'단일 바이러스 게놈'을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

이 절차의 전반적인 목표는 혼합 컨소시엄에서 단일 비리온을 분리하고, 획득한 게놈 물질을 시퀀싱하여 배양이 필요 없이 다양한 환경의 바이러스를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 유세포 분석 정렬을 통해 아가로스 비드 위에 단일 비리온을 분리함으로써 수행됩니다. 이후 공초점 현미경을 통해 단일 비리온 캡처 여부를 검증합니다.

다음으로, 비리온에서 게놈 물질을 분리하고 다중 치환 증폭법(multiple displacement amplification, MDA)을 사용하여 증폭함으로써 시퀀싱에 필요한 양의 DNA를 생성합니다. 마지막으로, 고처리량 기술을 사용하여 바이러스 DNA를 시퀀싱하여 비리온 게놈의 충분한 커버리지를 확보하며, 이는 게놈 조립 및 주석 달기에 크게 기여합니다. 최종적으로, 컨티그 크기를 늘리기 위해 시퀀스 서브샘플링 접근법을 사용하는 생물정보학적 기법을 통해 분리된 비리온의 분석이 가능해집니다.

이 방법은 주석이 달리지 않은 방대한 비리플랑크톤(virioplankton) 유전자 풀에 게놈 맥락을 제공함으로써 바이러스 생태학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 다양한 생태계로부터 새로운 게놈을 발견할 수 있게 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 단일 비리온의 증폭 및 분리가 현재 기술의 한계에 가깝기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 당사는 비리플랑크톤 군집에 MDA를 사용하는 방법을 평가하던 중, 이러한 복잡한 군집에서 단일 바이러스 입자를 분리하여 시퀀싱하고, 이를 통해 완전한 바이러스 게놈을 조립하는 것이 가능하다는 점을 깨닫고 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 맞춤형 전방 산란 광전증배관(FSCPMT)이 장착된 유세포 분석기를 사용하여 바이러스를 분리하십시오. 먼저 0.1 µm 필터링된 tris-EDTA로 바이러스 입자를 희석합니다. T4 및 람다 파지 입자가 포함된 혼합 집합체의 경우, 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 FSCPMT를 1000으로, SSC를 200으로 설정하십시오.

대조군 샘플을 실행한 후, 염색된 바이러스 현탁액 약 100 µL를 총 5,000 events가 될 때까지 실행합니다. 그런 다음 sybr green one 및 FSCPMT 플롯을 사용하여 바이러스 입자의 중앙에 좁은 게이트를 설정합니다. 이제 37 °C로 냉각된 TBE 버퍼 내 1% 저융점 아가로스를 PTFE 현미경 슬라이드의 각 웰에 5 µL씩 추가하고, 슬라이드를 유세포 분석기에 로드하여 분리된 바이러스 입자를 포집합니다.

정렬을 시작하여, 공초점 레이저 주사 현미경으로 바이러스의 깊이 검출을 용이하게 하기 위해 일부 웰에 10개 이상의 바이러스 입자 이벤트가 캡처되도록 합니다. 정렬이 완료되면 슬라이드를 유세포 분석기에서 제거하고, 바이러스 입자가 포함된 각 웰에 37 °C로 냉각된 저융점 아가로스 5 µL를 추가로 넣습니다. 단일 비리온의 경우, 공초점 레이저 주사 현미경의 여기 파장을 488 nm로 설정합니다. 그런 다음 63 x 장작동거리 대물렌즈를 사용하여 임베딩된 입자를 촬영함으로써, 단일 입자만 존재하며 여러 바이러스가 서로 겹쳐 있지 않은지 확인합니다. 단일 바이러스가 포함된 웰이 식별되면, 면도날을 사용하여 슬라이드에서 원하는 아가로스 비드를 제거하고 이를 멸균 PCR 튜브에 넣습니다.

바이러스 입자를 제자리에서 용해시키기 위해 튜브를 94 °C로 설정된 써모사이클러의 히트 블록에 3분 동안 둡니다. 그 후, 변형된 MDA를 수행한 다음 게놈 DNA를 1.7 mL Eppendorf 튜브로 옮기고, 증폭된 게놈 물질을 정제하기 위해 TBE 버퍼 내의 3 M sodium acetate를 전체 부피의 1/10만큼 첨가합니다. 샘플을 55 °C에서 10분 동안 두어 아가로스를 용해시킨 다음, 효소를 첨가하기 전에 온도를 낮추기 위해 튜브를 42 °C로 옮깁니다. 이제 각 튜브에 2 unit의 Beta-agarase를 첨가하고 튜브를 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 각 튜브에 완충 포화 페놀 용액을 1부피만큼 첨가합니다. 격렬하게 혼합하고 실온에서 3,500 ×g로 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. DNA가 포함된 상층액을 새로운 1.7 mL Eppendorf 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 튜브에 100% isopropanol 1부피와 glyco-blue 1 µL를 첨가하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 이번에는 4 °C에서 28,000 ×g로 60분 동안 튜브를 다시 원심분리한 후, 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 isopropanol을 따라내고 각 튜브에 70% ethanol 150 µL를 첨가합니다. 실온에서 28,000 ×g로 10분 동안 튜브를 회전시킵니다. ethanol을 따라내고 DNA 펠렛을 공기 건조시킨 후, 적절한 부피의 tris-EDTA 완충액에 DNA를 재현탁합니다. 아가로스 비드 내의 sybr green I 염색된 바이러스 입자를 3차원 재구성한 이 영상은, 공초점 레이저 현미경을 사용하여 각 웰에서 아가로스에 포획 및 매립된 단일 비리온을 시각화하고 확인할 수 있음을 보여주며, 삽입도는 분리된 바이러스 입자를 더 높은 배율로 보여줍니다.

여기 아가로스 비드 내에 염색된 단일 바이러스 입자의 상대적 형광 프로파일 플롯이 표시되어 있습니다. 이 마지막 그림 시리즈는 처음 5개 염기쌍을 제외하고 람다 게놈의 거의 전체가 이 대표 바이러스에서 어떻게 회복되었는지를 보여줍니다. 여기 식별된 단일 바이러스 게놈의 GC 플롯이 표시되어 있습니다. 이 그림은 람다의 게놈 지도를 보여줍니다. 마지막으로, 대표적으로 분리 및 증폭된 박테리오파지 람다에 대한 단일 바이러스 게놈의 매핑이 표시되어 있습니다. X축은 게놈 위치를 나타냅니다. Y축은 커버리지 백분율을 나타냅니다.

본 절차를 수행할 때는 멸균 기술을 사용하는 것이 중요하며, 오염이 발생하지 않도록 충분한 시간을 들여 확인해야 합니다. 본 절차 이후, 전장 유전체 염기서열 분석을 수행하기 전 분리된 비리온의 분류학적 특성을 평가하기 위해 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 형광 활성 세포 분류법, 공초점 현미경 및 전장 유전체 증폭법을 이용하여 단일 비리온을 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.