체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

이 절차의 전반적인 목표는 난소암 다세포 스테로이드가 중피 단층을 침범하는 능력을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 난소암 세포를 발현하는 적색 형광 단백질을 저접착 배양판에서 배양하여 다세포 스테로이드를 형성함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 피브로넥틴으로 코팅된 유리 바닥 배양 접시에 중피 세포를 발현하는 녹색 형광 단백질을 도금하여 단층을 형성하는 것입니다.

마지막 단계는 저접착 플레이트에서 중피 단층을 포함하는 플레이트로 난소암 phs를 전달하는 것입니다. 궁극적으로 형광 타임 랩스 비디오 현미경 검사는 제어 및 실험적 난소암의 상대적 능력을 정량화하는 데 사용됩니다. SP는 중피 단층에서 전체를 형성합니다.

기존 종말점 분석에 비해 이 기술의 주요 장점은 형광 표지된 세포와 타임 랩스 비디오 현미경의 조합을 사용하여 시간 경과에 따른 근심 청소의 역학을 모니터링하는 데 사용된다는 것입니다. 난소암 phe가 형성되기 전에 낮은 접착력을 준비해야 합니다.96 웰 라운드 바닥 배양 접시. 이러한 배양 접시를 생산하려면 30 웰 세포 배양 접시의 각 웰에 96 마이크로리터의 폴리 헤마 용액을 추가합니다.

96개의 웰 플레이트를 섭씨 37도의 비가습 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양하여 에탄올을 증발시키고 각각에 폴리 헤마 필름을 남깁니다. 이 폴리 헤마 필름은 세포가 웰 바닥에 부착되는 것을 방지하여 세포가 현탁액으로 성장하도록 합니다. 이 실험에서 난소암 세포를 발현하는 적색 형광 단백질은 저접착 배양판이 준비되면 맞춤형 세포 배양 배지인 10% 염기 배지에서 배양됩니다.

트립신은 난소암 세포를 담은 플레이트로, 먼저 PBS로 플레이트를 세척한 다음 트립신 1밀리리터를 첨가하고 플레이트를 섭씨 37도 4 5분에서 배양합니다. 트립신을 담금질하기 위해 10%염기 배지를 첨가한 후 세포 현탁액을 15ml 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 900 RCF의 탁상용 원심분리기에서 3분 동안 세포를 펠렛화하고, 상층액을 흡인하고, 10% 염기 배지에서 세포를 재현탁합니다.

혈구분석기를 이용하여 세포를 계수한 후, 세포의 농도를 10% 기본 배지 50마이크로리터당 100개 세포로 조정하고, 96웰 폴리헤마 코팅된 배양접시의 각 웰에 균일하게 부유된 희석된 세포 현탁액 50마이크로리터를 첨가하고, 96웰 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 16시간 동안 배양하여 난소암 세포가 함께 클러스터링할 수 있도록 하며, 각 웰에 단일 다세포 스테로이드를 형성합니다. 이 절차를 시작하려면 6개의 웰 유리 바닥 매트 테크 접시의 웰에 피브로넥틴을 바르십시오. 접시의 각 웰에 2ml의 피브로넥틴 PBS 용액을 넣고 B 실온에서 30분 동안 배양합니다.

중피 세포를 형성하기 위해 중피 세포를 발현하는 녹색 형광 단백질은 10% 염기 배지 트립신 눈에서 배양하고 중피 세포 플레이트를 만들고 3분 동안 900RPM의 탁상용 원심 분리기에서 스핀다운합니다. 상층액을 흡인하고 10% 기본 배지에서 세포를 재현탁하고 10% 기본 배지로 원하는 농도로 조정합니다. 매트 테크 접시의 피브로넥틴 배양이 30분 동안 완료되면 2밀리리터의 PBS로 웰을 세척하고 PBS를 흡인하고 6개의 웰 매트 테크 접시의 각 웰에서 웰당 5번째 중피 세포를 10회 플레이트합니다.

매트 테크 접시를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 중피 세포가 접시에 부착되어 단층을 형성할 수 있도록 합니다. 이 분석을 시작하려면, 피펫을 사용하여 96 Well poly hema coated plate에서 난소암 PHE를 수집하고, 2 ml의 PBS로 중피 세포 단층 세척을 포함하는 6 well mat tech dish 중 1 well에서 배지를 흡인하고, 96 whale plate의 모든 PHE를 mattec 접시의 한 well에 추가합니다. 이것은 이미지화할 수 없는 접시 부분에 PHE가 착륙하는 것을 설명하기 위해 이미지화될 스테로이드의 수의 약 3배입니다.

우리는 시야당 하나의 스테로이드만 이미지화하기를 원하기 때문에 스테로이드의 응집은 피해야 합니다. 스테로이드가 부착되기 전에 단층에 고르게 분포되도록 접시를 좌우로 부드럽게 흔듭니다. 매트 테크 접시를 무대에 놓습니다.tage 반전 광시야 형광 현미경.

최소 8시간 동안 타임랩스 이미징을 수행할 수 있습니다. 전동 스테이지를 사용하여 여러 OID 간 데이터 정렬 이벤트가 있는 접시의 여러 위치를 이미지화합니다. 한 번의 실험에서, 난소암 세포 PHE는 접시 바닥에 가라앉아 중피 세포에 부착될 것입니다.

단층은 8시간 동안 10분마다 20개 이상의 sphe 단층 상호 작용의 G-F-P-R-F-P 및 위상 이미지를 수집합니다. 중피 세포 제거 분석에서 난소암 세포 PHE를 발현하는 RFP는 중피 세포 단층을 발현하는 GFP를 침범하여 단층에 구멍을 생성합니다. 정공의 크기는 요소 소프트웨어 또는 이미지 J와 같은 다른 적절한 소프트웨어를 사용하여 GFP 이미지 내의 블랙홀을 추적함으로써 측정되며, 이어서 정공의 크기는 8시간에서의 정공의 크기를 해당 RFP 이미지 내의 스테로이드의 크기로 0으로 나눔으로써 초기 스페로이드 크기로 정규화되며, mesothelial cell clearance assay는 난소암 세포 스테로이드가 맑은 분자 메커니즘을 규명하기 위해 유전적으로 변경된 난소 암 세포 sphe의 내습 능력을 비교하는 데 사용할 수 있습니다.

이 예에서 중피 단층은 O VCA 4 33 난소암 세포의 중피 제거 능력입니다. Talon one의 발현이 약화된 Phs를 대조군 OVCA 4 33 OID의 발현과 비교하였다. 확산 PHE에 의해 단층에 생성된 구멍을 측정하고 각 그룹의 6개 위치를 평균화했습니다.

이 그래프에서 볼 수 있듯이, Talon one 넉다운 스테로이드에 의해 생성된 평균 청소 면적은 대조 스테로이드에 의해 생성된 평균 면적보다 현저히 작았으며, 이는 Talon이 OVCA 4 33 난소암 sps에 의한 중피 청소에 필요하다는 것을 시사합니다. 이 타임랩스 동영상은 대조군 OVCA 4 33 레드 스테로이드가 녹색 MESOTHELIAL 단층에 침입하는 것을 보여줍니다. 이 다음 타임랩스 영화는 OVCA 4 33 레드 스테로이드로, 탈론의 감쇠된 발현이 녹색 중피 단층으로 침입하는 것입니다.

이전 영화와 비교할 때, 스테로이드에서 발톱 하나 발현의 감쇠가 중피 제거 능력을 감소시킨다는 것은 명백합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 타임 랩스 비디오 현미경을 사용하여 시간 경과에 따른 난소암, 다세포 스테로이드 및 중피 세포 단층의 상호 작용을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.