이크로그램에 이르는 텍사스 적색 BSA 표준은 깊은 96웰 플레이트에 포함됩니다.

이들은 단백질의 양을 계산하는 데 사용되며 형광 크롬 담금질, PBS 완충액에서 원하는 질량의 나노 입자를 재구성 한 다음 입자를 균일하게 분산시키기 위해 초음파 처리합니다. 다음으로, 나노 입자 라이브러리를 딥 96 웰 플레이트로 옮기고 샘플이 웰 플레이트의 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 다음으로, 피펫터를 사용하여 인접한 모든 웰을 웰 상단에서 최대 1/4인치까지 PBS 버퍼로 천천히 채웁니다.

인접한 우물에는 충분한 완충 장치가 있어야 우물 사이를 자유롭게 흐를 수 있습니다. 그런 다음 이형판을 뚜껑으로 밀봉하고 교반하면서 섭씨 37도에 놓습니다. 증분 시점에서의 실험 기간 동안 9, 400 Typhoon 평판 형광 스캐너를 사용하여 적절한 여기, 레이저 및 방출 필터를 사용하여 플레이트를 스캔합니다.

스캔 후 이미지 퀀트 소프트웨어를 사용하여 각 방출에서 방출된 형광 접합 단백질의 양을 정량화합니다. 음, Texas Red BSA는 고분자 화학의 함수로서 단백질 방출 역학을 결정하기 위해 이 비디오에 설명된 대로 SA 및 CPH 단량체에서 합성된 고분자 나노입자 라이브러리에 캡슐화되었습니다. 단백질이 적재된 나노입자를 섭씨 37도에서 한 달 동안 배양했으며, 이 기간 동안 단백질 방출 정량화를 위해 증분 시점에서 형광 스캔을 얻었습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 이 수력 처리량 방법은 A-C-P-H-S-A 폴리 무수물 나노 입자 라이브러리에서 텍사스 적색 BSA 방출 역학을 측정하는 데 사용되었습니다. 화학 의존적 경향은 Sarich 필름 화학의 방출률 증가와 함께 관찰되었습니다. 표준 단백질 정량 분석 분석을 사용할 때도 유사한 결과를 얻었습니다.

별도의 실험에서, CPT CPH 폴리 무수물 필름 라이브러리의 텍사스 레드 BSA 방출은 여기에 표시된 바와 같이 cpeg가 풍부한 필름이 단백질을 가장 빠르게 방출하면서 관찰된 것과 같이 평가되었으며, 생분해성 약물 전달 장치로서 의료 분야에서 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 이러한 결과는 치료제 또는 백신 항원의 원하는 방출 프로파일이 고분자 화학을 변화시켜 제어될 수 있음을 나타냅니다. 이 절차에 따라 단백질 안정성, 세포 독성, 세포 활성화 및 InVivo 생체 내 분포와 같은 영역을 조사하기 위해 다른 조합 방법이 개발되었습니다.

이러한 측면은 약물 전달 및 조직 공학을 위한 생체 재료의 합리적인 설계에 중요합니다. 이 전체 프로토콜에 걸쳐 적절한 PPE를 착용하고 안전한 실험실 절차를 연습하는 것을 잊지 마십시오.