Name: Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 배우세요 혈액학 질환에서 혈관내피 세포와 혈액 세포의 상호작용을 연구하기 위한 내피화 마이크로유체 장치 제작법을. 이 체외 모델은 질병 기전 연구에 활용됩니다.

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우리는 T. 헌트 M. Rosenbluth, 그들의 조언과 유용한 토론 램 연구소 감사드립니다. 우리는 G. 스피너의 지원과 기술 조지아 연구소의 전자 및 나노 테크놀로지 연구소를 인정합니다. 이 작품에 대한 재정 지원은 NIH 교부금 K08-HL093360, UCSF REAC 상, NIH의 Nanomedicine 개발 센터 수상 PN2EY018244, 그리고 애틀랜타의 어린이 건강의 내피 세포 생물학을위한 센터에서 자금 지원에 의해 제공되었다.

1. 내피 Microdevice의 제작 <ol><li> 외부 마스크 공급 업체로 microfluidic 장치의 컴퓨터 보조 설계 (CAD) 도면을 제출하여 photomask를 만듭니다. 사용한 마스크는 소다 석회 유리에 크롬 층으로 구성되었다. 이 경우에는 microfluidic 채널 폭 30 μm의했습니다. </li><li> 15 분 동안 고생과 베어 실리콘 웨이퍼 (황산과 과산화수소의 10시 1분 비율)을 청소하고 30 초 동안 불화 수 소산​​ 산성에서 찍었 다. 약 10 초 동안 deionized (DI) 물로 씻어. </li><li> 30 μm의 높이로 웨이퍼쪽으로 스핀 coater를 이용하여 스핀 Microchem SU-8 2,025 포토 레지스트. SU-8 2025의 경우 3000 RPM의 회전 속도 권장합니다. SU-8의 다른 viscosities이 높이를 달성하는 가능합니다. SU-8 사용에 대한 전체 안내를보실 수 있습니다 <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> 95 ° C에서 열판에 SU-8로 웨이퍼를 놓으십시오5 분 초과 용매를 운전합니다. 참고 : 오븐은 열판 다르게 웨이퍼를 건조하게 될 것입니다 것은 권장되지 않습니다. </li><li> 웨이퍼 위에 원하는 기능 형상과 마스크를 삽입하고, 자외선 (160 MJ / ㎝ 2로 노출 마스크 aligner (칼 조사할, MA-6)에서) 365 nm의에서 측정. 이 십자가는 포토 레지스트를 연결. </li><li> 추가 SU-8의 중합을 촉진하기 위해 추가로 5 분 95 ° C에서 열판 다시 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 비 교차 연결된 SU-8을 제거하려면 4 분간 PGMEA (프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트)로 주로 구성되어 SU-8의 개발자의 웨이퍼를 담궈. </li><li> 10의 100 % 이소 프로필 알콜 (IPA)와 함께 새로 개발된 웨이퍼를 씻어. 웨이퍼 그런 다음 용매 몇 분 동안 깨끗한 퓸 후드의 웨이퍼에서 증발 수있게하거나 가압 질소를 사용하여 건조 수 있습니다. </li><li> 테이프 배양 접시에 패턴 SU-8로 건조 웨이퍼의 가장자리는 사전하기운동을 빼낼. </li><li> 웨이퍼 전체 코팅을 보장하기 위해 페트리 접시 위에, 그리고 소용돌이 모양의 웨이퍼와 커버, 피펫을 사용하여 웨이퍼에 Sigmacote 1 ML을 적용, 덮개를 제거하고 모든 용매가 증발된 때까지 웨이퍼 몇 분 동안 건조 수 있습니다. </li></ol> 2. PDMS (Polydimethylsiloxane) 준비 <ol><li> 믹스 PDMS 폴리머와 경화 에이전트 10시 1분 비율 (W / W)에서하고 진공 건조기를 사용하여 기포를 제거합니다. 가스를 제거하다 PDMS에 필요한 시간의 길이는 가능한 진공 시스템의 강도에 따라 다르지만 일반적으로 몇 분 거리에 1 시간 범위. 내용은없고 이전에 부어 PDMS, 고분자의 60 ML의 총 볼륨으로 인해 저는 수십 인치 배양 접시 권장합니다. </li><li> 약 5mm 두께의 웨이퍼에 혼합물을 부어. 또한 PDMS의 얇은 시트를 만드는 평평한 바닥 접시 위에 두께 약 1mm를 붓는다. 60 하룻밤 오븐에 ° C로 치료하자. </li><li> 칼이나 메스를 사용하여 C 주위를 잘라PDMS 장치를 ured 및 웨이퍼에서 제거할 수 있습니다. 또한, 장치보다 약간 큰 PDMS의 얇은 시트를 잘라. </li><li> 1.0 밀리미터 구멍 펀치를 사용하여 PDMS 장치의 유입구와 배출구 구멍을 만듭니다. 이 중 핀 바이스, 해리스 유니 코어, 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> 장치의 표면과 스카치 테이프를 사용하여 시트를 청소합니다. </li><li> 플라즈마 클리너 사용, PDMS 장치에서 30 s에 대한 산소 플라즈마에 PDMS 시트의 표면을 쉽게받을 수 있습니다. 산소 플라즈마는 신체 접촉으로 데려 결합 PDMS의 노출된 표면에 반응 수종을 만듭니다. </li><li> PBS의 인간 혈장 50 μg / ML fibronectin 가득 바​​람에 무딘 점 바늘 주사기에 연결된 대형 튜브의 작은 길이 (몇 센티미터),에 작은 튜브를 연결합니다. 관 그리고 바늘이 마찰 맞춤 튜브 사이에 만들어 졌는지와 같은 크기입니다. 작은 PDMS microdevice의 입구에있는 튜브와를 삽입pply 주사기에 압력 fibronectin 솔루션을 완벽하게 채널을 기입하고 배출구 포트에 작은 100 μL 방울을 만들려면 채널이 젖었 머물 수 있도록. 40-60 분 동안 37 ° C에서 장치를 품어. </li><li> 무딘 포인트 바늘로 PBS로 가득 신선한 주사기를 연결합니다. PBS로 장치를 헹굴 수있는 주사기에 압력을 적용합니다. </li></ol> 3. 내피 세포와 Microfluidic 장치를 퍼뜨리고 <ol><li> 8퍼센트 dextran과 내피 성장 미디어에서 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs)의 1,000,000 세포 / ML을 준비합니다. 500,000까지 2,000,000 세포 / ML의 범위가 성공적으로 사용되었습니다. 셀 로딩 매체에 dextran의 추가들은 fibronectin - 코팅 microfluidic 시스템 입력으로 내피 세포의 속도가 감소 유체의 점도를 증가시킵니다. 이것은 차례로, 세포가 microdevice 내에 성공적으로 준수 문화 것이라는 확률이 높아집니다. </li><li> C단계 2.7에서와 같이 새로운 주사기와 튜브를 onnect. 하지만 긴 튜브로 (길이 약 1 미터). </li><li> 이 시스템의 성능을 최적화하기 위해서는 전체를 관류 시스템에 누출이나 거품을 방지하기 위해이 시점에서 중요하다, 솔루션 또는 미디어의 거품의 존재의 누설이 흐름을 변경하고 내피 세포의 성공적인 시딩를 방지할 수 있습니다. 따라서 튜브가 꽉 피팅은 어떤 연결 사이의 누설을 제거하는 것이 필수적이다. 세포 microdevice 도입하고 전체를 관류 시스템은 공기 방울의 도입을 피하기 위해 microfluidic에 튜브를 장착하기 전에 셀 솔루션으로 끝났다해야하기 전에 주사기 및 / 또는 튜빙의 거품은 제거되어야합니다. </li><li> 주사기 펌프를 사용하여, 37에서 2 시간 동안 1.23 μl / 분 용적식 속도로 PDMS 장치에 세포 현탁액을 불어 넣다 ° C에서 5 % CO 2. 주사기 펌프에 있었을 때 최적의 결과를 달성했다<html> PDMS 장치로 같은 높이. 입구 들어, 인큐베이터 안에 낫게 수있는 긴 튜브는 세포와 미디어가 적절 장치와 접촉 오기 전에 워밍업하는 보장합니다. 저희 시스템에서는 1.23 μl / 분의 체적 유량은 중 ~ 1 다인 / 전체 혈액을 사용하는 채널의 cm 2. 벽면 전단 응력에 대응하는 가장 작은 microchannels에 ~ 1mm / s의 강물의 한복판 속도를 대략 </li><li> 1.23 μl / 분 비율로 2~8일에 대해 동일한 주사기 펌프 및 긴 튜브, perfuse 신선한 성장 미디어를 사용합니다. 성공적인 장치는 24-48 시간 이내에 장치의 내부에 성장 내피 세포 단일층을해야합니다. 이전 실험 합류 monolayers 적절하게 기기에 걸쳐 14 세포 - 세포 분기점에서 VE-cadherin을 표현하는 것으로 나타났습니다. </li><li> 실험을위한 시스템으로 혈액이나 세포 현탁액을 주사. </li></ol> 4. 대표 결과 _content가 &quot;&gt;이 프로토콜을 사용하여 표준 리소그래피 microfabrication 기법은 생리학 microvasculature (그림 1A)의 sizescale을 모방 microfluidic 채널을 생성하는 데 필요한 금형을 만드는 데 사용됩니다. 최적화된 관류 기법을 사용하여 내피 세포가 종자 및 confluently 문화 microfluidic 시스템이 투명으로 세포 시딩의 24 ~ 48 시간 내 microfluidic 시스템 (그림 1B)의 전체 내부 표면은., 전체 microdevice는 이미징 및 데이터 수집을위한 brightfield / 형광 현미경 스테이지에 둘 수 있습니다. 우리의 시스템은 다음 sickled 붉은 세포 탈선 백혈구 및 내피 접착의 증가 강성은 microvascular 장애물에 기여하는 등 낫 세포 질환과 같은 biophysical 속성, 변경 포함 hematologic 질환을 연구에 적용할 수 있습니다. 임상적으로 승인된 약물 치료, hydroxyurea는 증상이 있지만 D를 amelioratesmicrovascular 흐름에 irect 효과는 알 수 없습니다. 우리의 분석은 계정의 셀 강성과 접착 모두로 소요되며, hydroxyurea가 크게 낫 세포 질환 (그림 2)에서 흐름을 ameliorates 것을 보여줍니다. 이 시스템은 이상적인 혈액 세포가 microvasculature에서 서로와 내피 세포와 상호 작용하는 모든 hematologic 과정을 공부하고 적합으로 낫 세포 질병은 microvasculature - 온 - 칩위한 응용 프로그램의 한 예입니다. 더 기본적인 애플 리케이션이 많은 사람 중에서 백혈구 생물학과 조혈 줄기 세포 생물학을 포함하면서 기타 임상 관련 애플 리케이션은 염증성 질환, 패혈증 / 폐 상해, thrombotic microangiopathies, 말라리아, 그리고 암 전이를 포함합니다. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1.) endothelialization 전에 초기 PDMS microfluidic 장치. 여기 microdevice는 재치가 주입된다H 식품 시스템의 sizescale 및 전반적인 디자인을 설명하기 착색. B) Brightfield 현미경은 microfluidic 체제가 완전히 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여 세포 시딩 48 시간 이내에 endothelialized되어 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2.) microchannels있는 microvasculature - 온 - 칩은 사후 모세관 venules (30 μm의), 대부분 낫을 세포 microvascular 폐쇄 이벤트 사이트의 크기를 대략. hydroxyurea를받는 낫 셀 환자에서와 hydroxyurea를받지 못한 환자의 전체 혈액은 두 개의 서로 다른 microvasculature - 온 - 칩 디바이스를 통해 흘러됩니다. endothelialized microchannels 내에서 상대적으로 쉽게 hydroxyurea 흐름을 받고 낫 셀 환자에서 B) 전체 혈액. C) 같은 hemodynamic 조건에서 hydroxyurea를받지 못하고 낫 셀 환자에서 전체 혈액 그러나, microch와 훨씬 더 부진한 흐름을 전시하고annel의 방해. 아래 채널이 완전히없이 흐름에 방해되고 다른 endothelialized microchannels의 흐름 판매율은 hydroxyurea 조건에 비해 현저히 낮은됩니다. 세 가지 이미지 스케일 바는 30 μm의입니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리 endothelialized microdevice 시스템은 생체내 실험에서와 함께 사용할 때 가장 좋은 적합하며, reductionist 접근 방식은 인간과 동물 모델에서 관찰되는 hematologic 프로세스 biophysical 메커니즘을 명료하게하다 도움이 될 수 있습니다. 또한, 우리의 시스템은 제한없이 않습니다. 예를 들어, 우리 microfluidic 채널 단면에서 사각형입니다. 기술적으로 원형 microchannels는 10,11를 조작 수 있지만, 우리는 다른 연구자들이 쉽게 자신의 작품이 시스템을 적용할 수 있도록보다 단순하고 일반 제조 절차를 사용하기로했다. 또한, 효과적인 루멘 &quot;밖으로 반올림 &#39;교양 내피 세포가 자연의 존재는 시스템이 더 physiologic 될 수 있도록. 또한, 우리의 유체 다이나믹 모델링은 우리 시스템의 유량 조건 생체내 ​​microvasculature의 입은 비교는 것을 알 수있다. 마지막으로, 최근 작품은 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 무딘 포인트 바늘 </td><td> 확인을 국제 </td><td> 920050-TE </td><td> 정밀 장비 바늘이 20 게이지 X 1 / 2 &quot;, 핑크 </td></tr><tr><td> dextran </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 31,392 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> 홀 구멍을 뚫는 (핀 바이스) </td><td> 기술 혁신 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인간의 탯줄 내피 세포 (HUVECs) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> 플라즈마 청소기 </td><td> 혈장 </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 개발자 </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> 튜빙 (큰) </td><td> 콜 - Parmer의 악기 회사 </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg microbore 튜빙, 0.020 &quot;ID X 0.060&quot;OD </td></tr><tr><td> 튜빙 (작은) </td><td> 콜 - Parmer의 악기 회사 </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE microbore 튜빙, 0.012 &quot;ID X 0.030&quot;OD </td></tr></tbody></table>

hematologic 질환의 microvascular 상호 작용 유학을위한 endothelialized microfluidics

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

microfabrication 기술의 발전은 마이크로 및 nanoscales 1,2에서 생물 학적 및 생화 학적 실험을 수행을위한 저렴하고 재현성 microfluidic 시스템의 생산을 활성화했습니다. 또한, microfluidics도 구체적으로 인해 쉽게 역동적인 유체 환경과 생물 학적 조건 3-6 제어하는 능력 때문에, 양적 hematologic과 microvascular 프로세스를 분석하는 데 사용되었습니다. 따라서 연구자들은 최근 혈액 세포 deformability, 혈액 세포 집합, microvascular 혈액 흐름과 혈액 세포 - 내피 세포 상호 작용 6-13 공부를 microfluidic 시스템을 사용 해왔다. 그러나 이러한 microfluidic 시스템이 어느 교양 내피 세포를 포함하거나 더 큰 줄 몰랐 microvascular pathologic 프로세스 sizescale 관련된보다. 교양 내피 세포와 microfluidic 플랫폼 정확 recapitulates 세포, 물리적, 그리고 hemodyn 그microcirculation의 amic 환경 microvasculature 참여 hematologic 질환의 근본적인 biophysical pathophysiology 우리의 이해를 촉진하기 위해 필요합니다. 여기서는 hematologic 질환에서 발생 pathologic biophysical microvascular 상호 작용을 연구하기위한 표준 내피 세포 배양 기술과 함께 간단한 단일 마스크 microfabrication 프로세스를 사용하여 microvasculature의 체외 모델에서 &quot;endothelialized&quot;를 만드는 방법을보고합니다. 이것은 &quot;microvasculature - 온 - 칩&quot;단단히 생물학뿐만 아니라 biophysical 조건 제어와 표준 주사기 펌프 및 brightfield / 형광 현미경을 사용하여 운영하고 강력한 분석과 연구자를 제공합니다. 이러한 microcirculatory의 hemodynamic 조건, 내피 세포 유형, 혈액 세포 유형 (들)과 집중 (들), 마약 / 억제 농도 등 같은 매개 변수는 쉽게 제어할 수 있습니다. 따라서 우리의 microsystem 제공양적 microvascular 흐름이 때문에 세포 접착, 집합, 그리고 deformability, 기존 assays 함께 사용할 수없는 기능의 변경 사항에 장애되는 질병 프로세스를 조사하는 방식입니다.

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다. 이<em&gt; 체외에서</em&gt; microvasculature 모델은 혈액 세포, 내피 세포, 그리고 hematologic 질병 용해 요인 간의 biophysical 상호 작용 연구를 가능하게합니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

미세가공 기술의 발전으로 생물학적 및 ... 연구를 수행하기 위한 저렴하고 재현 가능한 미세유체 시스템의 제작이 가능해졌습니다.

본 절차의 전반적인 목표는 내피세포가 코팅된 미세유체 장치를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 몰드를 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 PDMS 채널을 만드는 것입니다.다음으로, 내피세포를 장치 내에 파종합니다. 마지막 단계는 장치 내에서 세포를 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 내피세포가 코팅된 미세유체 장치는 인비트로(in vitro) 환경에서 세포 간 상호작용을 보여주는 데 사용됩니다.기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 연구자가 생물학적 및 생물물리학적 조건을 정밀하게 제어할 수 있으며 형광 현미경과 호환된다는 점입니다. 이 방법은 혈액 질환에서의 생물물리학적 세포 간 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 백혈구 생물학, 암 전이 및 조혈모세포 생물학 등의 현상에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자의 경우, 성공적인 세포 안착을 위해 조건을 매우 정밀하게 제어해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.제작 준비 단계에서 마이크로 유체 장치의 컴퓨터 보조 설계(CAD) 이미지를 외부 마스크 업체에 제출하여 포토마스크를 제작합니다. 수령한 마스크는 소다석회 유리에 크롬 층이 증착된 형태로 구성됩니다. 여기서 마이크로 유체 채널의 너비는 30 microns입니다.미세유체 장치 제작을 시작하려면, 베어 실리콘 웨이퍼를 piranha 용액으로 15분 동안 세척한 후, 탈이온수로 10초 동안 헹굽니다. 그다음 실리콘 웨이퍼를 불산(hydrofluoric acid)에 30초 동안 담근 후, 탈이온수로 약 10초 동안 헹굽니다. 이어서 스핀 코터를 사용하여 micro chem SU 8 20 25 포토레지스트를 3000 rpm의 회전 속도로 웨이퍼 위에 30 µm 두께가 되도록 스핀 코팅합니다.과잉 용매를 제거하기 위해 SU 8 20 25이 코팅된 웨이퍼를 95 °C로 설정된 핫플레이트 위에 5분 동안 올려둡니다. 이 단계에서는 오븐 사용을 권장하지 않습니다. 이제 웨이퍼 위에 포토마스크를 배치하고 마스크 라이너에서 UV 광선에 노출시켜 SU 8 20 25 포토레지스트를 가교 결합시킵니다.가교 결합 후, 웨이퍼를 95 °C의 핫플레이트 위에 다시 올려 5분 동안 더 가열합니다. 이는 SU-8 2025 포토레지스트의 중합 반응을 더욱 촉진하기 위함입니다. 그 다음, 주로 PGMEA로 구성된 SU-8 현상액에 웨이퍼를 4분 동안 담급니다.이 과정을 통해 가교되지 않은 SU 8 20 25 감광액이 제거됩니다. 새로 현상된 웨이퍼를 100% isopropyl alcohol로 10초 동안 헹군 다음, 가압 질소를 사용하거나 깨끗한 흄 후드 내에서 수분 동안 용매를 증발시켜 건조합니다. 이제 건조된 웨이퍼를 페트리 접시 중앙에 테이프로 고정하되, 테이프가 웨이퍼의 가장자리에 위치하도록 주의하십시오.마지막으로, 웨이퍼 위에 sigma coat 500 µL를 피펫으로 분주합니다. 페트리 접시의 뚜껑을 덮은 후, 접시를 흔들어 웨이퍼가 완전히 코팅되도록 합니다. 뚜껑을 열고 모든 용매가 증발할 때까지 웨이퍼를 수 분 동안 건조시킵니다.PDMS 폴리머와 경화제를 10:1 중량비로 혼합한 후, 사용 가능한 진공 시스템의 강도에 따라 수 분에서 1시간 동안 진공 데시케이터를 사용하여 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면, 웨이퍼와 디쉬 표면이 덮이도록 혼합물을 디쉬에 붓습니다. 이를 통해 두께가 약 5 mm인 PDMS 시트를 제작합니다.또한 두께 1 mm의 특징 없는 얇은 PDMS 조각을 제작하십시오. 그다음 60 °C 오븐에서 혼합물을 하룻밤 동안 경화시킵니다. 다음 날, 칼이나 메스를 사용하여 웨이퍼 주변을 절단하고 여러 개의 PDMS 미세유체 장치를 분리합니다.그런 다음 시트를 잘라 개별 장치를 분리합니다. PDMS 시트를 미세유체 장치보다 약간 더 크게 자릅니다. 이제 핀 바이스 Harris unicorn 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 미세유체 장치에 입구와 출구 구멍을 만듭니다.다음으로, 스카치테이프를 사용하여 미세유체 장치와 시트의 표면을 세척합니다. 그런 다음 플라즈마 세척기를 사용하여 미세유체 장치와 PDMS 시트의 표면을 30초 동안 산소 플라즈마에 노출시킵니다. 산소 플라즈마는 PDMS의 노출된 표면에 반응성 종을 생성하며, 이는 물리적으로 접촉했을 때 결합하게 됩니다.다음으로, 20게이지 둔탁한 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기에 PBS에 희석된 50 µg/mL 농도의 human plasma 유래 Fibronectin을 채운 후 바늘 위에 적당한 길이의 튜브를 끼웁니다. 첫 번째 튜브 안으로 더 얇은 튜브를 삽입하여 두 튜브 사이에 마찰 맞춤(friction fit) 상태가 되도록 합니다.그 다음 더 가는 튜브의 다른 쪽 끝을 미세유체 장치의 입구에 연결합니다. 시린지에 압력을 가하여 채널을 fibronectin 용액으로 완전히 채우고, 채널이 마르지 않도록 배출구 포트에 100 µL의 작은 방울을 형성합니다. 이제 미세유체 장치를 37 °C의 가습 인큐베이터에서 40~60분 동안 배양합니다.배양 후, PBS가 채워진 새 주사기를 뭉툭한 바늘(blunt point needle)에 연결합니다. 압력을 가하여 미세유체 장치를 PBS로 세척합니다. 8% dextran이 포함된 혈관 내피 성장 배지에서 밀리리터당 500,000개에서 200만 개의 인간 제대정맥 내피세포(hve)를 준비합니다.덱스트란을 첨가하면 세포가 미세유체 장치 내에서 성공적으로 부착 및 배양될 가능성이 높아집니다. 둔탁한 끝바늘(blunt point needle)과 더 넓은 튜브가 장착된 깨끗한 시린지에 세포 현탁액을 채우고, 약 1m 길이의 더 긴 튜브를 연결합니다. 모든 연결 부위에서 누수가 발생하지 않도록 튜브가 단단히 밀착되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다.시스템의 성능을 최적화하기 위해, 시린지나 튜빙 어디에도 기포가 없도록 세포 용액으로 튜빙을 프라이밍하십시오. 이 단계에서 시스템으로 용액이 새거나 기포가 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 용액의 누출이나 배지 내 기포의 존재는 혈관 내피세포의 성공적인 안착을 방해합니다.모든 기포가 제거되고 튜브 전체 길이에 세포 현탁액이 채워지면, 시린지를 펌프에 장착하고 반대쪽 끝을 미세유체 입구에 연결합니다. 시린지 펌프는 미세유체 장치와 동일한 높이로 설정합니다. 긴 튜브는 세포와 배지가 장치에 닿기 전 충분히 가온될 수 있도록 인큐베이터 내에 조심스럽게 말아서 배치합니다.그런 다음 본 시스템에서 세포 현탁액을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건 하에 1.23 µL/min의 부피 유량으로 2시간 동안 미세유체 장치에 주입합니다. 1.23 µL/min의 부피 유량은 가장 작은 채널 내에서 1 mm/s의 중심 유속에 해당합니다. 이는 전혈을 사용할 때 해당 채널 내에서 약 1 dyne/cm²의 벽 전단 응력과 유사합니다.세포 현탁액 주입이 완료되면, 동일한 시린지 펌프와 긴 튜브에 더 큰 시린지를 사용하여 1.23 µL/min의 속도로 2~8일 동안 신선한 성장 배지를 주입합니다. 세포 단층이 원하는 수준의 합류도(confluence)에 도달하면, 실험을 위해 혈액 또는 세포 현탁액을 시스템에 주입합니다. 여기에서는 내피세포화 전의 미세유체 소자가 표시되어 있습니다.혈관 생리학을 모방한 장치의 크기, 규모 및 전체적인 설계를 보여주기 위해 미세유체 장치에 식용 색소를 주입하였습니다. 명시야 현미경 관찰 결과 미세유체 장치의 내피세포화가 확인되었습니다. 이 이미지는 기술된 프로토콜에 따라 세포를 파종한 후 48시간 이내에 획득한 것으로, 최적화된 관류 기술을 통해 내피세포가 미세유체 시스템의 전체 내부 표면에서 합류성(confluently) 있게 배양될 수 있었습니다.세포 파종 후 24~48시간 이내에 진행합니다. 이 공초점 이미지에서 볼 수 있듯이, 미세 채널이 포함된 칩 위의 미세혈관 종양은 대부분의 낫적혈구 질환 미세혈관 폐쇄 사건이 발생하는 부위인 모세혈관 후 정맥의 크기인 30 micron과 유사합니다. 본 실험에서는 건강한 환자의 전혈을 탈산소 조건에서 칩 위의 미세혈관 장치로 주입합니다.이 영상은 당사의 내피세포 미세유체 시스템 내 전혈의 흐름이 마이크로채널의 폐쇄 구역 없이 규칙적이고 부드럽게 지속됨을 보여줍니다. 여기서는 낫형 세포 빈혈 환자의 전혈을 칩 상의 미세혈관 장치에 주입합니다. 탈산소 조건에서는 여러 채널에서 완전한 폐쇄가 나타나며 혈류의 상당한 변화가 관찰됩니다.이 절차를 수행할 때, 튜브를 교체하는 과정에서 기포가 유입되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 완성된 장치는 형광 현미경과 호환되며 전통적인 형광 분석법에 맞게 조정하여 사용할 수 있습니다. 이 기술은 실험 혈액학자들이 제어된 생물물리학적 및 혈역학적 환경에서 단일 세포를 이용해 실험을 수행할 수 있는 길을 열어줍니다.기포가 없어야 합니다.

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

혈류 하의 혈소판 기능을 평가하고 시뮬레이션된 지혈 소생술을 외상 및 수혈 의학에 응용하는 미세유체 장치를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

여기서는 내피세포를 동기화된 진동성 고혈당과 맥동성 전단 스트레스에 노출시키는 마이크로유체 시스템을 제작하고 작동시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 당뇨병 내피 기능 장애 연구를 위한 생리학적으로 적합한 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스와 내피 세포 반응의 정량적 측정을 가능하게 합니다.

생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

배우세요 혈액학 질환에서 혈관내피 세포와 혈액 세포의 상호작용을 연구하기 위한 내피화 마이크로유체 장치 제작법을. 이 체외 모델은 질병 기전 연구에 활용됩니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

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