다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상

이 절차의 전반적인 목표는 세 가지 다른 염증성 마우스 모델에서 N-A-D-P-H 산화효소 유래 활성 산소 종 또는 ROS 생성의 실시간 모니터링을 위한 최소 침습적 접근 방식을 제공하는 것입니다. 첫 번째 모델은 Xan의 기관 내 투여로, 전염증 분자인 Xan을 마취된 마우스의 기관에 주입합니다. Xan은 N-A-D-P-H 산화효소를 활성화할 수 있는 곰팡이 세포벽 유래 제품입니다.

두 번째 모델은 se a ligation and puncture 또는 CLP입니다. 여기서 마우스의 복부를 열고 실크 봉합사로 세쿰을 결찰한 다음 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어 복강 내 패혈증과 2차 급성 폐 염증 및 손상을 유도합니다. 세 번째 모델은 구강 위층에 의한 사염화탄소를 투여하는 것입니다.

사염화탄소는 간세포 괴사를 일으키며 급성 간 손상과 간 섬유증을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 생물 발광 이미징은 ROS 생산을 평가하기 위해 모델 마우스에서 수행됩니다. 결과 데이터는 N-A-D-P-H 산화효소가 염증 자극에 대한 반응으로 ROS 생성의 주요 원인임을 나타냅니다.

기존 방법, 예를 들어 Florence 프로브에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 생체 내 염증 중 RS 발생의 실시간 모니터링을 위한 최소 침습적 접근 방식을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 폐 염증 및 부상에 대한 RS 규칙과 같은 방어 후 염증 및 부상의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 이 비디오에 표시된 ROS 생성의 세 가지 동물 모델 모두에 대해 호스트 방어에서 활성 산소 종의 역할을 시작했을 때 처음 떠올랐습니다.

P 47 Fox null 마우스를 사용하고 연령 및 성별은 C 57 BL six DBA 마우스와 일치합니다. xin의 기관내 투여를 준비하기 위해 기관 동물 관리 및 사용 위원회로부터 실험에 대한 승인을 얻습니다. 수술 플랫폼을 70% 에탄올로 살균하고 멸균 패드로 덮습니다.

수술 절차는 깨끗한 수술 가운, 장갑, 마스크를 착용하고 마취를 위해 멸균 기구를 사용하여 수행해야 합니다. 연속 isof 불소 관리 시스템의 기화기에 2-3%의 불소를 채우고 켭니다. 그런 다음 2-3분 후에 마우스를 마취실에 놓고 발가락 꼬집기를 수행하고 호흡과 움직임을 관찰하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.

호흡수는 약 50 % 감소해야합니다.그런 다음 가위를 사용하여 마우스의 목 앞쪽의 절개 부위를 면도합니다. 수술 플랫폼에 마우스를 이네 자세로 놓고 노즈콘을 배치하여 마취를 유지합니다. Betadine과 70% 에탄올을 목에 세 번 번갈아 가며 적용합니다.

그런 다음 곧고 날카로운 가위를 사용하여 앞 목 피부를 약 0.5cm 자릅니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 기관 주위의 근육을 절개하여 노출시켜 Xan 기관내 투여합니다. 27게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 연골 고리 사이의 중간 부분에 있는 기관을 뚫습니다.

그런 다음 바늘을 앞쪽으로 향하게 하고 Xan의 체중 1g당 1마이크로그램을 천천히 주입합니다. 수술 후 5개의 멸균 나일론 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 마우스를 평평한 종이로 덮인 회수 케이지에 넣고 회수 케이지의 절반을 가열 패드에 놓습니다.

생쥐가 깨어 있고 자유롭게 움직일 때까지 모니터링합니다. 절체 결찰 및 천자를 수행하려면 마취된 마우스의 복부를 이발기로 면도하고 누운 자세로 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 베타딘과 70% 에탄올로 수술 부위를 소독합니다.

메스를 사용하기 전과 마찬가지로 가위를 사용하여 복부 정중선 피부를 1.5cm 절개합니다. 복막을 자르고 견인기로 복강을 열고 복강의 왼쪽에 위치한 침장을 찾아 노출시킵니다. 분쇄되지 않는 겸자를 사용하여 외관을 만듭니다.

그런 다음 secum은 4 개의 오 실크 봉합사로 노출 된 secum의 원위 50 %를 결찰합니다. 21게이지 바늘을 사용하여 결찰부 원위부의 혈청에 구멍을 뚫습니다. 복부의 secum을 교체하십시오.

4개의 O 멸균 나일론 봉합사를 사용하여 복벽을 닫습니다. 그런 다음 5개의 멸균 나일론 봉합사로 절개 부위를 닫습니다. 0.5ml의 식염수와 2.5마이크로그램의 부프레노르핀을 피하하로 투여하고 이전과 같이 수술 후 관찰을 수행합니다.

구강 사염화탄소(Oral carbon tetrachloride)는 머리를 식도와 수직으로 정렬하기 위해 구강 위, 목덜미 및 마취된 마우스로 사염화탄소를 투여하는 반응성 산소 종 의존성 간 손상의 모델입니다. 그런 다음 사염화탄소가 들어있는 22 게이지 공급 및 투여 바늘의 끝을 앞니 뒤에 삽입하고 목구멍 뒤쪽과 식도를 따라 내려가 플런저를 눌러 사염화탄소를 투여합니다. ROS 생산을 유도하기 전과 4시간 및 20시간 후에 생물 발광 이미지를 획득하기 전과 마찬가지로 마우스의 회복을 모니터링합니다.

이를 위해 라이브 이미지 4.2 소프트웨어를 엽니다. 다음으로 ivus 200 이미징 시스템을 초기화합니다. 초기화를 클릭하고 시스템을 발광 모드로 설정합니다.

전하 결합 장치 온도가 잠길 때까지 기다리면 소프트웨어의 화면에 표시됩니다. 노출 시간을 40초로 설정합니다. 그런 다음 베닝을 중간으로 설정하고 F스톱을 1/8로 설정합니다.

마취된 마우스를 온도 조절 스테이지가 있는 이미징 챔버에 놓고 앙와위 위치에 놓습니다. 각 이미지 캡처 2분 전과 같이 마취를 투여하기 위해 노즈콘을 놓습니다. 27 게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 루미널 유도체 L 0 1 2를 정맥 주사합니다.

후안와 주사를 맞는다. 마지막으로, 이미지를 획득하고 설명된 대로 분석합니다. 비디오의 다음 섹션에서는 소프트웨어에서 라이브 이미지 소프트웨어 버전 4.2를 사용하여 수집된 데이터를 분석합니다.

이미지를 열고 도구 팔레트에서 ROI 도구를 클릭합니다. 다음으로 ROI 도구 메뉴에서 ROI 모양을 선택하고 드롭다운 목록에서 원을 클릭합니다. 이미지에 추가할 ROI 수를 선택합니다.

가슴 및/또는 복부 위의 ROI 위치를 조정하여 ROI 도구 메뉴의 관심 영역에서 신호 강도 또는 광자 플럭스를 정량화합니다. 측정 버튼을 클릭하여 ROI 측정 테이블을 열면 이미지에서 생성된 모든 ROI에 대한 데이터가 표시됩니다. 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 개별 시점에서 Bon Ferone 사후 테스트와 양방향 신보를 수행하여 야생형 폐와 N-A-D-P-H 산화효소 결핍의 폐에서 ROS 생성을 비교합니다.

P 47 Xan 챌린지를 따르는 Fox null 마우스. Xan은 이 비디오에 설명된 대로 기준선 4시간 및 24시간 동안 투여되었습니다. 마우스는 여기에 표시된 바와 같이 이미지화되었습니다.

야생형에서는 흉부 위로 광방출이 현저히 증가했지만, P 47은 그렇지 않았다. Fox는 기준선과 비교하여 4시간 및 24시간에 마우스를 스노포합니다. 이것은 N-A-D-P-H 산화효소가 XUS 모래 투여 후 폐에서 ROS 생성의 주요 원인임을 시사합니다.

다음으로 ROS 생산은 CLP 유도 패혈증 모델에서 평가되었습니다. 패혈증은 급성 폐 손상 및 급성 호흡곤란 증후군을 포함하여 말기 장기 손상과 관련된 생명을 위협하는 증후군입니다. R os 매개 손상은 패혈증으로 인한 다기관 기능을 유발하는 중요한 요인으로 간주되어 왔습니다.

이 그래프에서 볼 수 있듯이, 야생형 마우스에서 CLP 4시간 후 흉부와 CLP 24시간 후 복부에서 ROS가 유의하게 증가했습니다. 그러나 P 47 Fox null 마우스의 ROS 수준은 두 시점에서 기준선 수준과 유사했습니다. 이러한 결과는 CLP 유도 패혈증 마우스 모델에서 ROS 생성이 N-A-D-P-H 산화효소에 의존적임을 보여줍니다.

마지막으로, 생물 발광 이미징을 사용하여 사염화탄소 유도 간 손상 모델에서 ROS 생성을 감지했습니다. 앞서 설명한 염증 및 부상 모델과는 대조적으로, 복부의 ROS 생산은 사염화탄소 투여 4시간 후 P 47, Fox null 마우스에서 기준선보다 약 35% 완만하게 증가했습니다. 그러나 사염화탄소에 의한 ROS 생성의 크기는 P47 Fox null 마우스보다 야생형 마우스에서 훨씬 더 컸습니다.

이러한 데이터는 N-A-D-P-H 산화효소 의존성 및 독립 ROS 생성을 포함하는 P 47 Fox 생성이 모두 급성 염화백지 유발 간 손상에서 발생함을 시사합니다. P 47에 비해 Wildtime 마우스에서 ROS 수준이 증가했음을 보여주는 생체 휘도 이미지 결과. Knock Mized는 DP H 산화효소가 염증 자극에 대한 반응으로 RS 생성의 주요 원인이라고 밝혔습니다.

이 방법은 생체 내 염증 중 RS 생성을 실시간으로 모니터링하기 위한 최소 침습적 접근 방식을 제공합니다.