'단일 바이러스 게놈'을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석
May 26th, 2013
단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.
이 절차의 전반적인 목표는 혼합 컨소시엄에서 단일 변종을 분리하고 얻은 게놈 물질을 염기서열 분석하여 배양 없이 다양한 환경에서 바이러스를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 flow의 cytometric sorting을 사용하여 aro beads에 대한 단일 varian을 분리함으로써 수행됩니다. 그런 다음 단일 이온 캡처는 컨포칼 현미경으로 검증됩니다.
다음으로, 게놈 물질은 이온에서 분리되고 다중 변위 증폭 또는 MDA를 사용하여 증폭되어 염기서열분석에 필요한 DNA의 양을 생성합니다. 마지막으로, 바이러스 DNA는 고처리량 기술을 사용하여 염기서열 분석을 통해 비리온 게놈의 과도한 커버리지를 생성하여 게놈 조립 및 주석을 실질적으로 지원합니다. 궁극적으로, 염기서열 하위 샘플링 접근 방식을 사용하여 콘 크기를 늘리는 것을 목표로 하는 생물정보학 기술은 분리된 von을 분석할 수 있습니다.
이 방법은 주석이 달린 OC 플랑크톤 유전자의 방대한 풀에 게놈 컨텍스트를 부여하고 다양한 생태계에서 새로운 게놈을 발견할 수 있도록 함으로써 바이러스 생태학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 단일 이온의 증폭 및 분리가 현재 기술의 한계를 밀어붙이고 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 Vero 플랑크톤 군집에서 MDA의 사용을 평가하면서 단일 바이러스 입자와 염기서열을 분류하여 이러한 복잡한 군집으로부터 완전한 바이러스 게놈을 조립할 수 있다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 맞춤형 전방 산란 광전자 증배관 또는 F-S-C-P-M-T가 장착된 유세포 분석기를 사용하여 바이러스를 분류하려면 먼저 0.1미크론 여과된 트리스에서 바이러스 입자를 희석하는 것으로 시작합니다. T 4 및 람다 파지 입자를 포함하는 혼합 집합체에 대한 EDTA는 F-S-C-P-M-T를 1000으로, SSC를 200으로 설정하여 신호 대 잡음비를 최대화합니다.
대조군 샘플을 실행한 후 약 100마이크로리터의 지속적인 바이러스 현탁액을 총 5, 000개의 이벤트로 실행합니다. 그런 다음 사이버 그린 플롯과 F-S-C-P-M-T 플롯을 사용하여 바이러스 입자의 중심에 단단한 게이트를 배치합니다. 이제 섭씨 37도로 냉각된 TBE 완충액에 1%낮은 융점 아라로 된 5마이크로리터를 A-P-T-F-E 현미경 슬라이드의 각 웰에 추가한 다음 슬라이드를 유세포 분석기에 로드하여 분류된 바이러스 입자를 포착합니다.
분류를 시작하고 일부 웰에서 10개 이상의 바이러스 입자 이벤트를 캡처하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사 중에 바이러스의 깊이를 감지하는 데 도움을 줍니다. 분류가 완료되면 유세포 분석기에서 슬라이드를 제거하고 각 웰에 섭씨 37도로 냉각된 저융점 aros 5마이크로리터를 더 추가합니다. 단일 변이에 대한 바이러스 입자 내장.
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 488나노미터로 설정합니다. 그런 다음 여기(Excitation)는 63 x long working distance objective를 사용하여 포함된 입자를 이미지화하여 단일 입자만 존재하고 여러 바이러스가 서로 겹쳐져 있지 않은지 확인합니다. 그런 다음 단일 바이러스가 있는 웰이 확인되면 면도날을 사용하여 슬라이드에서 원하는 아그로스 비드를 제거하고 멸균 PCR 튜브에 넣습니다.
섭씨 94도로 설정된 열순환기의 열 블록에 튜브를 3분 동안 놓아 바이러스 입자를 현장에서 이빨을 제거합니다. 그런 다음 변형 된 MDA를 수행 한 후 게놈 DNA를 1.7 밀리리터 einor 튜브로 옮기고 TBE 버퍼에 3 몰 아세트산 나트륨의 10 번째 부피를 첨가하여 증폭 된 게놈 물질을 정제하기 위해 샘플을 섭씨 55도에서 10 분 동안 놓고 aros를 용해 한 다음 튜브를 섭씨 42도로 이동하여 효소를 추가하기 전에 온도를 낮춥니다. 이제 각 튜브에 두 단위의 베타 아아제를 추가하고 튜브를 2시간 동안 배양합니다.
그런 다음 각 튜브에 한 부피의 완충액 포화 페놀 용액을 추가합니다. 강렬하게 혼합하고 실온 G.At 3, 500배 튜브에서 15분 동안 튜브를 원심분리한 후 SUPERLABANTS가 포함된 DNA를 새로운 1.7ml einor 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 튜브에 100% 이소프로판올 1부피와 글리코 블루 1마이크로리터를 추가하고 튜브를 다시 원심분리한 후 튜브를 뒤집어 혼합합니다.
이번에는 28, 000 번 G 및 섭씨 4도에서 60 분 동안. 이소프로판올을 디캔팅하여 펠릿을 방해하지 않도록 하고 각 튜브에 150마이크로리터의 70% 에탄올을 추가합니다. 튜브를 10분 동안 28, 000회 돌립니다.
G 실온에서. 에탄올을 공기 건조시키고 DNA 펠렛을 디캔팅하고 적절한 양의 트리스 EDTA 완충액에 DNA를 재현탁시킵니다. 농업 속도 내에서 사이버 녹색, 하나의 염색된 바이러스 입자의 3차원 재구성은 컨포칼 레이저 현미경을 사용하여 포획되어 아로스에 삽입된 후 각 웰에서 단일 비리온이 얻어지는 것을 시각화하고 확인하는 방법을 보여주며, 삽입물은 분리된 바이러스 입자의 더 높은 배율을 보여줍니다.
다음은 aros bead 내에서 염색된 단일 바이러스 입자의 상대적 형광에 대한 프로필 플롯입니다. 이 마지막 일련의 그림은 처음 5개의 염기쌍을 제외한 거의 모든 람다 게놈이 이 대표적인 바이러스에 대해 어떻게 복구되었는지 보여줍니다. 다음은 단일 바이러스에 대한 GC 플롯입니다.
확인된 게놈이 표시됩니다. 이 그림은 람다의 게놈 맵을 보여줍니다. 마지막으로, 대표적인 분리 및 증폭 박테리아 파지 람다에 대한 단일 바이러스 게놈 매핑이 표시됩니다.
X축은 게놈 위치를 나타냅니다. Y축은 백분율 적용 범위를 표시합니다. 이 절차를 시도할 때는 멸균 기술을 사용하고 시간을 들여 오염을 방지하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 전체 게놈 염기서열분석 전에 분리된 varians의 분류학을 평가하기 위해 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 활성화 세포 분류, 컨포칼 현미경 검사 및 전체 게놈 증폭을 사용하여 단일 변종을 분리하는 방법을 잘 알게 되었을 것입니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
개요
Single Virus Genomics (SVG)는 혼합된 바이러스 현탁액으로부터 단일 바이러스의 게놈을 분리하고 증폭하도록 설계된 방법입니다. 이 기술은 분류를 위해 유세포 분석법을 사용하고, 전체 게놈 증폭을 위해 다중 변위 증폭 (MDA)을 이용하여 후속 시퀀싱을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 유전체학
- 미생물학
배경
- 단일 바이러스를 분리하여 배양 없이 바이러스 게놈을 연구할 수 있습니다.
- 유세포 분석법은 바이러스를 아가로스 비드로 분류하는 데 사용됩니다.
- 공초점 현미경은 단일 바이러스의 포획을 검증합니다.
- 고처리량 시퀀싱 기술은 게놈 분석에 사용됩니다.
연구 목적
- 혼합된 컨소시움으로부터 단일 바이러스를 분리합니다.
- 바이러스 식별을 위한 게놈 물질을 시퀀싱합니다.
- 생물정보학을 통해 게놈 어셈블리와 주석을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 바이러스 현탁액의 유세포 분류.
- 포획된 바이러스로부터 게놈 물질의 분리.
- DNA 증폭을 위한 다중 변위 증폭 (MDA).
- 포괄적인 게놈 커버리지를 위한 고처리량 시퀀싱.
주요 결과
- 혼합 샘플로부터 단일 바이러스의 성공적인 분리.
- MDA를 통한 시퀀싱을 위한 충분한 DNA 생성.
- 게놈 어셈블리를 돕는 높은 커버리지 시퀀싱.
- 데이터 분석을 위한 생물정보학 기술의 적용.
결론
- SVG는 다양한 환경에서 바이러스 게놈을 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 방법은 처리 중 게놈 절단을 감소시킵니다.
- 생물정보학은 분리된 바이러스의 분석을 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Single Virus Genomics (SVG) enables cultivation-free genomic characterization of individual virions, addressing a critical gap in viral ecology and discovery pipelines. By isolating and amplifying single viral genomes from complex mixtures, SVG supports target de-risking and predictive confidence in early-stage antiviral and phage therapy research. This method enhances portfolio relevance by providing high-resolution genomic data from unculturable viruses, informing mechanistic studies and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral hypotheses by providing genomic context to individual virions from mixed environmental samples.
- Operational Value: Supports biological de-risking through cultivation-free isolation, reducing false negatives in target identification.
- Predictive Value: Generates high-coverage sequencing data that aids in genome assembly and annotation, improving confidence in viral target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-molecular-weight genomic DNA via MDA, enabling reliable downstream sequencing and comparative analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through flow cytometry-based sorting and confocal validation, ensuring reproducible single-virion capture.
- Scalability: Allows processing of thousands of events via flow cytometry, supporting high-throughput screening of viral diversity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viral genome data to preclinical validation by enabling sequence-based taxonomy and functional inference.
- Biomarker Alignment: Supports identification of viral genomic signatures that may correlate with pathogenic potential or host interaction profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in viral target selection through direct genomic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
SVG fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and target validation prior to lead identification and preclinical evaluation. Its output—amplified, sequencable viral DNA—directly enables genomic screening and comparative analytics workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating single virons for genomic interrogation, clarifying viral diversity and functional potential in complex communities.
- Screening: Enables assay standardization through flow sorting and MDA amplification, providing reproducible inputs for sequencing-based screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative genomic outputs (coverage, GC content, genome maps) that allow cross-condition comparison and variant calling.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing genome-resolved data that can inform biomarker development and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for viral genome characterization across diverse ecosystems, reducing reliance on cultivation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in viral target validation by delivering cultivation-free, genome-resolved data from single particles.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through validated single-virion capture via flow cytometry and confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of viral targets, reducing investment in non-viable or poorly characterized candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence genomic data that informs advancement decisions in antiviral and phage-derived therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, confocal microscopy, and molecular biology for single-particle handling and amplification.
- Dependent on access to flow cytometers with custom scatter detection and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation, contamination control, and bioinformatic analysis across teams.
- Must account for variability in viral size, density, and staining efficiency when adapting to diverse viral systems or environmental samples.
- Practical limitations include amplification bias and stochastic sampling effects inherent to single-cell/single-virion MDA approaches.
