Name: 다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 배우세요 NADPH 산화 효소 유래 활성산소종을 생체 내에서 실시간으로 모니터링하는 최소 침습적 생체영상 기법을. 세 가지 염증성 마우스 모델에서 ROS 동역학을 연구하여 염증 질환의 치료 전략 수립에 기여합니다.

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이 작품은 NIH RO1 AI079253 및 보훈학과로 운영되었습니다.

1. 동물 모델 <ol><li> 마우스 : p47 phox-/를 사용하여 - 마우스와 연령 및 성별 - 일치 C57BL6/DBA 마우스입니다. 기관 동물 케어 및 사용위원회의 실험에 대한 승인을 얻습니다. </li><li> 마취 : 마취를 유도하기 위해 지속적인 isoflurane 관리 시스템을 사용합니다. vaporizer 시스템 (VetEquip)는 (2-3 %) isoflurane으로 가득합니다. 쥐가 외부 자극에 대한 응답으로 호흡, 운동, 그리고 각막 반사를 관찰하여 완전히 anesthetized되어 있는지 확인. </li><li> 수술 절차 : 70 %의 에탄올과 수술 영역 (benchtop)을 씻어. 멸균 장갑과 깨끗한 수술 가운과 마스크를 착용하십시오. 머리를 클리핑하고 절개가 이루어집니다 영역에 70 %의 에탄올과 교류 betadine을 적용하여 마우스를 준비합니다. 멸균 표면에 수술을 수행하고 멸균 악기를 사용합니다. 모니터 마우스는 사후 operatively까지 깨어 자유롭게 이동. </li><li> Intratracheal zymosan 관리 <ol><li> 마취를 관리로 1.2에 설명되어 있습니다. </li><li> betadine과 70 %의 에탄올과 수술 영역 (목) 소독 및 수술 절개로 기관을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 피어스 27 게이지 바늘로기도하고 멸균 PBS에 용해 0.5 μg / μl 솔루션을 (25g 마우스에 대한 총 판매량 50 μl)를 사용하여 1 μg / g의 용량에 zymosan (세인트 루이스, MO)를 주입. </li><li> 닫기 쥐 목 무균 조건 하에서 5-0 멸균 실크 봉합과 상처. </li><li> 4 시간, 24 시간 후 이미지. </li></ol></li><li> Cecal 결합과 주사 <ol><li> 1.2에 설명 된대로 마취를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 수술 영역 (복부)에 머리를 클립하고 betadine과 70 % 에탄올로 소독. </li><li> 중간 선 개복술을 수행하고이게 맹장을 식별합니다. </li><li> 4-0 실크 봉합사와 21 게이지 바늘 중 하나를 패스 결합으로 말초 찔린이게 맹장과 노출이게 맹장의 말초 50 %를 Ligate. </li><li> 4-0 멸균 실크 봉합과 절개를 닫습니다. </li><li> 4 시간 후 이미지와24 시간. </li></ol></li><li> 구강 탄소 tetrachloride (CCL 4) 관리 <ol><li> 1.2에 설명 된대로 마취를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 구두 gavage으로 옥수수 기름에 용해 CCL 네 (2 μg / g, 세인트 루이스, MO)를 관리 할 수 있습니다. CCl4 행정 절차는 IBC / EHS 정책에 따라 지정된 지역에서 수행해야합니다. </li><li> 4 시간, 24 시간 후 이미지. </li></ol></li></ol> 2. 발광 생물 이미지를 취득 <ol><li> 발광 모드로 설정 IVIS 200 (Xenogen 공사, 알라 메다, CA) 이미징 시스템을 초기화하고, 전하 결합 소자 (CCD) 잠글 온도 기다립니다. </li><li> 노출 시간, binning (중간) 및 F / 정지 (8) 설정을 선택합니다. </li><li> 정상적인 체온을 유지하기 위해 온수 무대에서 이미징 챔버에서 위로 향한 위치에 배치 마우스. 쥐가 IVIS 이미징 챔버에있는 동안 코 콘을 통해 1.2에 설명 된대로 마취를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> L-012를 관리<html> (20 μg / g) 이미지에 대해 선택한 각 시점에서 역 궤도 분사를 통해 intravenously 멸균 PBS (10 μg / μl)에 용해. </li><li> L-012 주입 후 2 분에 시작 이미지를 캡처합니다. 우리는 일반적으로 40 초 노출을 사용합니다. </li></ol> 3. 관심 지역을 사용하여 데이터 분석 <ol><li> 생활 이미지 소프트웨어에게 v.4.2을 (Xenogen 공사, 알라 메다, CA)를 사용하여 데이터를 분석합니다. </li><li> 이미지를 열고 관심 툴의 지역 측정을 선택합니다. </li><li> 가슴 또는 / 및 마우스의 사진 이미지 위에 의사 색 디지털 이미지 (광자 검출을 대표하는) 오버레이 한 ​​후 복부 이상 관심 모양과 크기의 지역을 선택합니다. </li><li> 관심 지역에서 신호 강도 (광자 플럭스)를 정량화. </li></ol> 4. 통계 <ol><li> 개인 시간 지점에서 Bonferroni 사후 테스트를 양방향 ANOVA를 수행하는 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용합니다. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. 대표 결과 Zymosan는 프로 염증성 효모 세포벽 제품 및 NADPH 산화 효소 3의 강력한 활성입니다. 우리는 이전에 해당 intratracheal zymosan는보다 강력한 neutrophilic 폐 염증과 p47 phox-/에서 프로 염증성 시토 킨 생산을 유도했다 - 마우스에게 1 wildtype에 비해. zymosan 도전 다음 마우스 - 여기, 우리의 목표는 wildtype와 p47 phox-/의 폐에 ROS 생성을 비교하는 것이 었습니다. 4 H 및 24 시간에서 마우스 - 4 시간에서 intratracheal zymosan 관리 한 후, 우리는 기준뿐만 아니라 p47 phox-/에 비해 wildtype의 광자 방출의 증가에 비해 wildtype 쥐 가슴 광자 방출에 상당한 증가를 관찰했다. 반면, p47 phox-/에서 bioluminescence 신호 - 마우스 zymosan 처리 (Fig.1 AB) 이후 4 시간에서 기본 수준에서 유지. 따라서, NADPH 산화 효소는 B에 나타납니다전자 zy​​mosan 관리에 따라 폐의 ROS 생성의 주요 소스. 다음, 우리는 CLP 유발 패혈증 모델에서 ROS 생산도 평가합니다. 패혈증은 급성 폐 손상 (ALI)과 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 4, 5 등의 최종 장기 손상과 관련된 생명을 위협하는 증후군이다. ROS로 인한 부상은 패혈증 유발 다중 장기 부전을 유도하는 중요한 요소로 간주되었습니다. 우리는 ROS가 크게 가슴 (4 시간) 이상 및 기준에 비해 wildtype 쥐 CLP에 따라 복부 (24 시간) 이상 증가 된 것으로 나타났습니다. 그러나, p47 phox-/에서 ROS 수준 - 마우스는 시간 포인트 (Fig.2 AC) 모두에서 기본 수준과 비슷했다. 이러한 결과는 CLP 유발 패혈증 마우스 모델에서 ROS 생성이 산화 효소에 의존 NADPH입니다 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 CCL 4 유발 간 손상 모드에서 ROS 생산을 감지하는 발광 생물 이미징을 사용하여리터. CCL 4 간세포 괴사가 발생하고, 급성 간 손상과 간 섬유증 6을 모두 모델링하는 데 사용되었습니다. CCL 4 행정에 따라 4 H의 마우스 - 염증과 부상 이전에 설명 모델에 대조적으로, 우리는 복부에서 ROS 생산 (35 %) p47 phox-/에서 기준이 지남에 따라 증가하는 겸손 것으로 나타났습니다. 마우스 (Fig.3 AB) - 그러나, 4 - 유도 ROS 생성 CCL의 크기는 p47 phox-/에서보다 wildtype 쥐 훨씬 더했습니다. 이러한 데이터는 모두 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의존하고 독립적 인 ROS 생성은 급성 CCL 4 유발 간 손상에서 발생하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> zymosan 치료 후 폐의 그림 1. ROS 생산. A) 대표 bioluminescenROS 생산의 CE 이미지. 마우스 및 복부 발광이 zymosan 치료에 의해 ​​변경되지 - 가슴뿐만 아니라, 발광는 wildtype와 p47 phox-/ 모두의 복부 이상 감지 값입니다. wildtype 및 p47 phox-/의 가슴에서 B) 광자 카운트 - zymosan의 (IT) intratracheal 단일 분사 한 후 마우스. Bioluminescence 이미징은 기본, 4 H,, 24 H에서 수행되었다. 가슴 관심 지역의 발광은 지정된 의사 색 척도를 이용하여 확인되었다. 결과는 의미로 제공됩니다 ± SE, N = 6-9 그룹 당, * = P &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> 그림 2. ROS 감지는 다음 CLP. ROS 생산, B의 A) 대표 bioluminescence 이미징) 광자 가슴에서 카운트 wildtype와 p47 phox-/의 복부에서 C) 광자 카운트 - 기준에서 마우스, 4 시간, 그리고 CLP 후 24 시간. 결과는 의미로 제공됩니다 ± SE, N = 그룹 당 4-5, * = P &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> CCL 후 복부 4 유발 간 손상의 그림 3. ROS 생산. 구두 CCL 네 치료 후 기준선에서 마우스, 4 시간, 24 시간 - ROS 생산 및 wildtype와 p47 phox-/의 복부에서 B) 광자 카운트의 A) 대표 bioluminescence 이미징. . N = 4-5 당 그룹, * = P &lt;0.05, 결과는 의미 ± SE로 표시됩니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">보시려면 여기를 클릭하세요 큰 그림</a> </&gt;.

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

생활 동물 반응성 산소 종의 &quot;실시간&quot;측정 (ROS)는 형광등과 chemiluminescent 프로브를 사용하여 달성 될 수있다. 형광 프로브가 약 신호 대 잡음 비율 12 문제에서 고통 있지만, 설명 된 이미징 기술은 루미놀 기반의 기판 L-012와 ROS의 화학 반응에 따라 발광을 검출에 대한 더 많은 문자를 구분합니다. 모든 발광 생물 이미징 기술과 마찬가지로,이 방법론은 기관과 조직에 의해 파장에 의존 광 흡수와 산란에 의해 제한됩니다. 마우스 -이 실험은 wildtype와 p47 phox-/에서 ROS의 측정을 위해 적절한 실험 조건을 확립에 초점을 맞추고 있었다. 이러한 유전자 변형 마우스의 사용은 ROS는 다른 경로에 의해 생성 된 ROS에서 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의해 생성 된 차별화 할 수있게. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> 와코 화학 물질 USA 주식회사 </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> 시그마, 세인트 루이스, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> 탄소 tetrachloride </td><td> 시그마, 세인트 루이스, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

다른 동물 모델에서 nadph 산화 효소 활동의 bioluminescence 영상

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH 산화 효소는 항균 및 항 곰팡이 호스트 방어를 mediates 중요한 효소이다. 항균 호스트 방어에서의 역할뿐만 아니라, NADPH 산화 효소는 염증 반응 1 변조 중요한 신호 기능이 있습니다. 따라서, NADPH 산화 효소 파생 ROS 생성의 &quot;실시간&quot;동역학에 측정 할 수있는 방법의 개발은 방위, 염증, 그리고 부상을 개최 할 관련 메커니즘을 이해하는 중요한 연구 도구가 될 것으로 예상된다. 만성 granulomatous 질환 (CGD)는 심각한 감염과 과도한 염증을 특징으로 NADPH 산화 효소의 상속 장애입니다. 식세포 NADPH 산화 효소의 활성화는 cytosolic subunits (p47 phox, p67 phox, 그리고 p40 phox)과 막에 바인딩 flavocytochrome (gp91 phox와 P22 phox heterodimer로 구성)에 RAC의 translocation이 필요합니다. 손실CGD에서 이러한 NADPH 산화 효소 구성 요소 결과의의 기능 변이. CGD 환자와 마찬가지로, gp91 phox - 결함 마우스와 p47 phox - 결함 마우스에 결함이 식세포 NADPH 산화 효소 활동 및 장애인 호스트 방어 13, 14가 있습니다. 위에 설명 된 NADPH 산화 효소의 구성 요소가 포함 phagocytes,뿐만 아니라 다른 세포 유형의 다양한 NADPH 산화 효소의 다른 isoforms을 표현한다. 여기, 우리는 생활 마우스에서 ROS 생산을 수량화하고 염증과 부상의 모델에서 ROS 생성에 NADPH 산화 효소의 노력이 윤곽을 그리다 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 전하 결합 소자 (CCD)에 의해 기록되어 발광을 방출하기 위해 L-012 (루미놀의 아날로그)와 반응 ROS에 기반을두고 있습니다. L-012 프로브의 원래 설명에, L-012에 따라 달라 chemiluminescence은 완전히이 반응에서 검색된 메인 ROS는 슈퍼이라고 표시, 초과 산화물의 dismutase에 의해 폐지되었다산화물 음이온 15. 후속 연구는 L-012은 반응성 질소 종 16, 17 등 다른 자유 래디칼을 감지 할 수 것으로 나타났습니다. Kielland 외. 17 phorbol myristate 아세테이트, NADPH 산화 효소의 강력한 활성,의 주제 응용 프로그램이 발광 프로브 L-012를 사용하여 마우스에서 발견 할 수 산화 효소에 의존 ROS 생성을 NADPH는 생각이 들어서 보여 주었다. 이 모델에서, 그들은 L-012-의존 발광는 p47 phox - 결핍 생쥐에서 폐지 된 것으로 나타났다. 우리는 wildtype 마우스와 NADPH 산화 효소 - 결함 p47 phox-/에서 ROS 생성 비교 - 다음과 같은 세 가지 모델의 생쥐 2 : zymosan, NADPH 산화 효소를 활성화 할 수 있습니다 벽 파생 제품 프로 염증 곰팡이 세포의 1) intratracheal 관리, 2) cecal 결합과 주사 (CLP), 보조 급성 폐 염증과 부상으로 간 복부 패혈증의 모델, 그리고 3) 구두 탄소 tetrachloride에게(CCL 4) ROS에 의존 간 부상의 모델입니다. 이 모델은 특히 각각, 비 전염성 염증, polymicrobial 패혈증 및 독소 유발 장기 부상의 맥락에서 NADPH 산화 효소에 의존 ROS 생성을 평가하는 선정되었다. p47에 wildtype 마우스에 bioluminescence을 비교 phox-/ - 마우스 우리는이 모델의 발광 생물 신호에 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의해 생성 된 ROS의 특정 공헌을 윤곽을 그리다 수 있습니다. p47에 비해 wildtype 쥐 증가 ROS 수준을 보여 Bioluminescence 이미징 결과는 phox-/ - 마우스는 NADPH 산화 효소는 염증 자극에 대한 응답으로 ROS 생성의 주요 원천입니다 지적했다. 이 방법은 생체 내 염증 동안 ROS 생성의 &quot;실시간&quot;모니터링을위한 최소한 침해 접근 방식을 제공합니다.

NADPH 산화 효소가 phagocytes에서 반응성 산소 종의 주요 소스 (ROS)입니다. 때문에 ROS의 임시 자연의, 그것은 생활 동물의 ROS 수준을 측정하고 모니터링하기가 어렵습니다. 생활 쥐 ROS의 일련 정량화하기위한 최소한 침입 방법 설명되어 있습니다.

다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상

NADPH 산화효소는 항균 및 항진균 숙주 방어를 매개하는 핵심 효소입니다. 항균 숙주 방어에서의 역할 외에도, NADPH...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 세 가지 서로 다른 염증성 마우스 모델에서 N-A-D-P-H oxidase 유래 활성 산소종(reactive oxygen species) 또는 ROS 생성을 실시간으로 모니터링하기 위한 최소 침습적 방법을 제공하는 것입니다. 첫 번째 모델은 기관 내 Xan 투여로, 전신 마취된 마우스의 기관에 전염증 분자인 Xan을 주입합니다. Xan은 N-A-D-P-H oxidase를 활성화할 수 있는 진균 세포벽 유래 생성물입니다.두 번째 모델은 결찰 및 천공 또는 CLP 모델입니다. 이 모델에서는 마우스의 복부를 절개하고 실크 봉합사로 맹장을 결찰한 후, 바늘로 천공하여 복강 내 패혈증과 그에 따른 2차성 급성 폐 염증 및 손상을 유도합니다. 세 번째 모델은 경구 투여를 통한 사염화탄소 투여 모델입니다.사염화탄소는 간세포 괴사를 유발하며, 급성 간 손상과 간 섬유화 모두를 모델링하는 데 사용될 수 있습니다. 활성산소종(ROS) 생성을 평가하기 위해 모델 마우스를 대상으로 생물발광 이미징을 수행합니다. 결과 데이터는 염증성 자극에 반응하여 NADPH 산화효소가 ROS 생성의 주요 원인임을 나타냅니다.이 기법이 Florence probe와 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 체내 염증 발생 중 RS 생성을 실시간으로 모니터링할 수 있는 최소 침습적 접근 방식을 제공한다는 점입니다. 이 방법은 폐 염증 및 손상에서 RS의 역할과 같이, 숙주 방어 염증 및 손상에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 저희는 숙주 방어에서 활성 산소종의 역할을 연구하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었으며, 본 영상에서는 ROS 생성이 나타나는 세 가지 동물 모델 모두에 대해 설명합니다.P 47 Fox 결핍 마우스와 연령 및 성별이 일치하는 C 57 BL six DBA 마우스를 사용하십시오. 기관 내 xin 투여를 위해 기관 동물 관리 및 사용 위원회로부터 실험 승인을 받으십시오. 수술 플랫폼을 70% ethanol로 멸균하고 멸균 패드로 덮으십시오.수술 절차는 깨끗한 수술 가운, 장갑, 마스크를 착용하고 마취용 멸균 기구를 사용하여 수행해야 합니다. 지속적 isof fluorine 투여 시스템의 기화기에 2~3% isof fluorine을 채우고 전원을 켭니다. 그 후 2~3분 뒤에 마우스를 마취 챔버에 넣고, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 시행하며 호흡과 움직임을 관찰하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.호흡률을 약 50%까지 감소시켜야 합니다. 다음으로, 클리퍼를 사용하여 마우스 목 앞부분의 절개 부위를 제모합니다. 마우스를 수술 플랫폼 위에 일직선으로 배치하고, 마취 상태를 유지하기 위해 노즈콘을 씌웁니다. 베타딘과 70% ethanol을 목 부위에 번갈아 가며 세 번 도포합니다.다음으로, 곧고 날카로운 가위를 사용하여 앞목 피부를 약 0.5 centimeters 정도 절개합니다. 그런 다음 곡선 핀셋을 사용하여 기관 주변의 근육을 박리해 기관을 노출시킨 후 Xan을 기관 내로 투여합니다. 27 gauge 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 연골 고리 사이의 중간 부분에서 기관을 천자합니다.그 다음 바늘을 전방으로 향하게 하여 체중 1g당 1µg의 Xan을 천천히 주입합니다. 수술 후 절개 부위를 5-0 멸균 나일론 봉합사로 봉합합니다. 생쥐를 평평한 종이로 덮인 회복 케이지에 넣고, 회복 케이지의 절반을 가열 패드 위에 올려둡니다.마우스가 깨어나 자유롭게 움직일 때까지 관찰합니다. 2차 결찰 및 천자를 수행하려면, 마취된 마우스의 복부를 클리퍼로 제모하고 마우스를 수술대 위에 앙와위로 놓습니다. 그런 다음 Betadine과 70% ethanol로 수술 부위를 소독합니다.이전과 마찬가지로 메스 대신 가위를 사용하여 복부 중앙선의 피부를 1.5 centimeter 절개합니다. 복막을 절개하고 리트랙터로 복강을 열어 복강 왼쪽에 위치한 맹장을 찾아 노출시킵니다. 비외상성 포셉을 사용하여 맹장을 외부로 꺼냅니다.그 후, 노출된 맹장의 원위측 50%를 4-0 실크 봉합사로 결찰합니다. 21게이지 바늘을 사용하여 결찰 부위보다 원위측의 맹장을 천공합니다. 맹장을 복강 내로 다시 삽입합니다.4개의 멸균 나일론 봉합사를 사용하여 복벽을 폐쇄합니다. 그 후 5개의 멸균 나일론 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 2.5 µg의 buprenorphine이 포함된 saline 0.5 mL를 피하 주사하고, 이전과 동일하게 수술 후 관찰을 수행합니다.경구 사염화탄소 투여는 반응성 산소종(ROS) 의존성 간 손상 모델입니다. 경구 투여를 위해 마취된 마우스의 뒷덜미를 잡아 머리를 식도와 수직이 되도록 유지합니다. 그다음 사염화탄소가 담긴 22게이지 급여 및 투여 바늘의 끝을 앞니 뒤로 삽입하여 목구멍 뒤쪽과 식도 방향으로 향하게 한 뒤, 플런저를 눌러 사염화탄소를 투여합니다. 마우스가 회복되는지 모니터링합니다. 생물 발광 이미지는 ROS 생성 유도 전과 유도 후 4시간 및 20시간에 얻어야 합니다.이를 위해 Live Image 4.2 소프트웨어를 실행하십시오. 다음으로 IVIS 200 이미징 시스템을 초기화합니다. 'Initialize'를 클릭하고 시스템을 발광 모드로 설정하십시오.소프트웨어 화면에 표시되는 전하결합소자(CCD) 온도가 고정될 때까지 기다립니다. 노출 시간을 40초로 설정하십시오. 그 다음, Binning을 medium으로, F-stop을 1/8로 설정하십시오.마취된 마우스를 온도가 제어되는 스테이지가 있는 이미징 챔버에 넣고 앙와위로 배치합니다. 각 이미지 캡처 2분 전에 이전과 같이 마취제를 투여하기 위해 노즈 콘을 배치합니다. 27게이지 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 루미널 유도체 L 0 1 2 50 µL를 정맥 투여합니다.안와 뒤쪽 주사(retroorbital injection)를 수행합니다. 마지막으로, 설명된 대로 이미지를 획득하고 분석합니다. 비디오의 다음 섹션에서는 소프트웨어 내의 Living Image 소프트웨어 버전 4.2를 사용하여 수집된 데이터를 분석합니다.이미지를 열고 도구 팔레트에서 ROI 도구를 클릭합니다. 다음으로 ROI 도구 메뉴에서 ROI 모양을 선택하고 드롭다운 목록에서 원을 클릭합니다. 이미지에 추가할 ROI의 개수를 선택합니다.ROI 도구 메뉴에서 흉부 및 또는 복부 위의 ROI 위치를 조정하여 해당 관심 영역의 신호 강도 또는 광자 속(photon flux)을 정량화합니다. 측정(measure) 버튼을 클릭하여 이미지에 생성된 모든 ROI의 데이터가 표시되는 ROI 측정 표를 엽니다. 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 개별 시점에서 Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행함으로써, 야생형(wild type)과 N-A-D-P-H 산화효소 결핍(N-A-D-P-H oxidase deficient) 개체의 폐 내 ROS 생성을 비교합니다.Xan 챌린지 후 P 47 Fox 결핍 마우스. Xan은 본 영상에 설명된 대로 기저 시점, 4시간 및 24시간에 투여되었습니다. 마우스 영상 촬영은 여기에 표시된 대로 진행되었습니다.야생형에서는 기저치와 비교하여 4시간 및 24시간 시점에 흉부의 광방출이 유의하게 증가했으나, P 47. Fox sno 마우스에서는 그렇지 않았습니다. 이는 XUS Sand 투여 후 폐에서 ROS 생성의 주요 원인이 N-A-D-P-H oxidase임을 시사합니다.다음으로 CLP 유도 패혈증 모델에서 ROS 생성을 평가하였습니다. 패혈증은 급성 폐 손상 및 급성 호흡곤란 증후군을 포함한 말단 장기 손상을 동반하는 생명을 위협하는 증후군입니다. ROS 매개 손상은 패혈증 유발 다장기 기능 부전의 주요 동인으로 간주되어 왔습니다.이 그래프에서 보는 바와 같이, 야생형 마우스의 경우 CLP 후 4시간째에 흉부에서, 24시간째에 복부에서 ROS가 유의하게 증가했습니다. 그러나 P 47 Fox 결핍 마우스의 ROS 수치는 두 시점 모두에서 기저 수준과 유사했습니다. 이러한 결과는 CLP로 유도된 패혈증 마우스 모델에서의 ROS 생성이 N-A-D-P-H oxidase 의존적임을 보여줍니다.마지막으로, 사염화탄소로 유도된 간 손상 모델에서 ROS 생성을 검출하기 위해 생체 발광 이미징을 사용하였습니다. 이전에 설명한 염증 및 손상 모델과는 대조적으로, P 47, Fox null 마우스의 경우 사염화탄소 투여 4시간 후 복부의 ROS 생성이 기저치 대비 약 35% 완만하게 증가하였습니다. 그러나 사염화탄소로 유도된 ROS 생성의 크기는 P 47 Fox null 마우스보다 야생형 마우스에서 유의하게 더 컸습니다.이러한 데이터는 급성 carbon tetrachloride 유도 간 손상에서 P47phox를 포함하는 NADPH 산화효소 의존적 및 비의존적 ROS 생성이 모두 일어남을 시사합니다. Wild-type 마우스가 P47phox 결핍 마우스에 비해 ROS 수치가 증가했음을 보여주는 생물 발광 이미지 결과는 NADPH 산화효소가 염증성 자극에 반응하여 ROS를 생성하는 주요 원천임을 나타냅니다.이 방법은 생체 내 염증 발생 시 RS 생성을 실시간으로 모니터링하기 위한 최소 침습적 접근 방식을 제공합니다.

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

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출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

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