상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량

본 절차의 전반적인 목적은 활성화된 Gs에 대해 높은 친화력을 가진 변이체 RO A GST 융합 단백질을 이용하여, 배양 세포 내 특정 G-D-P-G-T-P 교환 인자 또는 gafs의 RO 활성화를 추적하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 GST 태그가 붙은 변이체 row 단백질을 생성함으로써 수행됩니다. 그다음, 비드에 결합된 GST row A를 정제합니다.

그 다음 SDS page를 사용하여 GST RO A 단백질의 순도와 농도를 평가합니다. 마지막으로 세포 용해물을 준비하고 GST RO A 단백질을 이용하여 GEF 침전 분석을 수행합니다. 최종적으로, 특정 anti GF 항체를 이용한 침전 단백질의 western blot 분석과 밀도 측정법(dense cytometry)을 통한 정량화를 통해 처리된 세포에서 활성화된 GS의 침전이 증가했음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 raw GTPS 분야의 여러 흥미로운 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 수많은 row G-D-P-G-T-P 교환 인자들이 어떻게 신호 특이적 방식으로 조절되며 그들의 활성이 어떻게 조정되는가 하는 점 등이 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 GST RO G 17 A 단백질이 상대적으로 불안정하여 준비 과정 중에 분해될 수 있기 때문에 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한 GF 침전 분석을 빠르고 일관되게 수행하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 석사 과정 학생인 Pfizer Vahid가 e coli 형질전환을 통해 수행하겠습니다.

얼음 욕조에서 DH5α 컴피턴트 세포 50 µL를 빠르게 냉각시킨 후, 25~50 ng/µL 농도의 pXrowAG17A DNA 1 µL를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 42 °C에서 45초 동안 히트 쇼크 처리한 후, 다시 얼음 위에 2분 동안 둡니다.

SOC 배지 900 µL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 흔들어 배양합니다. 멸균된 굽은 파스퇴르 피펫을 사용하여 형질전환된 박테리아 50~100 µL를 미리 준비한 LB agar 및 persin 플레이트에 도말합니다. 플레이트를 37 °C 배양기에 정립 상태로 5분 동안 배양한 후, 뒤집어서 하룻밤 동안 배양합니다.

형질전환된 박테리아의 단일 콜로니를 선택하여 ampicillin이 포함된 LB 50 milliliters에 접종합니다. 37 degrees SIUs에서 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 배양액이 최대 밀도에 도달하면, ampicillin이 포함된 LB 450 milliliters로 희석하고 30분 동안 추가로 배양합니다. 500 milliliters 배양액에 100 millimolar IPTG 500 microliters를 첨가하여 37 degrees Celsius에서 박테리아가 row protein을 생성하도록 유도합니다.

온도를 22~24°C로 낮추고 약 16시간 동안 배양합니다. 배양액을 4°C에서 3,600 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 -80°C에서 최소 1시간 또는 가급적 하룻밤 동안 냉동 보관합니다.

서면 프로토콜에 명시된 대로 200 milliliters의 용해 버퍼(lysis buffer)를 준비한 후, 얼음 위에서 10 milliliters에 1 millimolar DTT, 1 millimolar PMSF 및 프로테아제 억제제 정제 1정을 첨가하여 용해 버퍼 플러스(lysis buffer plus)를 만듭니다. Thor 펠렛에 10 milliliters의 용해 버퍼 플러스를 첨가하고, 피펫팅과 볼텍싱을 통해 충분히 현탁시킵니다. 얼음 위에서 설정 4, 50% 펄스 조건으로 1분 동안 현탁액을 초음파 처리합니다.

초음파 처리된 용해물을 4°C에서 15,000 ~ 20,000 ×g로 15분 동안 원심분리하고, 상층액을 멸균된 캡付き 15 mL 튜브에 옮깁니다. 75% 슬러리를 부드럽게 혼합하여 준비한 후, 와이드 보어 팁을 사용하여 335 µL를 15 mL 튜브에 분취하여 글루타티온 스페로 비드를 준비합니다. 차가운 PBS 10 mL를 첨가하고 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버립니다. 비드에 lysis buffer plus 1 mL를 추가하고 다시 원심분리합니다. 상층액을 다시 버리고 lysis buffer를 추가합니다.

또한, 50% 슬러리를 만들기 위해 평형화된 비드 슬러리 50 µL 두 개를 준비된 상층액과 혼합합니다. 4 °C에서 45분 동안 회전시킵니다. 100 mL의 HBS 버퍼에 5 mM 염화마그네슘과 1 mM DTT를 첨가하여 HBS plus를 준비하고, 상층액과 비드를 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 버리고 비드를 lysis buffer plus 10 milliliters로 2회, HBS plus 10 milliliters로 2회 세척합니다. 마지막 세척 후, 프로테아제 억제제가 첨가된 HBS plus에 비드를 재현탁하여 50% 슬러리를 만듭니다. 최종 비드 조제물 10 microliters를 beamr cap two ethanol이 포함된 2배 농도의 lam ly 샘플 버퍼로 희석합니다.

그런 다음 2 mg/mL BSA 스톡 용액 10 µL, 5 µL, 2.5 µL를 각각 10 µL의 Laemmli 버퍼와 혼합하여 세 가지 BSA 표준 샘플을 만듭니다.

시료를 5분 동안 끓인 후, 짧게 원심분리하고 염색 후 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 분자량 마커와 함께 함께 전기영동하며, BSA 표준물을 기준으로 GST row A G 17 A의 겔 추정치를 산출합니다. 약 10~15 µg의 단백질을 포함하는 동일 부피의 비즈를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. GF 풀다운 분석(pull down assay)을 준비하기 위해, 사용할 세포를 10 cm 디쉬에서 합류(confluence) 상태까지 배양하고 분석 전 최소 3시간 동안 혈청을 제거하여 기아 상태로 둡니다.

분석 시작 직전에, 프로테아제 억제제가 포함된 lysis buffer plus를 얼음 위에서 준비합니다. 디쉬에서 배양액을 제거하고 차가운 HBS로 세척합니다.

모든 HBS를 제거하고 각 디시에 700 µL의 lysis Buffer plus를 첨가합니다. 플레이트 전체 영역이 덮이도록 용액을 넓게 펴줍니다.

그 후, 세포 용해물을 긁어 번호가 매겨진 1.5 mL 튜브에 수집합니다. 4°C에서 15,000 ×g로 1분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 분석을 위해 보관하며, 각 플레이트의 세포 수가 동일했다면 각 상층액에서 30 µL를 취해 2배 농축 환원 라이시스 샘플 버퍼(reducing lysis sample buffer) 30 µL와 혼합합니다.

그다음 끓인 후 얼음 위에 놓아 둡니다. 나머지 상층액을 GST row a G 17 A 비즈 분주액에 추가하고 4°C에서 45분 동안 회전시킵니다. 비즈를 4°C에서 6,800 ×g로 10초 동안 원심분리합니다.

상층액을 버리고 용해 버퍼(lysis buffer)로 비즈를 3회 세척합니다. 30게이지 바늘이 장착된 1 CC 주사기를 사용하여 마지막 세척액을 완전히 제거하고, 2배 농축 환원 용해 샘플 버퍼(reducing lysis sample buffer) 20 µL를 첨가합니다. 샘플을 5분 동안 가열하고, 원심분리하여 비즈를 침전시킨 후, 연구 대상인 GF의 크기에 적합한 농도의 SDS page 젤에서 총 세포 용해물과 침전된 단백질 샘플을 전기영동합니다.

마지막으로, 관련 GFA의 성공적인 GF 분석을 검출하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행합니다. 여기서는 교환 인자인 GFH one의 활성화 검출 과정을 보여줍니다. row A G 17 A 단백질이 대조군 세포 용해물에서 일부 GFH one을 포착하는 것으로 보아, GFH one이 기저 활성을 가지고 있음을 시사합니다.

그러나 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor alpha로 처리한 세포에서는 침전량이 증가했으며, 이는 TNF alpha가 G FH one을 활성화한다는 개념과 일치합니다. 중요한 점은, 전체 세포 용해액에서 대조군과 처리군 샘플의 gfh one 양이 비슷하게 나타났으며, 이는 처리가 G FH one 수준을 변화시키지 않았고 분석에 사용된 투입량이 동일했음을 시사합니다. 이 절차를 적용할 때 GSE RO G 17 A 단백질과 세포 용해액을 얼음 위에서 유지하는 것이 중요합니다.

GF 분석을 신속하고 일관되게 수행하고, 분석 무효화 및 문제 해결을 가능하게 하는 적절한 양성 대조군을 사용하십시오.