Name: 상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 배우세요 상피 세포에서 GST-RhoA(G17A) 돌연변이 단백질을 이용한 활성 Rho-GEFs 침전 분석법을. 이 방법은 세포 신호전달 경로에서 GEF 활성화를 정량적으로 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) (걸레-97774)과 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC 480,619, 그랜트 NR)에 의해 재정 지원되었다. KS는 KRESCENT 새로운 탐정 수상 (캐나다, 캐나다 신장학 사회와 건강 연구소의 캐나다 연구소의 신장 재단의 공동 수상)와 연구 및 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상을받는 사람입니다. FW는 리튬 카의 아성 장학금으로 지원됩니다.

1. E.의 변환 pGEX-RhoA (G17A) 구조와 대장균 <ol><li> 100 ML DH이 드에 2.5 g의 LB와 1.5 g 한천을 용해하여 LB-한천을 준비한다 압력솥과 엄지손가락의 규칙으로, 플라스크가 편안하게 개최될 수있는 경우는 약 50-55 ° C로 좋아. </li><li> DH 2 O를 50 밀리그램 / ML을 해소하여 암피실린 (앰프) 재고를 준비 주사기 필터를하고 미사용 aliquots을 동결. 1.1에서 LB-한천로 앰프 주식 100 μl (최종 농도가 50 μg / ML)를 추가합니다. 믹스 앤 10cm 세균성 요리 (15-20 ML / 접시)에 붓는다하는 소용돌이. 그것이 고체화 (15-30 분). 후 2-3 주 동안 4에 반전 미사용 접시 ° C를 저장하도록 허용합니다. </li><li> E를 변환하려면 대장균, 빨리 얼음 욕조에서 DH5α 유능한 세포의 나누어지는을 녹여. 25-50 NG / μl로 희석 pGEXRhoA (G17A) DNA 1 μl를 추가합니다. 30 분간 얼음에 믹스 앤 부화 관 버려. 45초 2 분 동안 다시 얼음 장소 ° C ~ 42시 열충격. 추가 900 &amp; 무; 리터 SOC 매체와 흔들림과 함께 37 ° C에서 한 시간 만이라도 성장. </li><li> 굽​​은 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 LB-한천 - 앰프 플레이트에 변형 박테리아 50-100 μl 뿌리 더군요. 5 분 37 ° C 배양기에 플레이트 오른쪽을 품어 후 인버트와 하룻밤 성장. </li><li> 하나의 식민지는 GST 태그가 추가된 단백질 (단계 2.1)의 준비를위한 접시에서 포착됩니다. 나중에 사용하기 위해, 랩 및 매장 접시는 약 3 주 동안 4 ° C에서 반전. 또한, 세균성 주식은 떨고있는 37 ° C에서 하룻밤 사이에 두 ML 멸균 LB-앰프에서 재배 개별 식민지들이 더 오랫동안 보관 대한 대비를 할 수 있습니다. -80에 1:1 비율 및 동결의 멸균 80 % 글리세롤로 나누어지는를 섞어 ° C. </li></ol> 2. GST-RhoA (G17A) 비즈의 작성 <ol><li> 1 패 DH 2 0으로 25g의 LB를 추가하고 autoclaving하여 LB를 준비합니다. 때 시원하고, 주식 50 ML의 LB (50 μg / ML 최종 농도) 50 μl 앰프를 추가합니다. 잘 격리 열과 예방변형 박테리아의 ony와 교반과 함께 37 ° C에서 하룻밤 성장. 전체 밀도 (OD 600&gt; 1.0)에서 450 ML LB-앰프로 희석 37시 추가로 30 분간 성장할 때 ° C. </li><li> 10 ML DH 2 O.에서 0.238 g을 용해하여 이소 프로필 BD-thiogalactopyranoside (IPTG)의 100 밀리미터 주식 솔루션을 준비 -20 ° C.에 aliquots에 저장 500 ML 문화 (100 μm의의 최종 농도)에 IPTG 500 μl 100 밀리미터를 추가하여 Rho 단백질을 생산하는 박테리아를 유도. 22-24 온도를​​ 줄이고 ° C와 H ~ 16 시간 동안 성장. </li><li> 4 ° C.에 10 분 동안 3,600그램에서 문화를 던가 필요한 경우, 500 ML 문화는 원심 분리 50 ML 튜브로 나눌 수 있습니다. -80 적어도 1 시간 (또는 선호 야간)에 대한 프리즈 펠릿 (들) ° C. </li><li> 20 MM HEPES (0.95 g) / 산도 7.5를 포함하는 200 ML의 용해 버퍼를 준비; 150 MM NaCl (1.75 g), 5 밀리미터 MgCl 2 (0.203 g); 1% TX-100 (2 ML). 1M DTT (10 ML DH 2 O에 1.542 g의 주식 솔루션을 준비)과 100 밀리미터 PMSF (0.174 g/10 ML EtOH). 용해 완충액 +를 준비하려면, 1mM DTT (재고의 10 μl)와 1 ㎜ PMSF (재고의 100 μl)와 하나의 완전한 미니 프로 테아제 억제제의 타블렛을 갖춘 10 ML을 보완. </li><li> 얼음에서 일하는 10 ML의 용해 버퍼를 추가 + 단계 2.3에서 산탄으로. 부드러운 vortexing하고 pipetting에 의해 철저하게 Resuspend. 거품 마십시오. 50 % 펄스로 4 설정에서 1 분 얼음 Sonicate. 4 ° C에서 15 분 동안 15,000-20,000 g에서 sonicated lysate 던가, 그리고 무균 공을 15 ML 관을 명확히 sonicate (뜨는)를 제거하십시오. </li><li> 부드럽게 15 ML 튜브에 75 % 슬러리 및 전송 335의 μl를 포함하는 원래의 튜브를 혼합하여 글루타티온의 세파 로스를 준비합니다. 구슬을 피펫하는 넓은 구멍 팁을 사용하십시오. 10 ML 차가운 PBS를 추가, 4시 5 분 500g를 돌리다 ° C. , 뜨는을 삭제하시겠습니까 비즈 1 ML의 용해 버퍼 +를 추가하고 이전 세차 용으로 돌리다. 50 % 슬러리를 만들기 위해 뜨는하고 추가를 용해 완충액 +를 폐기하십시오. </li><li> equil 250 μl를 추가하십시오2.5 단계에서 뜨는로 비드 슬러리를 ibrated. 45 분 동안 4 ° C에서 회전합니다. </li><li> 20 MM HEPES (2.38 g)을 포함하는 500 ML HBS / 산도 7.5 및 DH 2 O에의 150 MM NaCl (4.38 g)을 준비 1M MgCl 2 (10 ML DH 2 O에서 0.952 g)과 1M DTT (10 ML DH 2 O에서 1.542 G)의 주식 솔루션을 준비합니다. HBS +를 준비하려면, 100 ML을 보완 불과 5 밀리미터 MgCl 2 (주식 50 μl) 1 밀리미터 DTT (재고에서 100 μl)와 함께 사용하기 전에. </li><li> 4 ° C.에서 5 분 500g에서 2.7 단계에서 비즈를 돌리다 10 ML의 용해 버퍼 +와 배 뜨는 및 세차 구슬을 무시, 10 ML HBS +와 2X. 최종 세척 후, HBS의 구슬 + BD BaculoGold 프로 테아제 억제제 (50x BD BaculoGold / ML 20 μl)로 보충을 resuspending하여 50 % 슬러리를 확인하십시오. </li><li> β-메르 캅 토 에탄올을 포함하는 2X Laemmli 샘플 버퍼로 최종 비즈 준비 10 μl를 희석. 소 혈청 알부민 (BSA) 기준을합니다. 2 MG / ML 주식 (1 BSA의 0.02 g 사용0 ML DH 2 O). DH 2 O 10 μl Laemmli (최종 10 μg) 5 μl있는 주식의 5 μl;와 7.5 μl DH 2 O 10 μl Laemmli와 2.5 μl 주식 10 μl Laemmli (최종 20 μg)에 주식의 10 μl를 혼합 (5 μg 최종). 모든 샘플 (5 분) 삶다. 비드 샘플을 돌려서 10 % SDS-polyacrylamide 겔의 BSA 표준과 분자량 마커로 뜨는 실행합니다. </li><li> 그리고 destain 솔루션 (500 ML DH 2 O, 400 ML의 메탄올 및 100 ML 초산) (10 ML 초산, 40 ML의 메탄올과 50 ML DH 2 O에서 0.1 G) Comassie 블루 얼룩을 준비합니다. 상온에서 보관하십시오. 20-30분위한 젤 청바지, 염료를 제거 (가 여러 번 재사 용할 수)와 두 번 destain 솔루션 린스. 밴드 명확하게 볼 때까지 몇 시간 동안 부드러운 진동으로 destain 계속. </li><li> 참조 (그림 2)로 BSA 표준을 사용하여 구슬에 결합 GST-RhoA (G17A)의 농도를 예상됩니다. Aliquo1.5 ML 마이크로 원심 튜브에 ~ 10-15 μg 단백질이 들어있는 구슬을 떠는 동등한 볼륨. 스토어 구슬은 4시 ° C는 하루 이내에 사용하십시오. -80에서 고정 ° HBS의 C 몇 일 이내에 사용하기 위해 3시 1분 비율로 + / - 글리세롤. </li></ol> 3. 뉴클레오 티드가없는 RhoA (G17A) 비즈와 GEF 풀다운 분석 <ol><li> 합류점까지 10cm 접시에 세포를 성장. 세럼은 적어도 3 시간 동안 박탈과 같은 요구 취급. </li><li> 용해 완충액을 준비 + 단계 2.4에서와 같이. 700 μl / 접시 플러스 오류를 pipetting 수 있도록 몇 가지 여분의 양을 충분히 용해 완충액 준비합니다. 단지 사용하기 전에 테아제 억제제를 추가합니다. </li><li> 얼음에서 일하는, 요리에서 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 HBS로 씻는다. 모든 HBS를 제거하고 각 접시에 700 μl 용해 완충액 +를 추가합니다. 모든 영역을 커버하는 소용돌이 모양의 접시는 데리고 번호가 1.5 ML 튜브에 lysates를 수집합니다. 4에 1 분 ° C.에 대해 15,000그램에 스핀 뜨는는 분석을 위해 사용됩니다. </li><li> 당신의 핸드폰 번호가 모두 동등한 경우요리가 테스트되고, 당신은 단백질 분석을하고 생략하고, 3.5 단계로 이동할 수 있습니다. 그렇지 않으면 바이오 방사선 빠른 단백질 분석을 사용하여 각 뜨는의 단백질 농도를 측정하고 볼륨과 집중을위한 뜨는을 맞춰야. 총 단백질의 양은 (LLC-PK1 세포에 대한 일반적 1-1.5 MG 단백질)에 사용되는 세포 유형에 따라 달라집니다. </li><li> Laemmli 샘플 버퍼, 종기를 줄여 30 μl 2X와 함께 각 뜨는 및 혼합 30 μl를 제거하고 단계 3.7에 대해 별도로 설정합니다. 2.12 단계에서 GST-RhoA (G17A) 구슬 aliquots에 남아 supernatants를 추가합니다. 4 ° C.에 45 분 동안 회전 </li><li> 4 ° C.에 10 초 동안 6,800그램에서 염주를 돌리다 뜨는을 취소하고 세차장 사이에 같은 방식으로 방적, 용해 완충액으로 3 배 구슬을 씻는다. 완전 30 G 바늘 들으며 한 CC의 주사기를 사용하여 최종 세척을 제거하고 Laemmli 샘플 버퍼를 줄이는 20 μl 2X를 추가합니다. 5 분 동안 끓여야. 펠렛 비즈로 돌려서 어느 즉시 뜨는을 실행 (바람직) 또는 보관t -80 ° C ~ 나중에 분석을 위해. </li><li> 당신이 공부를하고 GEF의 크기에 적절한 비율을 SDS-polyacrylamide 겔 20 μl 총 세포 lysates와 시켰던 단백질 샘플을 모두 실행합니다. 서양이 특정 항체를 사용하여 모래 바닥하여 선택의 GEF를 감지. </li></ol> 4. 대표 결과 파트 1과 프로토콜의 2 SDS-PAGE (그림 1 프로토콜의 개요 참조)하여 GSH-세파 로스 비즈와 테스트에 결합되는 GST-RhoA (G17A)의 준비에 대해 설명합니다. 전형 Coomassie의 스테인드 젤은 그림 2에 표시됩니다. eluted 단백질과 샘플은 약 50 kDa (그림 2, 레인 6)에서 단일 밴드를 포함한다. 단백질의 농도는 BSA 레퍼런스 샘플을 사용하여 추정 할 수 있습니다. 그림 2의 예제에서 RhoA (G17A)의 농도가 15 μg/10 μl 것으로 추정된다. 따라서, 10 μl / 튜브 aliquots이 준비되었습니다. 전형적인 수율<html> 우리 손으로에서 10 ML 세균 용해 15-20 μg 단백질입니다. 프로토콜의 3 부에서는 친화 강수량 분석합니다 (그림 1의 개요를 참조) 설명합니다. 교환 계수 GEF-H1의 활성화를 감지 성공 GEF 분석은 그림 3에 표시됩니다. RhoA (G17A) 단백질은 GEF-H1은 기저 활동을 갖고 제안, 컨트롤 (치료) 세포 lysates에서 일부 GEF-H1를 점령. 금액은 그러나 TNF-α는 GEF-H1 5,7 활성화한다는 개념과 일치 염증성 시토킨 종양의 괴사 팩터-α (TNF-α)로 치료 세포의 증가를 시켰던. 중요한 건, 총 세포 lysates은 치료 GEF-H1 수준을 변경하지 않았 제안, 제어 및 처리 예제에서 GEF-H1과 비슷한 금액을 표시하고 분석에 사용되는 입력은 동일합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜의 개요. ove_content &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> 그림 2. 비드 준비 프로토콜의 대표 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 성공 GST-RhoA (G17A) 비드 준비 Coomassie의 스테인드 젤이 나타납니다. 비드 샘플과 BSA 단백질 표준은 10 % 아크릴 아미드 젤을 사용하여 SDS-PAGE로 구분되었다. 구슬을 테스트하려면, GST-RhoA (G17A)를 포함하는 최종 비드 슬러리의 10 μl은 5 분 동안 Laemmli 샘플 버퍼와 삶은을 감소로 1:1 희석된다. 구슬은 간단하게 버리고 뜨는가 젤에로드되었습니다. 다음 예제로드되었습니다 레인 1 : 분자량 마커 (MW) (FroggaBio BLUeye은 단백질 사다리 prestained); 레인 2-4 : 5, 10 및 20 μg (BSA) 소 혈청 알부민, 레인 5는 비어 있습니다; 레인 6 : 10 신선한 RhoA (G17A) 구슬 μl. 분리가 완료되면 젤은 Coomassie 파랑을 사용 물들어 있었고, 그 후에 단백질을 누설하는 destained있다. GST-RhoA (G17A) 단백질의 분자량은 대략 50<html> 48 kDa 마커의 수준 주변 kDa 및 실행됩니다. 이 특정 예제에서 GST-Rho 단백질의 농도가 15 μg/10 μl 슬러리 주위 것으로 추정된다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> GEF-H1의 TNF-α 유발 활성화를 보여주는 그림 3. 대표 GEF 활성 분석. 합류 LLC-PK1 세포는 5 분 10 NG / ML TNF-α로 치료되었다. 다음과 같은 치료는 세포가 lysed되었으며 활성 GEFs는 GST-RhoA (G17A) 행 구슬을 사용하여 캡처했다. 시켰던 단백질 (상단 얼룩)와 총 세포 lysate 샘플 (하단 얼룩)에서 GEF-H1의 존재는 서양 방지 GEF-H1 항체 (세포 시그널링)로 모래 바닥을 사용하여 감지되었습니다. 성공적인 결과를 나타내는 상응하는 입력에 대한 상대 비 대우 전지 비해 TNF는-α-대우에서 시켰던 GEF-H1의 증가 금액을 유의하시기 바랍니다. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. &quot;나쁜 결과&quot;. GEF의 풀다운 분석이 여기에 표시된 비즈 잡혀 일부 GEF-H1 결과이지만, 금액은 컨트롤에서 시켰던와 TNF-α-처리된 세포는 동일합니다. 따라서 TNF-α,이 경우 GEF-H1의 아는 활성이 활성화를 유도하지 않았다. 이 특별한 실험 이후의 문제 해결에 사용되는 TNF-α가 충분히 신선하고 아마 타락한 아니라고 제안했습니다.

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</ol>

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여기에 제시된 방법은 세포의 GEFs의 활성 풀을 따라 GEFs 대한에서만 사용할 수 비 방사성 활성 분석이다. 분석은 다음과 같은 작은 GTPases의 활성화뿐만 아니라 RAC 및 Cdc42에 대한 GEFs 사용 강수량의 assays와 비슷합니다. 이러한 assays 다른 GST 태그가 추가된 단백질을 사용하고 여기에서 설명한 것과 약간 차이가 있지만 기본적인 단계는 동일합니다. 따라서이 프로토콜은 쉽게 다른 작은 GTPase와 GEF 활성화 assays에 대한 적응하실 수 있습니다. 제시 GEF 분석은 최근 핵 분수 9,10를위한 응용 프로그램으로 바뀌었습니다. 추가로 수정, 다른 subcellular 구획의 GEF 활성화의 테스트도 가능합니다 수도 있습니다. 우리는 상피 세포 라인 5,6,7의 GEFs의 활성화를 공부하는 표시 방법을 사용하십시오. 일부 최적화를 통해,이 분석은 모든 세포 라인에서 GEFs를 감지하는 적합해야합니다. 언제 adapti특정 세포 유형에 NG, 테스트해야하는 GEF를위한 최적의 휴대폰 번호, 용해 버퍼 볼륨, 및 검출 방법 (서양은 모래 바닥에 대한 좋은 항체를 중요)을 찾습니다. 분석의 초기 설정의 경우 그것은 관심 GEF을 활성화하는 것으로 알려져 자극을 사용하는 것이 좋습니다. 알 수없는 자극을 사용할 때, 항상 분석의 작동 여부를 확인하는 데 긍정적인 제어를 사용합니다. 이 분석은 서양의 모래 바닥으로 알려져 GEFs의 활성화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 알 수없는 GEFs를 파악하는 것도 충분한 것입니다. 이를 위해 통제와 자극 샘플에서 캡처한 GEFs는 Coomassie 묻은 겔에서 분석되어야한다. 오직 자극 표본에 나타나는 밴드 활성화 GEFs를 포함할 수도 있고 질량 분석법 (예 : 5)에 의해 식별을 위해 보낼 수 있습니다. 마지막으로, 경계의 메모. 검정은 활성 GEFs 렌더링 posttranslational 수정이 세포 용해 후 보존되었다는 가정하에 기반으로합니다. 실제로, 이것은 분명히 CA입니다GEFs의 번호 SE, 그 시설부터,이 분석은 GEF-H1, p115RhoGEF 및 XPLN (예 : 5,11,12,13)를 포함하여 다양한 GEFs의 활성화를 탐지하기 위해 여러 그룹에 의해 사용되었습니다. 활성 상태의 보존 그러나 모든 GEFs의 경우 발생하지 않을 수도, 따라서 그것이 분석은 모든 GEFs 목적에 부합되지 않는다는 것에 생각할 수있다. 그것은 또한 많은 GEFs 하나 이상의 작은 GTPases 향해 활동을 견딜수 것을 언급되어야한다. 따라서, 특정 GEF를 공부하면, 그것은 RhoA, Rac1 및 Cdc42를 검사 기타 소형 GTPases뿐만 아니라, 기능성 연구를위한 GEF의 강수량의 assays로이 분석을 보완하는 것이 좋습니다. 프로토콜의 중요 단계 : 변형 박테리아의 식민지 앰프, 좋은 파생물 및 수확량에 의한 적절한 선택을 위해 신선하고 제대로 준비 접시에서 포착해야합니다. 다른 출처에서 얻은 유능한 세포에 대한 변환 조건이 다를 수와 협의하여야한다. </p&gt; 단백질 준비 프로토콜 (단계 2.3부터) 및 분석 (단계 3.2에서)의 모든 단계 ° C 냉각 솔루션 및 원심 분리기와 4에서 수행해야합니다. 박테리아 용해 (단계 2.5) 균일한 현탁액을 얻기 위해 철저하고 완벽하게해야합니다. 박테리아, 와동을 lysing 4 ° C에서 그것을 유지하면서, 번갈아 lysate를 피펫과 sonication은 단백질 denaturing 방지하기 위해 얼음에서 수행되도록합니다. sonicator의 다른 모델을 사용하면 조건이 조정해야 할 수도 있습니다. 구슬로 sonicate의 인큐베이션 항상 충분한 구속력을 보장하기 위해 회전에서 4 ° C에서 이루어져야하고, 치료는 타이밍이 일관성을 유지하기 위해 이동해야합니다. GST-Rho의 돌연변이 박테리아로 표현하면 다소 불안정하므로 즉시 또는 몇 일 이내에 준비한 구슬을 사용하는 것이 그것이다. 강수량 분석 (파트 3), 시간 및 온도 구분의 활성 GEFs 쉽게 세포 lysate에서 손실될 수 있으므로 단계는 최대한 빨리 수행해야합니다. 다음 절에서는 몇 가지 문제 해결 팁을 포함하고 있습니다. 아니오 또는 최종 비드 준비 돌연변 Rho 단백질의 매우 낮은 금액 : 이것은 비효율적인 유도, 박테리아 부족 용해, 또는 준비 과정이나 보관 중에 단백질의 손실로 인한 ​​수 없습니다. 이러한 가능성의 일부를 해결하기 위해 박테리아의 샘플은 유도 전후 분석할 수 있습니다. 단백질 갓 streaked 판이나 다시 변형 유능한 세포에서 식민지를 사용하는 과정을 반복에 가난한 유도가있다면. 다른 IPTG의 농도 및 유도 시간도 테스트해야합니다. 용해가 용해 버퍼에 소금과 세제 농도를 변화 (즉 단백질 대신 뜨는의 펠렛에 남아) 부족한 경우에는 재판을받을 수 있습니다. 대체 sonication 시간 및설정이 고려되어야하고, sonication 전후 샘플은 용해의 효율성을 결정하기 위해 현미경으로 확인하실 수 있습니다. 아니오 GST-단백질이 구슬에 존재하더라도, GEF를 시켰던 없음 : 이것은 강수량 분석 도중에 기술적인 문제로 인해, 또는 적용 자극을 사용하여 공부 GEF의 활성화 실제 부재가 있습니다. 항상 검정 작동하는지 확인하기 위해 긍정적인 제어로 알려진 자극을 사용합니다. 몇 일 이내에 준비된 비즈를 사용합니다. 강수량 분석은 모든 조건에서 공부 GEF의 탐지 금액을 캡처하는 경우, GEF가 존재하고 분석 (단계 3.3)에 사용하는 원심 분리 후 뜨는에서 잘 감지 있는지 확인합니다. 모든 버퍼와 프로 테아제 억제제가 신선이며, 가능한 빨리 얼음의 모든 단계를 수행하십시오. 입력 단백질 (2 접시 / 샘플에서 lysates를 사용하여 등)의 양을 늘립니다. 강수량 분석은 기저 precipi가 표시되면당신의 GEF의 tation지만 아무런 차이 제어 및 자극 샘플 (그림 4) 사이에 본 적이있다는 적용 자극이 다른 알려진 효과를 (다른 신호 전달 경로의 활성화를 감지하여 예)을 사용하여 일한다고 확인하여 문제 해결을 시작합니다. 치료 조건 및 / 또는 농도를 변경을 고려합니다. 귀하의 자극 가능성이 시간과 농도를 예측하는 Rho 또는 다른 신호를 활성화하는 방법 문헌보고의 데이터에 의존하고 있습니다. GEF 활성화가 잘 감지 Rho 활성화 이전 시점에 가장 잘 감지 수도로서 처리 시간을 최적화하면 모두 짧고 오랫동안 포인트를 사용합니다. 마지막으로, 동일한 자극 통과 번호에 의한 세포 반응의 변화로 인해 활성화의 변수 학위 confluency 세포 등을 초래할 수

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> 곧 사용할 수 있습니다 </td><td> 박사 키이스 Burridge (노스캐롤라이나 대학) (심판 3) 실험실에서 생성된 </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> 스토어 -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC 배지 </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> -20 ° C에서 스토어 주식 </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (ISO프로필 BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio - 화학 </td><td> 420,322 </td><td> -20 ° C에서 매장 재고 솔루션 </td></tr><tr><td> 글루타티온 세파 로스 비즈 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 시그마 </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> M-9272 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 시그마 </td><td> P-7626 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 50x </td><td> BD Baculo - 골드 </td><td> 51 21426Z </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr&gt; <td> 완벽한 미니, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 프리 10X </td><td> 로슈 </td><td> 11 836 170 001 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> Laemmli 샘플 버퍼 2X </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7154 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> Coomassie 브릴리언트 블루 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> 초산 </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 방사선 단백질 분석 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye 사다리 </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 시약이 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td&gt; <td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> RC-5B의 원심 분리기 </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 로터 </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Sorvall - 써모 과학 </td><td> ST-16R </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> 마이크로 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> 세균성 흔드는 </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG는 CH-1403 Bottmingen </td><td> 37 ° C에서 또는 22에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> 브랜 </td><td> Sonifier-450 </td><td> RT에서 사용 </td></tr><tr><td> 회전하는 것 </td><td> Glas - 열 </td><td> 099A CR4012 </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr></tbody></table> 사용 표 2. 특정 장비.

상피 세포 lysates에서 gst-태그가 돌연변 rho 단백질을 (gst-rhoa (g17a))를 사용하여 활성 rho-gefs의 친화력 강수량

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

작은 GTPases의 Rho 가족의 단백질은 cytoskeleton의 중앙 규제이며, 세포 마이 그 레이션, 유전자 발현, 세포주기의 진행과 세포 접착 일을 포함하여 세포 공정의 수많은 종류를 제어합니다. Rho 단백질은 GDP 바인딩된 상태에서 GTP 바인딩된 및 운영 중지로 활약하는 분자 스위치입니다. 그들의 정품 인증은 구아닌 - 염기 교환 팩터 (GEF) 단백질의 가족에 의해 매개된다. Rho-GEFs은 specificities에게 2를 중복으로 큰 가족을 구성합니다. 진보 많은이 특정 신호에 의해 활성화 GEFs을 확인하였습니다 있지만, 이러한 단백질의 통로가 특정 규제에 관한 나머지 많은 질문이 아직 없습니다. Rho-GEFs의 수가 70을 초과하고, 각 셀에 두 개 이상 GEF 단백질을 표현한다. 또한, 이러한 단백질의 대부분은 Rho뿐만 아니라 활성화하지만, 가족의 다른 구성원은 규제 네트워크의 복잡도에 더 기여. 중요한 것은, 탐험어떻게 GEFs이 규제되는 것은 다양한 자극에 의​​해 활성화된 세포에서 개별 GEFs의 활성 풀을 수행하는 방법을 필요로합니다. 여기 친화 강수량 분석을 사용하여 사용 가능한 활성 Rho 특정 GEFs을 평가하고 계량하는 데 사용하는 방법에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 이 분석은 Burridge 실험실 3,4에서 몇 년 전에 개발된 우리는 신장 관형 셀 라인 5,6,7에 사용 하였다. 검정은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력으로, &quot;염기 무료&quot;돌연변이 RhoA 활용합니다. 변이 (G17A)은 GDP 또는 GTP하고이 상태가 GEF에 바인딩되어 중간 상태를 모방한 것이었 묶어 단백질이없는 렌더링. 이 돌연변이 단백질의 GST 태그가 추가된 버전은 표현과 E.에서 정화되어 대장균, 글루타티온 세파 로스 비즈에 바인딩 및 치료와 자극을 세포 lysates에서 적극 GEFs을 침전하는 데 사용됩니다. 대부분의 GEFs은 억제 바인딩의 posttranslational 변경 또는 릴리스, 그들의 적극적인 상태로 활성화되면세포 lysates에 보존되고, 그들이 검정 8 시까지 감지가 가능하다. 캡처한 단백질은 서양의 모래 바닥을 사용하여 특정 항체로 검출하여 알려진 GEFs에 대한 탐지, 또는 특정 자극에 의​​해 활성화 미지 GEFs을 확인하기 위해 질량 분광법에 의해 분석됩니다.

여기에 제시된 방법은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력을 가진 돌연변이 RhoA GST 융합 단백질을 사용함으로써 교양 세포에서 RhoA 특정 GDP / GTP 교환 요인 (GEFs)의 활성화를 따르도록하는 분석에 대해 설명합니다. GEFs는 서양 모래 바닥과 densitometry에 의해 계량에 의해 감지 세포 lysates에서 시켰던됩니다.

상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량

Rho family 소형 GTPase 단백질은 세포골격의 핵심 조절 인자이며, 세포 ...를 포함한 매우 다양한 세포 과정을 제어합니다.

본 절차의 전반적인 목적은 활성화된 Gs에 대해 높은 친화력을 가진 변이체 RO A GST 융합 단백질을 이용하여, 배양 세포 내 특정 G-D-P-G-T-P 교환 인자 또는 gafs의 RO 활성화를 추적하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 GST 태그가 붙은 변이체 row 단백질을 생성함으로써 수행됩니다. 그다음, 비드에 결합된 GST row A를 정제합니다.그 다음 SDS page를 사용하여 GST RO A 단백질의 순도와 농도를 평가합니다. 마지막으로 세포 용해물을 준비하고 GST RO A 단백질을 이용하여 GEF 침전 분석을 수행합니다. 최종적으로, 특정 anti GF 항체를 이용한 침전 단백질의 western blot 분석과 밀도 측정법(dense cytometry)을 통한 정량화를 통해 처리된 세포에서 활성화된 GS의 침전이 증가했음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 raw GTPS 분야의 여러 흥미로운 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 수많은 row G-D-P-G-T-P 교환 인자들이 어떻게 신호 특이적 방식으로 조절되며 그들의 활성이 어떻게 조정되는가 하는 점 등이 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 GST RO G 17 A 단백질이 상대적으로 불안정하여 준비 과정 중에 분해될 수 있기 때문에 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한 GF 침전 분석을 빠르고 일관되게 수행하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 석사 과정 학생인 Pfizer Vahid가 e coli 형질전환을 통해 수행하겠습니다.얼음 욕조에서 DH5α 컴피턴트 세포 50 µL를 빠르게 냉각시킨 후, 25~50 ng/µL 농도의 pXrowAG17A DNA 1 µL를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 42 °C에서 45초 동안 히트 쇼크 처리한 후, 다시 얼음 위에 2분 동안 둡니다.SOC 배지 900 µL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 흔들어 배양합니다. 멸균된 굽은 파스퇴르 피펫을 사용하여 형질전환된 박테리아 50~100 µL를 미리 준비한 LB agar 및 persin 플레이트에 도말합니다. 플레이트를 37 °C 배양기에 정립 상태로 5분 동안 배양한 후, 뒤집어서 하룻밤 동안 배양합니다.형질전환된 박테리아의 단일 콜로니를 선택하여 ampicillin이 포함된 LB 50 milliliters에 접종합니다. 37 degrees SIUs에서 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 배양액이 최대 밀도에 도달하면, ampicillin이 포함된 LB 450 milliliters로 희석하고 30분 동안 추가로 배양합니다. 500 milliliters 배양액에 100 millimolar IPTG 500 microliters를 첨가하여 37 degrees Celsius에서 박테리아가 row protein을 생성하도록 유도합니다.온도를 22~24°C로 낮추고 약 16시간 동안 배양합니다. 배양액을 4°C에서 3,600 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 -80°C에서 최소 1시간 또는 가급적 하룻밤 동안 냉동 보관합니다.서면 프로토콜에 명시된 대로 200 milliliters의 용해 버퍼(lysis buffer)를 준비한 후, 얼음 위에서 10 milliliters에 1 millimolar DTT, 1 millimolar PMSF 및 프로테아제 억제제 정제 1정을 첨가하여 용해 버퍼 플러스(lysis buffer plus)를 만듭니다. Thor 펠렛에 10 milliliters의 용해 버퍼 플러스를 첨가하고, 피펫팅과 볼텍싱을 통해 충분히 현탁시킵니다. 얼음 위에서 설정 4, 50% 펄스 조건으로 1분 동안 현탁액을 초음파 처리합니다.초음파 처리된 용해물을 4°C에서 15,000 ~ 20,000 ×g로 15분 동안 원심분리하고, 상층액을 멸균된 캡付き 15 mL 튜브에 옮깁니다. 75% 슬러리를 부드럽게 혼합하여 준비한 후, 와이드 보어 팁을 사용하여 335 µL를 15 mL 튜브에 분취하여 글루타티온 스페로 비드를 준비합니다. 차가운 PBS 10 mL를 첨가하고 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버립니다. 비드에 lysis buffer plus 1 mL를 추가하고 다시 원심분리합니다. 상층액을 다시 버리고 lysis buffer를 추가합니다.또한, 50% 슬러리를 만들기 위해 평형화된 비드 슬러리 50 µL 두 개를 준비된 상층액과 혼합합니다. 4 °C에서 45분 동안 회전시킵니다. 100 mL의 HBS 버퍼에 5 mM 염화마그네슘과 1 mM DTT를 첨가하여 HBS plus를 준비하고, 상층액과 비드를 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.상층액을 버리고 비드를 lysis buffer plus 10 milliliters로 2회, HBS plus 10 milliliters로 2회 세척합니다. 마지막 세척 후, 프로테아제 억제제가 첨가된 HBS plus에 비드를 재현탁하여 50% 슬러리를 만듭니다. 최종 비드 조제물 10 microliters를 beamr cap two ethanol이 포함된 2배 농도의 lam ly 샘플 버퍼로 희석합니다.그런 다음 2 mg/mL BSA 스톡 용액 10 µL, 5 µL, 2.5 µL를 각각 10 µL의 Laemmli 버퍼와 혼합하여 세 가지 BSA 표준 샘플을 만듭니다.시료를 5분 동안 끓인 후, 짧게 원심분리하고 염색 후 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 분자량 마커와 함께 함께 전기영동하며, BSA 표준물을 기준으로 GST row A G 17 A의 겔 추정치를 산출합니다. 약 10~15 µg의 단백질을 포함하는 동일 부피의 비즈를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. GF 풀다운 분석(pull down assay)을 준비하기 위해, 사용할 세포를 10 cm 디쉬에서 합류(confluence) 상태까지 배양하고 분석 전 최소 3시간 동안 혈청을 제거하여 기아 상태로 둡니다.분석 시작 직전에, 프로테아제 억제제가 포함된 lysis buffer plus를 얼음 위에서 준비합니다. 디쉬에서 배양액을 제거하고 차가운 HBS로 세척합니다.모든 HBS를 제거하고 각 디시에 700 µL의 lysis Buffer plus를 첨가합니다. 플레이트 전체 영역이 덮이도록 용액을 넓게 펴줍니다.그 후, 세포 용해물을 긁어 번호가 매겨진 1.5 mL 튜브에 수집합니다. 4°C에서 15,000 ×g로 1분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 분석을 위해 보관하며, 각 플레이트의 세포 수가 동일했다면 각 상층액에서 30 µL를 취해 2배 농축 환원 라이시스 샘플 버퍼(reducing lysis sample buffer) 30 µL와 혼합합니다.그다음 끓인 후 얼음 위에 놓아 둡니다. 나머지 상층액을 GST row a G 17 A 비즈 분주액에 추가하고 4°C에서 45분 동안 회전시킵니다. 비즈를 4°C에서 6,800 ×g로 10초 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 용해 버퍼(lysis buffer)로 비즈를 3회 세척합니다. 30게이지 바늘이 장착된 1 CC 주사기를 사용하여 마지막 세척액을 완전히 제거하고, 2배 농축 환원 용해 샘플 버퍼(reducing lysis sample buffer) 20 µL를 첨가합니다. 샘플을 5분 동안 가열하고, 원심분리하여 비즈를 침전시킨 후, 연구 대상인 GF의 크기에 적합한 농도의 SDS page 젤에서 총 세포 용해물과 침전된 단백질 샘플을 전기영동합니다.마지막으로, 관련 GFA의 성공적인 GF 분석을 검출하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행합니다. 여기서는 교환 인자인 GFH one의 활성화 검출 과정을 보여줍니다. row A G 17 A 단백질이 대조군 세포 용해물에서 일부 GFH one을 포착하는 것으로 보아, GFH one이 기저 활성을 가지고 있음을 시사합니다.그러나 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor alpha로 처리한 세포에서는 침전량이 증가했으며, 이는 TNF alpha가 G FH one을 활성화한다는 개념과 일치합니다. 중요한 점은, 전체 세포 용해액에서 대조군과 처리군 샘플의 gfh one 양이 비슷하게 나타났으며, 이는 처리가 G FH one 수준을 변화시키지 않았고 분석에 사용된 투입량이 동일했음을 시사합니다. 이 절차를 적용할 때 GSE RO G 17 A 단백질과 세포 용해액을 얼음 위에서 유지하는 것이 중요합니다.GF 분석을 신속하고 일관되게 수행하고, 분석 무효화 및 문제 해결을 가능하게 하는 적절한 양성 대조군을 사용하십시오.

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연구

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