쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

CRE matric 미세혈관의 생체 내 현미경 관찰은 가로무늬근 조직의 허혈 및 재관류 손상을 통찰하는 편리한 방법입니다. 본 단계별 프로토콜에서는 동물을 장시간 안정적으로 마취 상태로 유지하기 위해 동맥 캐뉼라 삽입을 통한 충분한 모니터링 하에 호흡 조절 마취를 시작하는 방법을 설명합니다. 또한 경정맥에 캐뉼라를 삽입하는 방법을 보여주고, 뛰어난 광학 해상도를 얻기 위해 CRE matric을 얇고 평평한 시트 형태로 준비하는 과정을 기술합니다.

당사 연구실에서 잘 정립된 허혈 재관류 손상 시의 백혈구 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 모델은 허혈 재관류 손상 연구를 위한 산화 스트레스 작용을 분석하는 데 사용될 수 있습니다.

허혈-재관류 손상은 심근경색, 장 허혈뿐만 아니라 이식 및 심혈관 수술 후와 같은 광범위한 병리적 상태와 관련이 있습니다. 이전에 허혈 상태였던 조직의 과관류는 비가역적인 조직 손상을 방지하는 데 필수적이지만, 활성 산소종의 생성, 보체 시스템의 활성화 및 미세혈관 투과성 증가와 더불어 해당 조직의 과도한 염증을 유발합니다. 백혈구의 활성화는 재관류 중 발생하는 염증성 조직 손상의 병리적 연쇄 반응에서 핵심적인 역할을 하는 주요 요인 중 하나입니다.

본 연구에서는 허혈-재관류 손상 시 백혈구 활성화를 분석하는 편리한 방법으로 모세혈관 후 정맥의 생체 내 현미경 관찰법을 제안합니다. 또한, 독자가 이 방법을 정확하게 이해하고 안전하게 수행할 수 있도록 일반적인 실수 사례와 유용한 팁을 설명합니다. 윤리 위원회의 승인을 받은 후, 체중 120~180g의 수컷 랫드를 마취하여 플렉시글라스 상자에 넣고, 이소플루란 기화기를 통해 2~3 volume %의 이소플루란을 투여합니다.

적절한 마취 수준에 도달하면, 쥐의 체중을 측정하고 복측 경부 영역의 털을 제거합니다. 체온을 37 °C로 유지하기 위해 쥐를 가열 패드 위에 등으로 눕힌 상태로 배치하고, 실리콘 마스크를 사용하여 2 volume %의 isoflurane을 투여합니다. 다음의 준비 과정은 수술용 현미경을 사용하여 수행하는 것이 가장 좋습니다.

SRA의 흉골 절흔 부위에 2cm 길이의 수평 피부 절개를 실시합니다. 타액선을 외측으로 박리합니다. 이제 복측 목 근육이 나타납니다.

중앙선을 따라 조심스럽게 분리한 후 기관을 찾습니다. 기관을 1~2cm 정도 노출시키고, 아래쪽에서 마이크로 포셉을 사용하여 기관을 들어 올립니다. 이제 기관의 복측 중간 지점에 약 14 gauge 튜브를 기관 튜브로 삽입하여 기관 하부로 연결하며, 해당 튜브는 이전에 동물용 인공호흡기에 연결되어 있어야 합니다.

그 후 호흡은 분당 35~45회의 빈도로 용량 조절이 가능합니다. 경동맥 캐뉼라 삽입을 위해 4.5~5 mL의 일회 호흡량과 1.5~2 vol%의 isoflurane 농도를 유지합니다. 둔성 박리를 통해 우측 흉골설골근을 분리합니다.

경동맥의 위치를 찾으려면 미주신경을 경동맥에서 조심스럽게 분리한 후, 경동맥을 Anki 마이크로 포셉으로 고정하여 심장에서 흘러나오는 혈류를 차단합니다. 심장을 기준으로 경동맥 아래쪽에 두 군데의 봉합사를 묶는데, 원위부 봉합사는 단단히 묶고 근위부 봉합사는 경동맥 주위에 느슨하게 묶습니다. 두 결찰사 사이의 경동맥을 마이크로 가위로 작게 절개하여 마이크로 포셉을 제거한 후, 두 번째 근위부 봉합사를 적용하여 출혈을 방지합니다. 압력 변환기에 연결된 생리식염수가 채워진 폴리에틸렌 카테터를 삽입합니다.

마이크로 포셉을 제거하고 카테터를 동맥 안으로 더 깊숙이 삽입합니다. 혈액 가스 분석기를 사용하여 간헐적으로 동맥혈 가스 분석을 수행하고, 형광 염료나 다른 관심 약물을 정맥 투여하기 위해 혈액 pH를 생리학적 범위 내로 유지합니다. 수술용 현미경으로 왼쪽 경정맥 부위를 관찰하면서 양손에 포셉을 잡고 얇은 근막을 찢어 경정맥을 노출시킵니다.

혈류를 차단하기 위해 경정맥을 각도가 있는 마이크로 포셉으로 고정합니다. 포셉을 사용하여, 경동맥 캐뉼라 삽입과 동일한 방식으로 동일한 길이의 봉합사 두 가닥을 경정맥 아래로 통과시킵니다. 경정맥에 작은 절개를 내고 세포주 용액으로 플러싱한 폴리에틸렌 카테터를 삽입합니다. 카테터를 심장 방향으로 밀어 넣고 심장에 더 가까운 결찰사를 조입니다.

정맥과 카테터 주변에는 가열 패드의 목표 온도에 빠르게 도달하는 알루미늄 소재의 스테이지 4 고환거근 영상 장치를 사용합니다. 최초 절개는 음낭 위쪽의 매우 먼 끝부분에 있는 피부와 외정삭근에 가하며, 이어서 미세 가위를 사용하여 피하 공간을 조심스럽게 확장합니다. 조직이 노출되는 즉시 예열된 식염수로 습윤 상태를 유지합니다.

외부 정삭근막과 CRE master 근육 사이의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 주변 조직으로부터 trimester 근육을 분리합니다. 절개 중 지속적인 표면 관류를 통해 조직을 수분 상태로 유지하면 가시성이 확보되어 제거가 용이해집니다. 복측 면의 sac 원위단 내부에서 S의 끝부분을 눌러 약간 확장시켜 CRE master S의 원위단을 고정하고, 절개선을 근위 방향으로 연장합니다. 미세 가위를 사용하여 절개선을 따라 출혈 혈관을 조심스럽게 결찰합니다.

열처리 장치를 이용하여, 노출된 고환거근은 알루미늄 받침대 위에 평평하게 놓이며, 고환 아래의 상피 조직과는 작은 동맥과 정맥을 포함한 얇은 인대로 여전히 연결되어 있습니다. 전기 소작기를 사용하여 혈관을 봉합하고 디스크 조직과 고환거근 조직 사이의 연결 인대를 절단합니다. 격리된 고환을 서혜관 안으로 조심스럽게 밀어 넣습니다.

조직을 네 군데 꿰매고 실을 조심스럽게 펼쳐 고정하는 1차 고정 외에도, 고환올림근 조직을 알루미늄 스테이지 위에 방사형으로 넓게 펼칩니다. 관류 설정을 위해 폴리에틸렌 카테터의 양 끝을 고환올림근 조직 가까이에 배치합니다. 주사기를 사용하여 고환올림근 주변에 바세린 라인을 그려 액체 챔버를 만듭니다.

정사각형 커버슬립을 조직 위에 덮고 가장자리를 바세린 라인에 단단히 부착합니다. 이제 고환올림근 조직을 현미경으로 촬영할 준비가 되었습니다. 기본적인 생체 내 관찰 설정은 달라질 수 있습니다.

EP 적층을 위해 470 nanometer LED 광원이 장착된 생체 내 에피 형광 현미경을 사용합니다. 수침 렌즈를 사용하여 약 800 x 배율을 구현하고 고해상도 디지털 카메라를 통해 관찰 내용을 기록합니다. 에피 형광 이미징을 위해 실험은 암실에서 수행해야 합니다.

백혈구 라벨링을 위해, 체중 kg당 0.4 mg의 농도로 rumine six J를 경정맥 카테터를 통해 정맥 주사하십시오. 관찰을 위해 모세혈관 후 정맥을 선택하십시오. 혈관의 크기는 20~60 µm 범위여야 하며 혈류가 충분해야 합니다.

허혈이 발생하기 전, 조직을 30분 동안 안정시킵니다. 그 후, 백혈구의 롤링 및 부착에 대한 기저값을 설정하기 위해 30초 동안 기록을 수행합니다. 적용 포셉을 사용하여 노출된 정삭 조직의 매우 근위단에 bemer vessel clip을 조심스럽게 배치합니다.

허혈 후 30분이 지나면 혈관 클램프를 제거합니다. 이후 재관류 기간 동안 계속해서 기록을 수행할 수 있습니다. 백혈구 롤링을 정량화하기 위해, 모든 기록에서 일관되게 적용될 혈관을 수직으로 가로지르는 가상선을 설정합니다.

30초 동안 라인을 통과하는 롤링 백혈구(rolling leukocytes)의 수를 수동으로 측정합니다. 부착 백혈구(adherent leukocytes)의 정량을 위해, 모든 기록에서 일관된 200 µm 혈관 구역을 설정합니다.

30초 동안 정지 상태를 유지하는 뚜렷하게 보이는 백혈구의 수를 측정합니다. 대표적인 결과는 서면 프로토콜 내에 제공되어 있습니다. 허혈 재관류 손상은 다양한 장기 시스템과 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, 본 논문에서는 골격근 조직의 재관류 손상 시 백혈구-내피세포 상호작용을 분석하는 방법을 설명합니다.

따라서 다른 장기의 허혈 후 조직 손상 또한 동일한 염증 기전이 관여한다고 가정하므로, 특히 유리피판술(flip surgery)과 밀접한 관련이 있습니다. 설명된 방법은 허혈 재관류 손상의 병리적 기전에 대한 원리적 통찰을 얻는 데 사용될 수 있습니다. 갈마근(cremaster muscle)에 허혈을 유도하는 방식은 쉽게 수행할 수 있으며, 유리피판술과 같은 임상적으로 유의미한 조건들을 완벽하게 반영합니다.

또한, 냉허혈 또는 온허혈과 같은 변형이나 염증에 영향을 미치는 물질을 이용한 염색체적 표면 관류를 쉽게 적용할 수 있습니다. 기록 전 몇 시간 또는 며칠 전에 치료가 필요한 경우에는 구강 내 주사가 적절한 방법이 될 수 있습니다.