Name: 체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 배우세요 난소암 다세포 구형체가 중피 단층을 침습하는 능력을 형광 시간 경과 현미경으로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 암 전이 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 하버드 의과 대학에서 니콘 이미징 센터, 특별히 제니퍼 워터스, 라라 Petrak과 웬디의 연어, 훈련과 timelapse의 현미경의 사용을 감사드립니다. 우리는 또한 가치있는 토론을 위해 로자 잉과 Achim Besser 감사드립니다. 이 작품은 NIH 그랜트 5,695,837 (M. Iwanicki까지) 및 JSB에 GM064346에 의해 지원되었다; 박사 미리암과 셀던 G. Adelson 의학 연구 재단 (JSB까지)에서 교부금에 의해.

1. 난소암 세포 회전 타원체 형성 <ol><li> RFP-표현하는 난소암 세포는 10 %베이스 중간 (199과 MCDB105의 50:50 혼합물 10 % inactivated 태아 소 혈청과 1% 펜 strep를 포함하는 사용자 정의 세포 배양 매체)에서 배양해 있습니다. 레이블이 지정되지 않은 난소암 세포에 RFP를 표현하기 위해 플라스미드 포함된 RFP와 세포를 transfect 및 RFP를 표현하는 세포를 위해 선택합니다. 또는 바이러스성 벡터는 transiently 형광 단백질을 표현하는 데 사용할 수있는, 또는 세포에 빨간색 형광 세포 추적기 염료 (Invitrogen)로 사전 품어 될 수 있습니다. </li><li> 이전 난소암의 spheroids의 형성에, 그것은 낮은 접착 96 잘 둥근 바닥 문화 요리를 준비할 필요가 있습니다. , 낮은 접착 배양 접시를 생산하기 위해서 30μl 폴리-HEMA 용액 (1 ML 95% EtOH에서 6mg polyhydroxyethylmethacrylate)는 96 잘 코닝 세포 배양 접시의 각도에 추가됩니다. 96 잘 플레이트는 ° C 비 humidified 인큐베이터는 에탄올, 내가 증발시키는 37에 incubated 있습니다각도에 폴리-HEMA의 영화를 eaving. 이 폴리 - HEMA 영화는 세포 현탁액 18 년 성장 강요, 우물의 바닥에 부착로부터 세포를 방지할 수 있습니다. [또는 초저 첨부 파일 문화 플레이트 (코닝)는 폴리-HEMA 코팅 요리 대신 사용할 수 있습니다.] </li><li> 낮은 접착 배양 접시를 준비 후, 난소암 세포, 펠릿 3 분 동안 900 RCF의 탁상 원심 분리기 (Heraeus)의 세포가 뜨는을 대기음와 10 %의 기본 매체에서 다시 중단 한 접시를 trypsinize. </li><li> hemocytometer를 사용하여 세포를 세어보세요. </li><li> 10 %의 기본 중의 50μl 당 100 세포가있다는 것을 이러한 세포의 농도를 조정합니다. </li><li> 96 잘 폴리 - HEMA 코팅 문화 요리의 각도에 균일하게 정지 희석 세포 현탁액의 50μl를 추가합니다. </li><li> 16시간위한 37 ° C 세포 문화 인큐베이터 (시간이 금액은 그것을 위해 걸리는 시간의 양에 따라 증가하거나 감소해야합니다에서 96 잘 접시를 품어각도에 하나의 다세포 회전 타원체를 형성, 함께 클러스터에 난소암 세포를 허용하도록 다세포 spheroids하거나 원하는 실험 조건)을 형성하는 특정 세포 라인. 일부 종양 세포는이 기간 동안 apoptosis을 받다 수 있으니 사전 apoptosis의 유도에 시간을 선택하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. Mesothelial 세포 단일층 형성 <ol><li> 세포 배양 후드에서 미리 코팅 접시의 각도에 5μg fibronectin / ML PBS 솔루션의 2mL를 추가하고 30 분간 실온에서 잠복기에 의한 fibronectin과 6 잘 유리 바닥 MatTek 요리의 우물. MatTek 요리의 유리 바닥의 광학 품질은 고해상도 현미경 이미징을위한 수 있습니다. </li><li> GFP-표현 mesothelial 세포는 10 %의 기본 매체에서 배양해 있습니다. mesothelial 세포 판을 Trypsinize, 3 분 동안 900RPM에서 탁상 원심 분리기 (Heraeus)에 다운 스핀 뜨는을 대기음, 10 %의 자료 매체에 다시 일시 중지합니다.여기서 사용 mesothelial 세포들이 취득 당시 이미 GFP를 표현했지만 레이블이 지정되지 않은 mesothelial 세포 cDNA 플라스미드 함유 GFP와 transfecting, 또는 녹색 형광 세포 추적기 염료 (Invitrogen)에 전지를 preinc​​ubating에서 생산 할 수 있습니다. </li><li> 30 분 fibronectin 보육 (단계 2.1) 후, 2mL PBS로 MatTek 요리의 우물을 씻는다. </li><li> 6 잘 MatTek 요리의 각 우물에 잘 당 PBS 및 플레이트 6 x10 5 mesothelial 세포를 기음. mesothelial 세포 접시에 연결하고 단일층를 형성하도록하여 야간 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서 MatTek 요리를 품다. </li></ol> 3. Mesothelial 세포 정리 분석 <ol><li> 96 잘 폴리 - HEMA 코팅 접시에서 난소 암 spheroids를 수집 pipet을 사용하십시오. </li><li> mesothelial 세포 단일층를 포함하는 6 자 MatTek 요리는 잘 하나에서 매체를 기음. 2mL PBS로 한 번 씻는다. 96 잘 P로부터 spheroids 모든 추가MatTek 요리 (몇 군데되지 않습니다 접시 부분에 spheroids 착륙 계정에 몇 군데 실거 spheroids의 ~ 3 배 번호)을 잘 하나 늦었어. </li><li> 최소한 8 시간의 기간 동안 촬영된 영상을 수행할 수 거꾸로 widefield 형광 현미경의 무대에 MatTek 요리를 놓습니다. 한 실험에 여러 회전 타원체 윤일 이벤트와 함께 접시에있는 이미지를 여러 위치로 전동식 스테이지를 사용하십시오. 우리는 통합된 완벽한 초점 시스템과 낮은 [20x-0.75 수치 조리개 (NA)] 배율 / 없음 차동 간섭 대비 (DIC) 광학과 니콘 티-E 바뀌 동력 Widefield 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 0.52 NA와 니콘의 할로겐 transilluminator 긴 작동 거리 (LWD) 콘덴서, 니콘 빠르고 (&lt;100 밀리초 스위칭 시간) 여진과 방사 필터 (GFP 예 40분의 480, 엠 50분의 525, RFP-mCherry 예 50분의 575 엠 50분의 640), 셔터 빠르게 전송 그리고 epifluorescence 빛의 경로 스마트 종료ters, 니콘 선형 인코딩된 동력 스테이지, 하마 오카-AG는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라, 온도 및 CO 2 제어의 맞춤식 현미경 보육 챔버, 니콘 NIS-요소 AR 소프트웨어 버전 3을 냉각하고, TMC 진동 절연 테이블. </li><li> 난소암 세포 spheroids은 접시의 바닥에 정착하고 mesothelial 세포 단일층에 연결됩니다. 8 시간 GFP, RFP 및 20 단계 이미지 + 회전 타원체 / 단일층 상호 작용을, 10 분마다를 수집합니다. </li><li> RFP-표현하는 난소암 세포 spheroids은 단일층에 구멍을 만드는 GFP-표현 mesothelial 세포 단일층로 침공합니다. 8시간 후에는 요소 소프트웨어 (또는 이미지 J 같은 다른 적합한 소프트웨어)를 사용하여 GFP 이미지의 검은 구멍을 추적하여 구멍의 크기를 측정합니다. 시간 제로 해당 RFP 이미지의 회전 타원체의 크기로 8 시에 구멍 크기를 나누어 초기 회전 타원체 크기로 구멍 크기를 정상화. 이 예에서는충분한, 구멍의 크기는 한 번만 측정되었지만, 그것은 더 윤달의 역학을 이해하는 데 8 시간 실험을하는 동안 여러 번 측정할 수있다. </li></ol> 4. 대표 결과 이 예제에서, 우리는 OVCA433 spheroids를 제어하는​​ talin-1의 감쇠 표현을 가지고 OVCA433 난소암 세포 spheroids의 mesothelial 통관 능력을 비교했다. 각 그룹에서 OVCA433 spheroids는 ZT mesothelial 세포 monolayers을 포함 MatTek 요리가 추가되었습니다. 각 그룹에서 여​​섯 spheroids은 8 시간 동안 매 10 분 (그림 4, 영화 3, 영화 4) 몇 군데 있었다. 확산 spheroids하여 단일층에서 생산되는 구멍 측정되었으며 각 그룹에서 6 순위는 평균되었다. talin 한 최저의 spheroids 만든 평균 통관 영역 제어 spheroids 만든 평균 면적보다 훨씬 작은 것을 그림 4는 쇼, talin는 O에 의해 mesothelial 통관을 위해 필요하다고 제안VCA433 난소 암 spheroids. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> 그림 1. 난소 암 전이. 기본 난소 종양은 난소 표면 상피 또는 나팔관에서 두 개발할 수 있습니다. 종양 세포 / 클러스터는 일차 종양에서 끊다과 복막 구멍에 수집합니다. 종양 세포는 다음 다세포 spheroids을 형성 종합 수 있습니다. Spheroids 후 복막 캐비티에 즐비한 mesothelial 세포 monolayers에 첨부합니다. mesothelial 세포 spheroids은 기본 지하 막에 액세스할 수 있도록 첨부된 난소암의 회전 타원체 수렁에서 제외됩니다. 영화 1. 난소 암 전이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> 그림 2. </str긴 사연이&gt; Mesothelial 세포 라인 인간 복막 조직의 표면과 난소암 세포를 이식 수렁에서 제외됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> 그림 3. Mesothelial 정리 분석. 난소 암 spheroids는 100을 잠복기에 의해 형성되는 RFP-표현 16시간위한 37 ° C에서 폴리 - HEMA 코팅 96 잘 둥근 바닥 배양 접시에 잘마다 난소암 세포를. 폴리-HEMA는 세포 현탁액에 남아 당 잘 단일 클러스터를 형성하기 위해 서로에 충실 수 있도록 문화 접시에 부착로부터 세포를 방지할 수 있습니다. Mesothelial 세포 monolayers는 fibronectin 코팅 여섯 잘 MatTek 요리에 잘 당 6x10 5 mesothelial 세포를 도금 및 16 시간 동안 37 ° C에서 번호판을 잠복기에 의해 준비가되어 있습니다. spheroids 그런 다음 mesothelial 단일층로 MatTek 요리로 전송되고 두 세포 집단은 니콘 티-E 나를 사용하여 8 시간 10 분 간격으로 몇 군데있다nverted 동력 Widefield 형광 촬영된 현미경과 요소 소프트웨어. 영화 2. Mesothelial 정리 분석가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> OVCA433 spheroids의 talin 한 표현의 그림 4. 감쇄량은 mesothelial 통관 능력을 감소시킵니다. 과 및 talin 1 감쇠 표현없이 OVCA433 spheroids (빨간색)은에 연결하고 ZT mesothelial 단일층 (녹색)으로 나눠야 허용되었다. 두 세포 집단은 니콘 티-E 바뀌 동력 Widefield 형광 촬영된 현미경과 요소 소프트웨어를 사용하여 8 시간 10 분 간격으로 몇 군데 있었다. 그래프는 talin 한 감쇠를 보여줍니다크게 mesothelial 세포 통관 (수단에 녹색 막대로 Quantile 플롯)을 낮춥니다. 동영상 3. 제어 mesothelial 단일층 (녹색)에 침입하는 OVCA433 spheroids이 (빨간색). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . OVCA433 spheroids의 talin 한 표현 (빨간색)의 영화 4. 감쇄량은 (녹색) 통관 능력을 mesothelial 낮춥니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기에 제시된 &quot;Mesothelial 정리 분석은&quot;훌륭한 공간과 시간적 자세히, 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 모니터링하기 위해 촬영된 현미경을 사용합니다. 이전에는 8-14 몇몇 그룹은 난소암 세포가 부착하고 mesothelial 세포 monolayers에 침공 표시하도록 끝점 assays를 사용했다. 이 분석은 독특한 점에서이 두 세포 인구의 역학은 검정에 걸쳐 모니터링할 수 있도록, mesothelial 세포에서 종양 세포를 구별할 fluorescently 라벨 세포를 사용합니다. 윤달의 과정은 실시간으로 시각 수 있으며 mesothelial 통관의 요금은 양적 시간이 지남에 따라 측정할 수있다. timelapse 현미경의 사용은 하나가 밀접하게 서로 다른 실험 조건에서 두 세포 집단 사이의 상호 작용의 역학을 관찰 할 수 있습니다. 또한 mesothelial 세포 또는 난소 암 CE 하나의 작은 비율재편은 인구 내에서...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> OVCA433 난소 암 세포 </td><td></td><td></td><td> 박사 데니스 Slamon의 선물 </td></tr><tr><td> Mesothelial 셀을 ZT </td><td></td><td></td><td> 박사 탄의 선물 Ince </td></tr><tr><td> 중형 199 </td><td> Gibco </td><td> 19,950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> 세포 응용 주식 회사 </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS-더위 inactivated </td><td> Gibco </td><td> 10,082 </td><td></td></tr><tr><td> 펜-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15,070 </td><td></td></tr><tr><td> 96 잘 접시 </td><td> 코닝 Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tR&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylate (폴리-HEMA) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 192066-25G </td><td> 폴리 - HEMA 솔루션을 95 % EtOH의 1ml에 6mg 폴리 - HEMA 분말을 용해 </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> DH 2 0에서 95 %까지 희석 </td></tr><tr><td> 세포 배양 후드 </td><td> Nuaire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 문화의 인큐베이터 </td><td> 써모 과학 </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - HEMA 플레이트위한 인큐베이터 </td><td> Labline 악기 </td><td> 제국 III 305 </td><td></td></tr><tr><td> 탁상 원심 분리기 </td><td> Heraeus </td><td> 75003429 / 01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 잘 유리 바닥 요리 </td><td> MatTek 사. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> 시그마 </td><td> F1141-1MG </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> Timelapse 현미경 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 통합된 완벽한 초점 시스템과 티-E 바뀌 동력 형광 촬영된 현미경 </td></tr><tr><td> 렌즈 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 20X-0.75 수치 apeture </td></tr><tr><td> 할로겐 transilluminator </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 0.52 없음 긴 작동 거리 응축기 </td></tr><tr><td> 여진과 방사 필터 </td><td> 니콘 주택 채도 단일 패스 필터 </td><td></td><td> GFP 예 40분의 480, 엠 50분의 525 RFP-mCherry 예 50분의 575 엠 50분의 640 </td></tr><tr><td> 전송 및 광 경로를 Epifluoresce </td><td> 셔터 </tD&gt; <td></td><td> 스마트 셔터 </td></tr><tr><td> 선형 인코딩 동력 무대 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 냉각 충전 - 결합 장치 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> 오카-AG </td><td></td></tr><tr><td> 온도 및 CO 2 제어 현미경 보육 챔버 </td><td> 주문품의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 진동 절연 표 </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국정원 - 요소 소프트웨어 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 버전 3 </td></tr></tbody></table>

체외 mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

난소암은 미국 1의 암 관련 사망의 다섯 번째 주요 원인이다. 치료에 긍정적인 초기 대응에도 불구하고 난소암과 여성의 70~90% 새로운 metastases을 개발하며, 재발은 종종 두 치명적이다. 그것은 중급과 늦은 무대 난소암 더 나은 치료법을 개발하기 위해 보조 metastases가 발생하는지 이해하기 위해, 따라서 필요합니다. 악성 세포가 일차 종양이 사이트에서 분리 및 복막 캐비티 전체에 보급하면 난소암의 전이가 발생합니다. 전파 세포가 복막 구멍 3 (그림 1, 영화 1) 내의 장기에 다세포 클러스터, 또는 spheroids 역시 남아 맨몸으로, 아니면 임플란트를 형성할 수 있습니다. 복막 캐비티 내의 장기의 모든 mesothelial 세포를 4-6 (그림 2) 단일, 연속, 레이어로 채워져 있습니다. 그러나 mesothelial 세포 수렁에서 결석입니다같은 excised 인간 종양 조직 섹션 3,5-7 (그림 2)의 전자 현미경 연구에 의해 밝혀 복막 종양 유출. 이것은 mesothelial 세포를 알 수없는 프로세스에 의해 종양이 대량 수렁에서 제외됩니다 것을 제안합니다. 체외 실험에서 이전은 기본 난소암 세포 8 mesothelial 세포보다는 세포외 기질에 더 효율적으로 첨부하고, 더 최근의 연구는 그 기본 복막 mesothelial 세포가 실제로 난소암 세포 부착 및 침입 (같은 접착 및 침략에 비해에 장벽을 제공 보여주 것을 증명 ) mesothelial 세포에 9,10을 취재되지 않은 기판에. 이것은 mesothelial 세포가 난소 암 전이에 대한 장벽 역할을하는 것이 좋습니다 것이다. 난소암 세포가이 장벽을 위반하고있다 mesothelium를 제외하는 세포와 분자 메커니즘은 최근까지 알려지지 않았다. 여기 일을 설명시험 관내 분석을위한 전자 방법론 해당 모델 생체내 (그림 3, 영화 2) 난소암 세포 spheroids과 mesothelial 세포 사이의 상호 작용. 우리의 프로토콜은 mesothelial monolayers 8-16과 난소 종양 세포의 상호 작용 분석을위한 앞에서 설명한 방법에서 적응되었고, 먼저 난소 종양 세포의 배제를 추진 마이 오신과 견인 힘을 인테 종속 활성화를 활용 보여주는 리포트에서 설명되었다 종양 회전 타원체 17 세 이하의 mesothelial 세포. 이 모델은 상호 작용의 공간적 및 시간적 정보를 제공하고, 실시간으로 두 세포 인구를 모니터링하는 데 시간이 경과 형광 현미경을 이용합니다. mesothelial 세포가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 동안 난소 암 세포는 빨간 형광 단백질 (RFP)를 표현. RFP-표현하는 난소암 세포 spheroids하면 GFP-표현 mesothelial 단일층에 첨부해 주시기 바랍니다. spheroids 확산은 침공, 그리고옆으로 단일층에 구멍을 만드는 mesothelial 세포를 강제로. 이 구멍은 GFP 이미지의 부정적인 공간 (블랙)와 같은 시각이다. 구멍의 지역 그리고 양적 통제와 난소암 및 / 또는 mesothelial 세포 실험 집단 간의 클리어런스 활동의 차이를 분석하는 측정 수 있습니다. 이 분석은 난소암 세포 (조건 회 회전 타원체 X 20-30 spheroids 당 100 세포)만이 소수의 필요 때문에 귀중한 일차 종양 세포 샘플을 사용하여이 분석을 수행 가능합니다 이상입니다. 또한이 분석은 쉽게 높은 처리량 검사에 대해 적용할 수 있습니다.

여기에 설명된 mesothelial 통관 분석은 fluorescently 표시된 셀 및 촬영된 비디오 현미경 시각화하고 양적 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 측정하기 위해 활용합니다. 이 분석은 난소 암 전이의 초기 단계를 모델.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

난소암은 미국 내 암 관련 사망 원인 중 다섯 번째로 높은 비중을 차지합니다1. 치료에 대한 초기 반응은 긍정적임에도 불구하고, 70~90%의...

이 실험 과정의 전체적인 목표는 난소암 다세포 구상체(multicellular spheroids)가 중피 세포 단층(mesothelial monolayer)으로 침습하는 능력을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 적색 형광 단백질을 발현하는 난소암 세포를 저부착 배양 플레이트에서 배양하여 다세포 구상체를 형성시킵니다. 다음 단계로는 녹색 형광 단백질을 발현하는 중피 세포를 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅된 유리 바닥 배양 접시에 플레이팅하여 단층을 형성합니다.마지막 단계는 난소암 구상체(phs)를 저부착 플레이트에서 중피 세포 단층이 포함된 플레이트로 옮기는 것입니다. 최종적으로 형광 타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 대조군과 실험군 난소암 구상체가 중피 세포 단층에 구멍을 형성하는 상대적 능력을 정량화합니다.기존의 엔드포인트 분석법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 형광 표지된 세포와 타임랩스 비디오 현미경법을 결합하여 시간 경과에 따른 메지알 제거(mesial clearance)의 역동성을 모니터링할 수 있다는 점입니다. 난소암 구체(sphere)를 형성하기 전, 저부착 96웰 라운드 바닥 배양 접시를 준비해야 합니다. 이러한 배양 접시를 제작하려면 96웰 세포 배양 접시의 각 웰에 30 µL의 poly hema 용액을 첨가하십시오.에탄올을 증발시켜 각 웰에 poly HEMA 박막이 형성되도록 96-웰 플레이트를 37 °C 비가습 인큐베이터에서 24~48시간 동안 배양합니다. 이 poly HEMA 박막은 세포가 웰 바닥에 부착되는 것을 방지하여 세포가 부유 상태로 성장하도록 유도합니다. 저부착 배양 플레이트가 준비되면, 본 실험에서 사용되는 적색 형광 단백질 발현 난소암 세포를 10% base medium(맞춤형 세포 배양 배지)에서 배양합니다.먼저 PBS로 플레이트를 세척한 후, 트립신 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 4~5분 동안 배양하여 난소암 세포 플레이트를 트립신 처리합니다. 트립신 반응을 중단시키기 위해 10% 기본 배지를 첨가한 후, 세포 현탁액을 15 mL 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 탁상 원심분리기를 사용하여 900 RCF에서 3분 동안 세포를 펠릿화하고, 상층액을 흡입하여 제거한 다음 10% 기본 배지에서 세포를 재현탁합니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 센 후, 세포 농도를 10% Base medium 50 µL당 100 cells가 되도록 조정합니다. 균일하게 부유된 희석 세포 현탁액 50 µL를 96-well poly-HEMA 코팅 배양 접시의 각 웰에 첨가합니다. 난소암 세포들이 서로 뭉쳐 각 웰에 하나의 다세포 스페로이드(multicellular spheroid)를 형성할 수 있도록 37 °C 세포 배양 인큐베이터에서 16시간 동안 96-well 플레이트를 배양합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 6-well glass bottom MatTek 접시의 웰을 피브로넥틴(fibronectin)으로 사전 코팅합니다. 접시의 각 웰에 피브로넥틴 PBS 용액 2 mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 방치합니다.중피세포 단일층 형성을 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 중피세포를 10% 기본 배지에서 배양합니다. 트립신을 이용하여 중피세포 플레이트를 처리한 후, 테이블탑 원심분리기를 사용하여 900 RPM에서 3분간 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 10% 기본 배지에 재현탁하며, 10% 기본 배지를 사용하여 원하는 농도로 조정합니다. Matrigel 디쉬의 30분 피브로넥틴 배양이 완료되면, 각 웰을 2 mL의 PBS로 세척합니다. PBS를 흡입하여 제거하고, 6-웰 Matrigel 디쉬의 각 웰에 6 × 10⁵개의 중피세포를 분주합니다.중피세포가 디쉬에 부착되어 단층을 형성할 수 있도록 mat tech 디쉬를 37 °C 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 분석을 시작하려면, 파이펫을 사용하여 96웰 poly hema 코팅 플레이트에서 난소암 PHE를 수집하십시오. 중피세포 단층이 포함된 6웰 mat tech 디쉬의 한 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 2 mL의 PBS로 한 번 세척한 다음, 96웰 플레이트의 모든 PHE를 mattec 디쉬의 한 웰에 추가합니다. 이는 이미징이 불가능한 디쉬 영역에 PHE가 안착하는 경우를 고려하여, 이미징 예정인 스페로이드 수의 약 3배에 해당하는 양입니다.시야당 하나의 스테로이드만 이미징하고자 하므로, 스테로이드의 응집을 방지해야 합니다. 스테로이드가 부착되기 전, 단층 전체에 고르게 분산되도록 디시를 좌우로 살살 흔들어 줍니다. Mat Tech 디시를 도립 광시야 형광 현미경의 스테이지 위에 놓습니다.최소 8시간 동안 타임랩스 이미징을 수행할 수 있어야 합니다. 전동 스테이지를 사용하여 여러 번의 OID 상호 작용 이벤트가 발생하는 배양 접시 내의 여러 위치를 촬영하십시오. 단일 실험에서 난소암 세포 PHE는 배양 접시 바닥으로 가라앉아 중피 세포에 부착됩니다.단층막은 8시간 동안 10분마다 20개 이상의 구상체(spheroid) 단층막 상호작용에 대한 G-F-P-R-F-P 및 위상 이미지를 수집합니다. 중피세포 제거 분석(mesothelial cell clearance assay)에서, RFP를 발현하는 난소암 세포 구상체는 GFP를 발현하는 중피세포 단층막을 침범하여 단층막에 구멍을 형성합니다. 구멍의 크기는 element 소프트웨어 또는 Image J와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 GFP 이미지의 검은 구멍을 추적함으로써 측정합니다. 이후 8시간 시점의 구멍 크기를 0시간 시점의 해당 RFP 이미지 속 구상체 크기로 나누어, 구멍의 크기를 초기 구상체 크기에 대해 정규화합니다. 중피세포 제거 분석은 유전적으로 변형된 난소암 세포 구상체의 침범 능력을 비교하여, 난소암 세포 구상체가 중피세포를 제거하는 분자적 기전을 규명하는 데 사용될 수 있습니다.본 예시의 중피 단층은 OVCA 4 33 난소암 세포의 중피 제거 능력을 나타냅니다. Talon 1의 발현이 감쇠된 PHE와 대조군인 OVCA 4 33 OID를 비교하였습니다. PHE의 확산으로 인해 단층에 생성된 구멍의 크기를 측정하였으며, 각 군에서 6개 지점을 측정하여 평균을 냈습니다.이 그래프에서 알 수 있듯이, Talon 1 넉다운 스테로이드에 의해 생성된 평균 제거 영역은 대조군 스테로이드에 의해 생성된 평균 영역보다 유의미하게 작았으며, 이는 OVCA 4 33 난소암 구상체(spheroids)에 의한 중피 제거에 Talon이 필요함을 시사합니다. 이 타임랩스 영상은 대조군인 OVCA 4 33 적색 구상체가 녹색 중피 단층으로 침습하는 모습을 보여줍니다. 다음 타임랩스 영상은 Talon 1 발현이 약화된 OVCA 4 33 적색 구상체가 녹색 중피 단층으로 침습하는 모습입니다.이전 영상과 비교했을 때, 스테로이드 내 Talon one 발현의 감쇠가 중피세포의 제거 능력을 감소시킨다는 것이 분명합니다. 이 영상을 시청한 후에는 타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 난소암, 다세포 스테로이드 및 중피세포 단일층의 상호작용을 시간에 따라 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

이 비디오에서는 복막강 내막의 체외 3차원 모델 개발을 보여줍니다. 이 유기형 배양은 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

복강내막의 난소암 전이 모델링: 복막강 내막의 체외 3D 모델을 확립하는 방법

이 비디오는 형광 표지된 세포와 타임 랩스 비디오 현미경을 사용하여 난소암 스페로이드와 중피 세포의 상호 작용을 정량적으로 측정하는 기술에 대해 설명합니다. 이 in vitro assay는 in vivo에서 전이되는 난소암 세포 스페로이드와 복막강 내벽의 중피 세포 간의 상호 작용을 모델링합니다.

Mesothelial clearance Assay: 난소암 스페로이드가 중피 세포 단층으로 침투하는 능력을 정량화하는 In vitro 기술

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

우리는 복막 지방 조직, 특히 망막의 난소암 집락화를 연구하기 위해 생체 내 및 생체 외 접근 방식을 모두 구현하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 복막 지방의 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spots)으로 알려진 망막의 면역 세포 구조를 정량화하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다.  여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

복강 내 난소 암 전이의 정량

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인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

배우세요 난소암 다세포 구형체가 중피 단층을 침습하는 능력을 형광 시간 경과 현미경으로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 암 전이 메커니즘 연구에 활용됩니다.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

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