도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로

본 프레젠테이션에서는 ^{18}O 농축수를 이용한 단백질 소화물 및 합성 펩타이드의 안정 동위원소 표지 워크플로를 시연합니다. 먼저 프로테아제 촉매 paleo 시계열 실험에서는 기질과 프로테아제를 50% ^{18}O 농축수가 포함된 조건에서 배양하여 ^{18}O 원자를 도입합니다. 그다음 프로테아제를 이용한 이중 표지법에서는 소화 후 생성된 절단 산물을 대상 프로테아제와 함께 50% ^{18}O 농축수 존재 하에 다시 배양합니다.

EO 워크플로우는 정해진 시간 간격으로 산 촉매를 이용해 기능기에 산소 18 원자를 도입합니다. 질량 분석 데이터 획득 시 매트릭스가 포함된 반응 혼합물 분량을 몰드 타겟 플레이트에 점적하면, 펩타이드 절단 반응의 스펙트럼 시간 도표와 개별 펩타이드 종의 산소 18 도입 도표가 생성됩니다. 라벨링된 절단 생성물은 MS/MS 기반의 서열 확인을 위해 선택됩니다. 궁극적으로, 이러한 워크플로우는 정량적 및 정성적 프로테오믹스 연구를 위한 다각적인 도구를 제공합니다.

이 방법은 복잡한 단백질 분해 경로에서 속도 제한 단계와 반응 중간체를 식별하는 것과 같이 프로테아제 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. paleo 시계열 분석을 통해 식별된 단백질 분해 시그니처는 기질 특이성에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 또한, 데이터의 타이머는 kinetic 정보 또한 활용합니다.

이제 저희 실험실의 박사후 연구원이 해당 절차를 시연하겠습니다. paleo 시계열 워크플로우는 프로테아제에 의해 촉매되는 oxygen 18 통합을 기반으로 단백질 분해 절단 반응의 역학을 모니터링합니다. 20 µL 반응물에 oxygen 18이 풍부한 물이 포함된 프로테아제 반응 버퍼와 샘플 펩타이드를 추가하십시오. 반응 혼합물 0.5 µL를 매트릭스 0.5 µL와 혼합하여 opti to 3 84 maldi 타겟 플레이트에 점적하고, 용매 방울이 실온에서 마를 때까지 두십시오. 그동안 반응 혼합물을 두 개의 튜브로 나누십시오.

시료 튜브를 위한 대조군과 시료를 준비합니다. 관심 있는 프로테아제를 첨가하고 권장 효소 반응 온도에서 배양합니다. 지정된 시간 지점별로 첨가합니다.

0.5 µL의 aliquot를 취해 0.5 µL의 매트릭스와 혼합한 후 multi targett 플레이트에 점적합니다. 이후 이 paleo post digestion labeling 워크플로우에서 설명하는 바와 같이 MALDI-TOF MS 분석을 통해 반응 역학을 분석합니다. trypsin과 같은 produce는 산소-18을 통합하기 위한 carboxyl oxygen exchange 반응을 촉매합니다. 산소-18 라벨링 없이 단백질 소화를 수행한 후, 분해 산물을 pep clean C18 spin column에 통과시켜 잔류 프로테아제 활성을 제거합니다.

그런 다음 $^{18}\text{O}$ 강화수를 포함하는 트립신 반응 버퍼 20 $\mu\text{L}$에 샘플을 재부유시킵니다. 0.5 $\mu\text{L}$의 분주액을 취하여 동일한 부피의 매트릭스와 혼합합니다. 이어서 Opti Off 3 84 MALDI 타겟 플레이트에 점적하여 공기 중에서 건조시킵니다.

다음으로, 반응 용액을 대조군 튜브와 샘플 튜브로 나눕니다. 샘플 튜브에 trypsin을 첨가하고 37 °C에서 배양합니다. 반응을 모니터링하기 위해 0.5 µL의 aliquot을 취합니다.

0.5 µL의 매트릭스와 혼합하여 말토디(MALDI) 플레이트에 점적합니다. MALDI-TOF MS 분석을 통해 이 카르복실 산소 교환 반응의 역학을 분석합니다. IEO 시계열 워크플로우는 산성 펩타이드의 측쇄 및 말단 그룹에서 일어나는 산 촉매 카르복실 산소 교환 반응에 기반합니다.

먼저, 0.1% 최종 농도의 trichloroacetic acid 존재 여부에 따라 50 nanomolar의 개별 펩타이드를 1:1 비율의 oxygen 18 농축수와 함께 배양합니다. 48일 동안 매일 반응액 0.5 microliter 분주량을 취하여 MALDI 타겟 플레이트에 매트릭스와 함께 직접 공-침전시킵니다. MALDI 타겟 플레이트를 정기적으로 MALDI TOF MS/MS 제품 분석에 제출합니다. 이 섹션에 대한 자세한 내용은 동반된 원고에 기술되어 있습니다.

먼저, 양이온 모드에서 MS 스펙트럼을 3회 반복 측정합니다. 멀티플을 교정하고 MS 획득 설정을 완료한 후, 서브 스펙트럼을 위한 단일 샷을 획득합니다. 다음으로, 4,000 시리즈 Explorer 데이터 획득 소프트웨어에서 MS 데이터 파일을 내보냅니다.

그런 다음 spectral processing 및 peak detection을 위해 mascot distiller 소프트웨어를 사용하는 사내 정보 시스템으로 가져옵니다. 동위 원소 포락선을 디콘볼루션(deconvolute)하고 oxygen 18 통합 비율을 자동으로 결정합니다. oxygen 18 통합 비율은 전체 동위 원소 포락선에 대한 개별 펩타이드 동위 원소 종의 상대적 기여도로 기록합니다. bin 리스트를 필터링하고 각 시계열 실험에 대해 100 PP m 질량 폭으로 최소 3개의 값을 binning 합니다.

관련 MS 데이터 파일에서 검출된 모든 펩타이드 종의 분자량을 추출합니다. 이제 Xpacey find pep set을 사용하여 200 PPM의 질량 오차 허용 공차를 설정합니다. 빈 리스트(bin list)를 기질 펩타이드 서열로부터 예측된 단백질 분해 절단 산물의 데이터와 비교합니다.

find pep 툴에 의해 예측된 모든 절단 생성물의 질량 값과 oxygen 18 도입이 연관된 bin 값에 대해 msms 스펙트럼 획득을 진행하십시오. 서브 스펙트럼당 무작위 패턴으로 50 shots의 MSMS 데이터를 수집하며, 스팟당 최대 40개의 서브 스펙트럼까지 수집한 후 msms 파일을 내보내십시오. 그런 다음, 피크 검출을 위해 MSMS 데이터 파일을 분석 시스템으로 내보내고, 펩타이드 식별을 위해 해당 bend MS 데이터와 연관된 MSMS 피크 리스트를 내보내십시오.

Mascot 검색 엔진에서 검색 매개변수를 효소 특이성 없음, 전구 이온(precursor ion) 질량 허용 오차 150 PPM, 단편 이온(fragment ion) 질량 허용 오차 0.2 Dalton으로 설정하십시오. M-S-M-S-P 목록을 Swiss Pro 데이터베이스와 대조하여 검색하십시오. 펩타이드 식별은 스펙트럼 시간 플롯(spectral time plots)에서 각 단편 이온에 걸친 특징적인 oxygen 18 통합 패턴을 확인하여 data explorer 소프트웨어를 통해 추가로 검증할 수 있습니다.

매크로를 사용하여 데이터 탐색 소프트웨어 ASCI 파일에서 각 반응 시간 지점별 MS 데이터 파일을 내보냅니다. 그런 다음 이 파일들을 데이터 분석 및 그래픽 소프트웨어 프로그램으로 가져와 폭포수 도표(waterfall plots)로 표시하여 각 굴곡(bend)에 대한 oxygen 18 통합 도표를 생성합니다. 펩타이드 절단 생성물에서 모든 반응 시간 지점에 걸친 개별 펩타이드 동위원소 종의 상대적 기여도를 추출한 다음, 이를 시간으로 플롯합니다.

이와 같은 스펙트럼 시간 도표는 단백질 분해 절단 반응의 역학을 보여줍니다. 본 실험에서는 내피 전환 효소 1(endothelium converting enzyme one)에 의한 생성 활성 펩타이드 endo 및 C의 절단을 분석합니다. 워터폴(waterfall) 배열로 시계열 실험의 MS 스펙트럼을 도식화하여, 기질의 분해와 중간 생성물 및 최종 생성물의 출현을 동시에 모니터링합니다.

분해 산물은 MSMS와 그 동위원소 포락선(isotope envelopes)의 특징적인 oxygen 18 삽입 시그니처를 통해 확인합니다. 이러한 trypsin의 반응 메커니즘은 해당 프로테아제가 펩타이드 분해 산물에 최대 두 개의 oxygen 18 원자가 삽입되는 것을 매개함을 나타냅니다. 프로테아제 기반 라벨링 워크플로우에서, 펩타이드 결합 분해 반응은 갓 생성된 펩타이드 분해 산물에 대해 50%의 단일 oxygen 18 삽입 비율을 보입니다. trypsin과 같이 반응 산물에 다시 결합하는 프로테아제는 카르복실 산소 교환 반응을 통해 두 번째 oxygen 18 원자의 삽입을 추가로 촉매합니다.

평형 상태에서 18O 표지는 표지되지 않은 생성물, 단일 표지 생성물 및 이중 표지 생성물에 1:2:1의 비율로 분포됩니다. 단백질 분해 말단(proteolytic termini)의 사전 소화 표지 워크플로우에서는 펩타이드 결합 절단이 일어나지 않습니다. 대신, 최대 2개의 18O 원자의 도입은 전적으로 카르복실 산소 교환 반응에 기반합니다.

따라서, 산소 18의 결합은 펩타이드 절단 생성물과 재결합하는 프로테아제에서만 일어납니다. 산 촉매 산소 18 표지는 카복실기당 두 개의 산소 18 원자가 결합되는 결과로 이어집니다. 본 실험 과정에서, 안지오텐신 1의 동위원소 포괄체의 2 Dalton 배수 질량 이동은 산소 18 원자의 흡수를 통해 매핑될 수 있습니다.

OPE 라벨링과 고해상도 질량 분석법을 시간 분해 방식으로 결합함으로써, paleo 시계열 분석법은 펩타이드 생성물의 동적인 분석을 가능하게 합니다. 이 분석법은 정량적 및 정성적 프로테오믹스 연구를 위해 안정화된 국소 라벨링 펩타이드를 생성하고, Protopic 펩타이드가 생성되는 속도론을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

Paleo 시계열 분석은 생리적으로 유의미한 조건에서 단백질 분해 경로를 평가하기 위해 설계되었습니다. 이 기술은 최근 인간 암 미세환경 내의 용해 과정에 대한 저희의 조사를 가능하게 하는 토대가 되었습니다.