Name: 도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로 18 O 강화 물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 단백질 소화물의 안정 동위원소 라벨링 워크플로우를 18O 강화 물을 사용하여 프로테아제 및 산 촉매 방법으로 수행하는 기술을. 질량 분석을 통해 정량 및 정성 프로테오믹스 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH / NIDCR 부여 1R01DE019796에 의해 지원되었다.

제시 LEO-워크 플로우는 단백질의 안정 동위 원소 라벨 요약 및 합성 펩티드를 위해 수 있습니다. 이 시간 코스 실험 (그림 1) 비교 및 정량 단백질 체학 연구뿐만 아니라 단백 분해 효소 연구에 적용 할 수 있습니다. 각 워크 플로우는 두 실험 단계 (그림 2)로 구성되어 있습니다 : A) 각 18 O-안정 동위 원소 인코딩 반응 (단백 분해 효소 - 촉매 펩타이드 절단의 해결 샘플링 시간, 단백 분해 효소 - 촉매 카르 복실 산소 교환 반응, 산 - 촉매 카르 복실 산소 교환 질량 분석법 18 O-정관의 속도론의 그래픽 표현에 의한 반응) 및 B) 분석. A.의 TimeCourse 실험 I. PALeO - TimeCourse : proteolytic cleavages의 단백 분해 효소 - 촉매 라벨 <ol><li> (선택 사항) 단백질 (10 μM) 및 펩티드 (250 μM)의 이황화 채권은 DTT (최종 농도 2.5 ㎜)로 감소25 MM의 NH 4 50 30 분에 부화하여 HCO 3 (모두 신선하게 조리 된) ° C. </li><li> (선택 사항) 무료 cysteines는 iodoacetamide과 alkylated합니다 (최종 농도를 10 MM) 25 MM에 NH 4 HCO 3 어둠 속에서 실온에서 30 분에 부화하여. </li><li> 관심 단백 분해 효소에 따라, 단백질 / 펩타이드 솔루션은 잔류 버퍼와 알킬화 에이전트를 제거하는 청소 업 있어야합니다. 단백질 샘플에 대한 버퍼를 교환 할 수 펩타이드 정리와 Vivaspin 원심 선기 (Sartorius)에 대한 PepClean C-18 스핀 열 (열)를 사용합니다. </li><li> / Redissolve 교환 펩티드 / 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에 단백질 (ECE-1 : 50 MM MES - ​​코, 산도 5.5, 트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 1시 1분 (V / V) 마지막 H 2를 포함하는 18 O (95 %, 시그마 Isotec). </li><li> 이전 단백 분해 효소의 추가에 제로 시점 샘플을 철회 : 믹스 반응 혼합물의 0.5 μl 및 0.5 μl 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic을산 매트릭스 (50 % 아세토 니트릴 10 MG / ML, 0.1 % TFA). Opti-TOF 384 든 대상 플레​​이트 (AB SCIEX)에 자리 샘플을하고 실온에서 용매 방울을 떠날 건조 할 때까지 (약 5 분). </li><li> 이 aliquots에 반응 솔루션을 분할. 특정 효소에 대한 실내 온도 권장 온도 :; : 첫 나누어지는이 관심의 단백 분해 효소 (0.04 NM 트립신 75 NM ECE-1) incubated 수 있습니다. 두 번째 나누어지는이 단백 분해 효소없이 incubated 수 및 제어 샘플로 제공됩니다. 첫 번째 나누어지는이 단백 분해 효소 - 촉매 18 O-라벨에 대한 표준 샘플을 나타내며 proteolytic 절단 반응의 펩타이드 및 단백질 식별, proteolytic 활동 탐지 및 모니터링에 사용할 수 있습니다. 두 번째 나누어지는 18 O-정관은 단백 분해 효소에 의해 유도되는 표시하는 데 사용됩니다, 따라서,도 라벨이나 절단이 샘플에 대한 예상된다. </li><li> 반응 aliquots를 제거하고 데로 놈들을 찾을 때까지 반응에 따라시간 간격으로 5 단계에서 cribed는 것은 적합한 것 같습니다. 위에서 설명한 반응 조건은 최대 네 일 (약 24 곳)에 대한 proteolytic 반응을 모니터링하는 데 사용됩니다. 30 분까지 매 5 분 샘플링 시작한 다음 사일 때까지 8 시간 모든 8 시간 때까지 2 시간까지 매 30 분마다 시간을 발견. 절단 제품은 처음 12 시간 내에 나타납니다과 기판은 24 시간 후에 완전히 분해해야합니다. 확장 반응 배양 시간이 더 처리 반응 중간체에서 이산 아르 안정적인 반응 제품을 정의 할 수 있습니다. 야생 시간과 배양 온도는 최적의 반응 샘플링을 보장 할 수 조절을 위해 연구 질문 및 주어진 효소 기판 쌍에 있습니다 따라. </li><li> 최종 반응 시간 지점 발견되거나 (제 B) 아래에 설명 된대로 확장 야생 간격 사이에, 든 대상 플레​​이트는 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석에 제출 한 후. </li></ol> II. PALeO - TimeCourse : Postdigproteolytic 테르 미니 (Termini)의 estion 라벨 <ol><li> (선택 사항) 단백질 (10 μM) 및 펩티드 (250 μM)의 이황화 채권은 50 30 분 ° C.에 부화로 25 MM NH 4 HCO 3 (모두 신선하게 조리 된)에서 DTT (최종 농도 2.5 ㎜)로 감소 </li><li> (선택 사항) 무료 cysteines는 iodoacetamide과 alkylated합니다 (최종 농도를 10 MM) 25 MM에 NH 4 HCO 3 어둠 속에서 실온에서 30 분에 부화하여. </li><li> 관심 프로테아제에 따라, 단백질 / 펩타이드 솔루션은 잔류 버퍼와 알킬화 에이전트를 제거하는 청소 업 있어야합니다. 단백질 버퍼 교환을위한 펩타이드 정리와 Vivaspin 원심 선기에 대한 PepClean C-18 스핀 열을 사용하십시오. </li><li> Redissolve / 청소 업 펩타이드 제품 / 단백질 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에 (예 트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 교환 (예 : 트립신 완료의 관심 단백 분해 효소와와 다이제스트를 : 0.04 NM, 37 ° C, 12 시간). </li><li> PepClean C-18 스핀 열 정리 절단 제품. 이 단계는 잔류 단백 분해 효소 활동을 제거합니다. </li><li> Redissolve / (트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에서 청소 업 펩타이드 제품을 교환 1시 1분 (V / V) 마지막 H 2 18 O를 포함 </li><li> 이전 효소의 추가에 제로 시점 샘플을 철회 : 반응 혼합물 및 0.5 μl 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 매트릭스 (10 MG / 50 % 아세토 니트릴의 ML, 0.1 % TFA)의 믹스 0.5 μl합니다. 든 대상 접시에 자리 샘플을과 (5 분 정도) 건조 될 때까지 실온에서 용매 방울 둡니다. </li><li> 이 aliquots에 반응 솔루션을 분할. 특정 효소에 대한 실내 온도 권장 온도 : 첫 나누어지는이 관심 단백 분해 효소 (0.04 NM 예 트립신)에 incubated 수 있습니다. 두 번째 나누어지는이 단백 분해 효소없이 incubated되고 제어 될 것입니다. 첫 번째나누어지는이 단백 분해 효소 - 촉매 18 O-postdigestion 라벨에 대한 표준 샘플을 대표하는 펩타이드 및 단백질 정량화 사용할 수 있습니다. 두 번째 나누어지는 18 O-정관은 단백 분해 효소에 의해 촉매되는 표시하는 데 사용됩니다, 따라서 어떤 라벨이 샘플에 대한 기대하지 않습니다. </li><li> 반응 aliquots을 제거하고 그들에게 7 단계에 설명 야생하여 반응을 수행합니다.) 시간 간격으로는 적합 같습니다. 예를 들어, 우리는 트립신에 의해 촉매 카르 복실 산소 교환 반응을 모니터링하기 위해 그 후 처음 30 분, 매 15 분에 매 5 분을 발견. </li><li> 최종 반응 시간 지점 발견되거나 (제 B) 아래에 설명 된대로 확장 야생 간격 사이에 든 대상 플레​​이트는 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석에 제출 한 후. </li></ol> III. ALeO - TimeCourse : 카르 복실 그룹의 산 - 촉매 라벨 <ol><li> 1시 1분 (V / V) t 18 O-농축 물과 개별 펩티드 (50 NM)를 품다그 존재 또는 0.1 %의 부재 (제어) (V / V) 마지막 trifluoroacetic 산성 (총 볼륨 30 μl). </li><li> 샘플로 48일에 대한 일일 반응 제품을 직접 든 대상에 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 매트릭스 (10 MG / 50 % 아세토 니트릴의 ML, 0.1 % TFA)의 0.5μl과 혼합물의 0.5 μl 나누어지는을 공동 스포팅 판. </li><li> 야생 간격 사이 제 B.에서 아래에 설명 된대로 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석을 위해 든 대상 플레​​이트를 제출 최종 반응 시점의 스포팅 후 </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF는 MS / MS 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 질량 스펙트럼은 4,800 든 TOF / TOF 분석기 (AB SCIEX)에 인수되어 있습니다. </li><li> 이전 분석에, 악기는 ± 50 PPM과 일치이 6 봉우리의 최소 수의 최대 질량 측정 오류 허용과 펩타이드 표준 혼합 (AB SCIEX TOF / TOF 악기의 보정을위한 대중 표준 키트)로 교정된다. </li><li> MS 스펙트럼 (질량 범위2000의 허용 기준 피크 강도 범위 단계 크기 50 개) - 45,000, 400 - 3800 - 4,000미터 / Z)를 조절 레이저 강도 (3400과 긍정적 인 이온 모드를 사용하여 세중의에 인수되어 있습니다. 싱글 샷은 400 총 촬영 / 스펙트럼과 하위 스펙트럼에 대한 인수 아르, 800 하위 스펙트럼 후 효력 조건을 중지 (통과 또는 실패) 획득거나 400 하위 스펙트럼 패스 승인 기준. 낮은 풍부한 샘플의 경우 나 복잡한 생물학적 배경의 존재에 MS 감지 범위의 하단 끝은 800m / z로 제기해야합니다. 또한, LC 분리 또는 앞에서 설명한대로 샘플 정리 단계로 소금 및 기타 방해 물질을 제거해야 할 수도 있습니다. </li><li> MS 데이터 파일 (. t2d 파일)은 4000 시리즈 Explorer에서 데이터 수집 소프트웨어에서 수출 및 스펙트럼 처리 및 피크 검출을위한 마스코트 증류기 소프트웨어 (매트릭스 과학)를 활용하여 자사 실험실 정보 시스템으로 가져옵니다. Isotopic 봉투deconvoluted 자동으로 메이슨 외. 12 설명 및 그룹 9 적응 하나와 유사한 알고리즘을 사용하여 결정 18 O-정관 비율입니다. 또한, 이러한 ZoomQuant 13 바이퍼 14와 같은 소프트웨어 도구뿐만 아니라 상용 소프트웨어 패키지는 BioWorks 익스프레스 (열 피셔 과학)과 마스코트 증류기 Quantitation 상자로 (매트릭스 과학) 18 O 형 데이터 15,16를 deconvolute 할 수 있습니다. 18 O-설립 비율이 (예를 들면, 16를 포함하는 펩티드 각각의 펩타이드 동위 원소 종의 상대적 기여로 표현됩니다 O, 전체 isotopic 봉투 18 O 1 또는 18 O 2). </li><li> 각 TimeCourse 실험 들어, 분자 질량 ([M + H] +) 검색된 모든 펩타이드 종은 관련 MS 데이터 파일에서 추출하고 값은 100 PPM 질량 폭에 binned하는 것입니다. </li><li>최소 t 세 [M + H] + bin을 입력해야하도록 설정되어 있습니다. 알려진 기판의 경우, 필터링 빈 목록은 ExPASy FindPept 도구 17 조 (사용 기판 펩타이드 시퀀스에서 예측 proteolytic 절단 제품의 목록과 비교됩니다 <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) 및을 200 PPM 질량 오류 접수 허용. </li><li> MS / MS 스펙트럼은 FindPept 도구에 의해 그들과 관련된 18 O-incorporations이 빈 값에 대한 예측 절단 제품의 대량 값을 취득합니다. MS / MS 데이터가 오프 모드에서 고정 된 레이저 4,200의 강도와 CID-가스, 1kV 반사기 긍정적 인 이온 모드에서 4,800 든 TOF / TOF 분석기에 인수되어 있습니다. 50 발이 지점 40 하위 스펙트럼 (2,000 샷 / 지점의 총 항복)의 총에 하위 스펙트럼 당 무작위 패턴에 인수되어 있습니다. </li><li> MS / MS 데이터 파일 (. t2d 파일)은 4000 시리즈 Explo에서 수출 아르RER 데이터 수집 소프트웨어와 자사 실험실 정보 시스템에 수입은 봉우리가 발견되어 MS / MS 피크 목록은 해당 binned MS 데이터와 연결되어 있습니다. </li><li> 펩타이드 식별를 들어, MS / MS 피크 목록은 다음 검색 매개 변수를 사용하여 마스코트 검색 엔진을 사용하여 SwissProt 데이터베이스에 대해 검색하지 않습니다 : 더 효소 특이성, 150 PPM 전구체 이온과 0.2 다 조각 이온 질량 오차합니다. </li><li> 펩타이드 식별이 추가로 솁 첸코 외 의해 설명 된대로 Y-시리즈 조각 이온에 걸쳐 특성 18 O-결합 패턴을 확인하여 데이터 탐색기 소프트웨어 (AB SCIEX)를 사용하여 유효성을 검사 할 수 있습니다. 18. </li></ol> 스펙트럼 시간 18 O-정관 플롯의 C. 준비 스펙트럼 시간 플롯 :를 사용하여 각 반응 시간 지점에 대한 MS 데이터 파일 (. t2d 파일)로 데이터 탐색기 소프트웨어에서 내 보낸 ASCII-파일매크로와 데이터 분석 및 그래픽 소프트웨어 프로그램 (OriginLab의 예 유래)로 수입 폭포 플롯 (그림 3)으로 표시됩니다. 18 O-정관의 플롯 : 각 binned 펩타이드 절단 제품에 대한 개별 펩티드 동위 원소 종의 상대적 기여 (16 O, 18 O 1 또는 18 O 2) 모든 반응 시간 지점에서 추출하고 (그림 4) 시간이 역모를 꾸몄다.

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</ol>

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안정 동위 원소 라벨과 시간이 해결 방법으로 고해상도 질량 분광법을 결합하여 PALeO-TimeCourse 방법은 펩타이드 제품의 세대의 동적 분석을 할 수 있습니다. 분석은 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 안정적인 isotopically 표시 펩티드를 생성하고 proteotypic 펩티드가 생성되는이 반응 속도론을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, PALeO-TimeCourse는 특정하지 않다는 관련 조건 예를 생체에서 proteolytic 경로를 평가하기 위해 설계되었습니다. 내생 단백질, 펩티드 및 프로테아제뿐만 아니라 합성 펩티드 및 재조합 프로테아제는 워크 플로우에 활용 할 수 있습니다. 특정 proteolytic 조사 할 반응, 검정 조건 및 야생 시간에 따라이 반응 과정의 최적 샘플링을 제공하기 위해 조정할 수 있습니다. 우리의 경험에서는 (예를 들면 낮은 효소 농도를 사용하여, 방 다운 proteolytic 반응을 천천히 도움이 될 것입니다편리한 수동 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 물질의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> PepClean C-18 스핀 열 </td><td> 열 </td><td> 89,870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 든 대상 판 </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 든 TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 자료 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> 엔도 테린은 효소-1 (ECE-1) 변환 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 1784 - 아연 </td></tr><tr><td> 트립신 골드 </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> 물-18 O, 97 원자 % 18 O </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산 (TFA) </td><td> 열 </td><td> 28,904 </td></tr><tr><td> AB SCIEX TOF / TOF 악기의 보정을위한 대중 표준 키트 </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup&gt; 18</sup&gt; o 강화 물

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

안정 동위 원소는 생물 질량 분광법에 필수적인 도구입니다. 역사적으로, 18 O-안정 동위 원소는 광범위 1-3 proteolytic 효소의 촉매 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 대량 분석법 기반의 단백질 체학의 출현, 안정적 isotopically 풍부한 물 18 O-원자의 효소 - 촉매 결합은 양적 단백질 표현 수준을 (Fenselau 야오 4, 미야기와 라오 5 너희의 검토를 비교하는 인기있는 방법이되었다 외. 6). 18 O-라벨은 화학에 간단하고 저렴한 비용으로 대체 (예 : iTRAQ, ICAT)과 대사 (예 : SILAC) 분류 기술 7 간주됩니다. 활용 단백 분해 효소에 따라 18 O-라벨은 절단 제품 (3)의 C-터미널 카르 복실 그룹에 두 개의 18 O-원자까지의 설립 될 수 </sup&gt;. 라벨 반응은 두 개의 독립적 인 프로세스, 펩타이드 결합 절단과 카르 복실 산소 교환 반응 8로 세분화 할 수 있습니다. 우리의 PALeO (P rotease-18 O-강화 물을 mploying ssisted 난 abeling 전자) 효소 18 O-라벨의 적응, 우리는 독특한 동위 원소의 서명을 얻을을 50 % 18 O-농축 물을 활용. 고해상도와 함께 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화이 시간은 - 비행의 탠덤 질량 분석법 (MALDI-TOF/TOF MS / MS), 특성 동위 원소의 봉투 특이성의 높은 수준의 절단 제품을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 proteolytic 반응 할 10-11을 감지하고 특성화 내생 프로테아제를 9 모니터링 할 수 PALeO-방법론을 사용했습니다. PALeO는 proteolytic 절단 반응의 매우 본질을 인코딩 때문에, 실험 설정은 간단하고 생화학 enri입니다절단 제품의 chment 단계를 피할 수 있습니다. PALeO 방식을 쉽게 proteolytic 절단 반응의 역학 및 생리 조건을 나타내는 복잡한 생물 표본의 proteolysis의 (II) 분석을 모니터링은 (i) 시간 코스 실험로 확장 할 수 있습니다. PALeO - TimeCourse 실험은 복잡한 proteolytic 경로 반응의 속도 - 제한 처리 단계 및 반응 중간체를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, PALeO 반응은 우리가 이러한 자사의 절단 제품을 rebind 및 제 18 O-원자의 결합을 catalyze 할 수있는 세린 프로테아제 트립신과 같은 proteolytic 효소를 식별 할 수 있습니다. 이러한 &#39;이중 라벨&#39;효소 postdigestion 18 펩티드가 독점적 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 표시되는 O-라벨, 사용할 수 있습니다. 세 번째 전략은 효소 이상 18 O-농축 물을 고용 라벨 연장 18 O-안정 동위 원소 기호를 소개 산성 pH의 조건을 사용하여펩티드에 atures.

우리는 동적으로 proteolytic 효소에 의해 생성 된 펩타이드 절단 제품에 18 O-안정 동위 원소의 결합을 모니터링 할 PALeO-TimeCourse 워크 플로를 사용했습니다. 제시 방법은 비교적 다른 기판과 단백 분해 효소의 조합에 대해 proteolytic 처리 경로를 연구 할 수있는 다양한 도구입니다. 반응의 과정을 통해 반복적으로 proteolytic 반응을 샘플링하여 PALeO-TimeCourse 실험은 기판 및 제품 abundances의 시간 해결 스냅 샷 및 처리 정보를 제공합니다. 공동 야생 대상 접시에 산성 매트릭스 솔루션 샘플을하면 효소 반응과 매트릭스 결정이 더 샘플 구성을 보존하지 않습니다. 따라서, 시간 포인트는 소급 효소 반응의 결론 후 MALDI-TOF/TOF MS / MS에 의해 분석 할 수 있습니다. 이러한 실험 워크 플로우의 데이터 풍부한 자연을 수용하기 위해, 우리는 18 O-incorporat을 계산 반자동 생물 정보학 시스템을 구현각 펩타이드....

채용 안정 동위 원소 라벨 작업 흐름<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물 (LEO-워크 플로)는 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 다양한 도구입니다. (PALeO) 단백 분해 효소를 이용한 워크 플로우에서,<sup&gt; 18</sup&gt; O-원자는 프로테아제에 의해 중재 proteolytic 절단 및 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 소개되어 있습니다. 산 - 촉매 (ALeO) 워크 플로우에서,<sup&gt; 18</sup&gt; O-원자는 낮은 산도의 카르 복실 산소 교환에 의해 소개되어 있습니다.

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물

안정 동위원소는 생물학적 질량 분석법에서 필수적인 도구입니다. 역사적으로 18O 안정 동위원소는 촉매 작용을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 왔습니다...

본 프레젠테이션에서는 ^{18}O 농축수를 이용한 단백질 소화물 및 합성 펩타이드의 안정 동위원소 표지 워크플로를 시연합니다. 먼저 프로테아제 촉매 paleo 시계열 실험에서는 기질과 프로테아제를 50% ^{18}O 농축수가 포함된 조건에서 배양하여 ^{18}O 원자를 도입합니다. 그다음 프로테아제를 이용한 이중 표지법에서는 소화 후 생성된 절단 산물을 대상 프로테아제와 함께 50% ^{18}O 농축수 존재 하에 다시 배양합니다.EO 워크플로우는 정해진 시간 간격으로 산 촉매를 이용해 기능기에 산소 18 원자를 도입합니다. 질량 분석 데이터 획득 시 매트릭스가 포함된 반응 혼합물 분량을 몰드 타겟 플레이트에 점적하면, 펩타이드 절단 반응의 스펙트럼 시간 도표와 개별 펩타이드 종의 산소 18 도입 도표가 생성됩니다. 라벨링된 절단 생성물은 MS/MS 기반의 서열 확인을 위해 선택됩니다. 궁극적으로, 이러한 워크플로우는 정량적 및 정성적 프로테오믹스 연구를 위한 다각적인 도구를 제공합니다.이 방법은 복잡한 단백질 분해 경로에서 속도 제한 단계와 반응 중간체를 식별하는 것과 같이 프로테아제 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. paleo 시계열 분석을 통해 식별된 단백질 분해 시그니처는 기질 특이성에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 또한, 데이터의 타이머는 kinetic 정보 또한 활용합니다.이제 저희 실험실의 박사후 연구원이 해당 절차를 시연하겠습니다. paleo 시계열 워크플로우는 프로테아제에 의해 촉매되는 oxygen 18 통합을 기반으로 단백질 분해 절단 반응의 역학을 모니터링합니다. 20 µL 반응물에 oxygen 18이 풍부한 물이 포함된 프로테아제 반응 버퍼와 샘플 펩타이드를 추가하십시오. 반응 혼합물 0.5 µL를 매트릭스 0.5 µL와 혼합하여 opti to 3 84 maldi 타겟 플레이트에 점적하고, 용매 방울이 실온에서 마를 때까지 두십시오. 그동안 반응 혼합물을 두 개의 튜브로 나누십시오.시료 튜브를 위한 대조군과 시료를 준비합니다. 관심 있는 프로테아제를 첨가하고 권장 효소 반응 온도에서 배양합니다. 지정된 시간 지점별로 첨가합니다.0.5 µL의 aliquot를 취해 0.5 µL의 매트릭스와 혼합한 후 multi targett 플레이트에 점적합니다. 이후 이 paleo post digestion labeling 워크플로우에서 설명하는 바와 같이 MALDI-TOF MS

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

효모 사카로미세세스 세레비시아에서새로 전사된 RNA를 민감하게 그리고 구체적으로 정화하기 위해 티오레이드 우라실을 사용한다.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

배우세요 단백질 소화물의 안정 동위원소 라벨링 워크플로우를 18O 강화 물을 사용하여 프로테아제 및 산 촉매 방법으로 수행하는 기술을. 질량 분석을 통해 정량 및 정성 프로테오믹스 연구에 활용할 수 있습니다.

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로

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