루게릭병에 대한 마우스 모델 (ALS)의 임상 시험 및 척수 제거

안녕하세요, 제 이름은 Lar Turner입니다. 저는 독일 Ingham 대학교 신경과에서 박사후 연구원으로 근무하고 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Lin Gunda입니다.

저는 의대생이며 이 실험실에서 학위 논문 작업을 진행하고 있습니다. 오늘은 근위축성 측삭 경화증의 마우스 모델인 SODG 93의 임상 시험 과정을 보여드리겠습니다. 더불어, 소위 로터 테스트라고 불리는 운동 기능 테스트와 더불어, 면역학적 분석을 수행하기 위한 또 다른 운동 기능 테스트인 매달린 와이어 그립 테스트를 시연하겠습니다.

a s 마우스의 기능성 테스트를 마친 후, 척수, STIC 신경 및 비복근(gastroc muscle)을 제거하는 필수 절차가 이어집니다. 본 영상에서는 이러한 외과적 절차를 상세히 보여드리고, 마지막으로 몇 가지 전형적인 면역 조직학적 결과물을 제시하고자 합니다. 그럼, 먼저 임상 테스트부터 시작하겠습니다.

이 개체는 근육 떨림이나 마비와 같은 임상적 증상을 보이지 않는, 자유롭게 움직이는 야생형 MOE이며, 이는 당사의 임상 분류 체계에서 4점에 해당합니다. 그리고 이것은 형질전환 ALS MOE입니다.

질병의 초기 단계에서, 우측 뒷다리에 심한 떨림이 나타나며 이는 SCORE 3 E로 분류됩니다. 심한 보행 이상이 있는 동물은 score 2로 분류합니다. 최소 하나 이상의 뒷다리를 끄는 경우는 임상 점수 1로 분류합니다. Hanging wire test에서는 조잡한 근육 움켜쥐기 강도를 평가합니다. 각 마우스는 맞춤 제작된 와이어 위에 놓이며, 짚으로 덮인 버튼 위에서 조심스럽게 거꾸로 뒤집어집니다.

최소 180초 동안 세 번 연속으로 훈련시킨 후, 낙하까지 걸리는 잠복기를 측정합니다. 각 마우스는 역전된 뚜껑을 최대 180초 동안 붙잡을 수 있도록 최대 세 번의 시도를 부여하며, 가장 긴 시간이 기록됩니다. 오른쪽에 있는 백색 와이어 유형의 마우스와 비교했을 때, 왼쪽에 있는 플라크 형질전환 마우스는 매우 약하며 최대 시간에 도달하기 전에 뚜껑에서 떨어집니다.

로터 로드(Rotor rod) 장치는 운동 조정 능력, 균형 감각 및 운동 학습 능력을 측정하는 데 사용됩니다. 우수한 수행 능력을 보이려면 높은 수준의 감각 운동 조정 능력이 필요합니다. 이 장치는 컴퓨터로 제어되는 모터 구동 회전축과 5마리의 마우스를 위한 5개의 레인으로 구성되어 있습니다.

생쥐의 낙하 여부는 바닥의 플라스틱 플레이트에 가해지는 압력을 통해 자동으로 감지됩니다. 분당 15회전의 일정한 속도로 최소 180초 동안 3회 연속으로 훈련시킨 후, 동물이 회전하는 로타로드 위에서 버틸 수 있는 시간을 측정합니다. 각 동물에 대해 3회 시도를 실시하며, 추락 전까지의 가장 긴 잠복 시간을 기록합니다.

왼쪽에 있는 건강한 야생형 생쥐는 로터 로드 위에서 무리 없이 달리고 있습니다. 이와 대조적으로, 오른쪽에 있는 형질전환 a s mo 생쥐는 로터 로드 위에 머무는 것조차 매우 어려워하며, 뒤에서 관찰했을 때 잠시 후 미끄러져 떨어집니다. 왼쪽 retre 생쥐의 심각한 보행 장애를 확인할 수 있습니다.

건강한 대조군 쥐와 비교했을 때, 해당 쥐는 로타로드(rotor rod) 속도를 따라가지 못하며 HIN 사지로 위쪽을 밀어내지 못합니다. 척수의 면역화학적 분석을 수행하기 위해 동물을 희생시켜야 합니다. 동물 실험의 적절한 수행을 위한 지역 가이드라인을 항상 엄격히 준수하는 것이 매우 중요합니다.

이 과정에서는 척추와 그 주변 조직에 대한 매우 단순화된 개요를 통해 주요 해부학적 구조를 묘사합니다. 동물을 복측이 위로 오게 배치하고 등쪽 주머니의 근육을 준비하기 시작합니다. 근육 조직을 제거한 후, 척수를 둘러싸고 있는 척추에 접근하겠습니다.

동물을 희생시키고 파라포름알데히드 함유 용액으로 관류시킨 후, 척수를 적출할 수 있습니다. 동물을 수술대 위에 놓고 뒷다리를 양옆으로 고정하여 마우스의 등 쪽이 노출되게 합니다. 털을 납작하게 눕혀 이후의 피부 절개를 용이하게 하기 위해 동물의 몸을 적십니다.

이를 위해 날카로운 메스를 사용합니다. 피부를 양옆으로 팽팽하게 당기도록 주의하십시오. 절단을 용이하게 하기 위해 다리 근육을 준비해야 합니다.

피부 또한 절개해야 합니다. 피부 절개가 완료되면, 이를 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 핀셋을 사용하여 다리 근육과 좌골 신경을 제거한 후, 척수를 향해 계속 접근하며 동물을 새로운 수술대 위에 놓습니다.

이제 두개골, 목, 근육 및 척주를 쉽게 식별할 수 있습니다. 이러한 모든 구조물을 확인했으므로 다음 단계로 쉽게 진행할 수 있습니다. 목의 근육과 인대를 제거해야 합니다.

너무 깊게 절개하여 척주에 손상을 주지 않도록 주의하십시오. 다음 단계에서는 척주를 노출시키기 위해 척추 주변 근육을 완전히 제거합니다. 척주에 접근하기 위해서는 여러 번의 절제술을 수행해야 합니다.

환추후두관절을 포함하여 경추 부위부터 시작합니다. 척추궁 절제술을 수행하기 위해서는 추체로부터 모든 척추 돌기를 제거할 수 있도록 척추궁을 절단해야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 척추궁 절제술은 척추궁을 절단하는 것으로 시작합니다.

그 다음 라미나(lamina)를 젖혀냅니다. 이후 더 많은 척추궁을 제거해야 하므로 척수(spinal cord)에 손상을 주지 않도록 다시 한번 주의하십시오. 각도가 진 가위를 사용하여 양측의 여러 척추궁을 한 번에 절개하는 것이 매우 유용합니다.

그 다음, 등쪽 돌기를 당겨 척추 후궁을 완전히 제거합니다. 확대 영상을 보시면 가위를 척수강의 가장 외측 부분에 조심스럽게 삽입해야 함을 알 수 있습니다. 이후 척수를 완전히 제거하기 용이하도록 척추의 남은 외측 부분들을 제거해야 합니다.

척수의 해부학적 지표는 소위 경수 및 요수 팽대부입니다. 척수 전체의 적출을 마친 후, 척수의 모든 전근을 절단하고 뇌수막의 경막으로부터 척수를 분리하십시오. 다음으로, 경수 부분을 절단합니다.

두측으로 향하며 제거 과정을 다시 시작합니다. 이 조직이 손상되면 이후의 면역화학 분석에 심각한 제약이 생길 수 있으므로, 척수를 매우 주의 깊게 다루십시오. 척수 제거는 흉수 수준에서 계속 진행하여 요수 부분까지 이어갑니다.

이번에는 마미(cauda equina) 측면을 다시 절단합니다. 이제 이를 완전히 분리할 수 있습니다. 여기 RAL 컬럼 내의 원래 위치 바로 옆에 배치된 척수를 볼 수 있습니다.

최종적으로, 시료를 Paraform Hyde 후고정 용액에 넣습니다. 척수 면역조직화학 분석의 전형적인 예로, 척수 전각의 운동 뉴런을 식별하기 위해 choline, acetyl transferase를 인식하는 항체를 적용할 수 있습니다. 여기 건강한 야생형 동물의 수많은 운동 뉴런을 확인할 수 있습니다.

반대로, 말기 단계의 ALS 형질전환 동물은 전각(Anterior horn) 내의 운동 뉴런 수가 훨씬 적은 것을 보여줍니다. 이 비디오 논문을 통해 근위축성 측삭 경화증의 마우스 모델인 SOD1 G93의 기본적인 임상 검사 방법을 학습하셨을 것입니다.

로터 테스트와 매달린 와이어 테스트라는 두 가지 운동 행동 테스트가 입증되었습니다. 이 테스트들은 기본적인 운동 기능을 평가하는 데 유용한 가능성을 제공합니다. 또한 수행하기 쉽고, 운동 결손 탐지에 민감하며, 시간 효율적입니다.

이 영상의 주요 내용은 척수 준비 기술의 시연으로 구성되어 있습니다. 이 방법은 물론 다른 모든 마우스 질병 모델에도 적용할 수 있으며, 추후 척수 내 질병 병리에 대한 면역화학적 분석을 위한 필수적인 단계입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

이 비디오 논문이 귀하의 향후 실험에 도움이 되기를 바랍니다.