나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

다음 실험의 전반적인 목적은 상관 형광 및 전자 현미경법을 사용하여 단백질과 전자 현미경 사진의 위치를 국소화하는 것입니다. 여기에서는 nano FEM으로 알려진 이 방법을 사용하여 C. elegans 내의 단백질 위치를 국소화합니다. 먼저, histone TD eos를 발현하는 형질전환 웜을 플라스틱에 매립하고 절편을 제작합니다.

각 섹션은 광활성화 국소화 현미경(PALM)과 주사 전자 현미경(SEM)으로 모두 이미징됩니다. 각 섹션에 대한 두 개의 마이크로그래프는 Photoshop의 기준 마커를 사용하여 정렬됩니다. 상관 관계 이미지는 핵 내 히스톤 분자의 국소화를 보여줍니다.

따라서 오늘 설명할 기술의 주요 장점은 면역 전자현미경(immuno EM)을 사용하는 대신 유전적으로 부호화된 형광 단백질을 사용하여 모든 단백질이 형광 단백질과 결합되어 있다는 점입니다. 면역 전자현미경을 다룰 때 많은 항체는 플라스틱과 반응하지 않을 수 있습니다. 이는 단순히 호환되지 않는 문제이며, 설령 호환되더라도 항체가 항원이 있는 절편 깊숙이 침투하지 못하는 경우가 많습니다.

형광 단백질을 이용하면 모든 단백질에 형광 표지를 붙일 수 있습니다. 따라서 오늘은 shige wbi가 이 기술을 시연할 예정입니다. 다음 절차는 형광 단백질 TDE os가 표지된 히스톤을 발현하는 형질전환 선충을 사용하여 시연됩니다.

본 시연에서는 박테리아를 동결 보호제로 사용하지만, sea elegance를 동결할 때 20% BSA를 사용할 수도 있습니다. 동결 치환 1시간 전에 자동 동결 치환 장치 또는 FS 장치를 액체 질소로 채우십시오. 또한 사전에 동봉된 문서의 지침에 따라 필요한 고정액을 준비하고, 고정액을 1 mL씩 분주하여 cryo vial에 보관한 후 사용 전까지 액체 질소에 넣어두십시오.

페인트 브러시를 사용하여 박테리아 층에서 동물들을 떠내어 100 micron 시료 캐리어에 옮겨 담습니다. 공기 방울이 생기지 않도록 컵에 시료를 약간 넘치게 채웁니다. 준비가 완료되면 시료 컵을 고압 냉동기의 암처(armature)에 놓아 동결시킵니다. 그 후 즉시 시료를 냉동 챔버 옆의 액체 질소 조(bath)로 옮깁니다.

다음으로, 핀셋과 포셉을 사용하여 시료를 고정액이 들어 있는 cryo vial로 옮깁니다. 시료가 항상 액체 질소에 잠겨 있도록 주의하십시오. 각 시료에 대해 이 과정을 반복한 후, 모든 cryo vial을 FS unit으로 옮깁니다.

모든 cryo vial을 FS 장치에 넣은 후 프로그램을 시작합니다. 냉동 및 처리 프로토콜은 이 도식에 나와 있습니다. 초기 -90 °C 배양 동안 유리질 얼음이 아세톤 내의 고정액으로 교체됩니다.

그 후 시료의 온도가 상승함에 따라 액체 아세톤 내의 고정제가 시료를 가교 결합하여 구조를 보존합니다. FS 장치의 온도가 -60 °C에 도달하면 95% 아세톤 20 mL가 담긴 신틸레이션 바이알을 FS에 넣어 냉각시킵니다. 이어서 온도가 -50 °C에 도달하면 P 200 팁이 장착된 파스퇴르 피펫을 사용하여 고정제를 제거하고, 각 시료에 미리 냉각시킨 95% 아세톤 약 1 mL를 첨가합니다. 담즙.

이 과정을 2시간 동안 20분마다 반복하십시오. 또한, -50 °C 배양 중에 95% acetone에 희석된 0.1% uranyl acetate 20 mL가 담긴 신틸레이션 바이알을 FS 챔버에 넣어 -50 °C로 예냉하십시오. 그 후 마지막 acetone 세척이 끝나면, 각 바이알에 uranyl acetate 용액 약 1 mL를 첨가하여 샘플을 염색함으로써 막의 대비를 높이십시오.

프로그램이 일시 중지된 경우, 이를 다시 시작하십시오. 온도가 -40 °C에 도달하면 95% ethanol이 들어 있는 신틸레이션 바이알을 FS 챔버에 넣으십시오. 온도가 -30 °C에 도달하면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 2시간 동안 20분마다 urinal acetate를 95% ethanol로 교체하십시오.

아세톤이 있으면 수지가 중합되지 않으므로 이 단계에서는 에탄올을 사용하는 것이 중요합니다. 프로토콜의 다음 부분에서는 시편이 -30 °C 상태일 때 플라스틱에 매립합니다. FS에서 95% 에탄올을 미리 냉각시킨 30% glycol methacrylate 수지 또는 95% 에탄올 내의 GMA로 교체하십시오. 3~5시간 후에 30% GMA를 70% GMA로 교체하고, 4~6시간 후에 70% GMA를 제거한 뒤 시편을 97% GMA에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

GMA 농도를 단계적으로 높이면 배지가 조직 내부로 침투할 수 있습니다. GMA 레진에 3%의 물이 첨가되므로, 97% GMA는 희석되지 않는다는 점에 유의하십시오. 다음 날 에탄올 처리를 마친 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플을 A FS 내의 임베딩 몰드로 옮깁니다. 샘플을 임베딩 몰드에 넣은 다음, -30 °C에서 6시간 동안 신선하게 제조된 GMA로 97% GMA를 세 번 교체합니다.

세 번째 교환 후, 박테리아 매트릭스를 두드려 표본을 동결보호제로부터 분리하십시오. 환기 바이알에 담긴 97% GMA에 개시제인 nn dimethyl udine을 첨가합니다. 개시제의 첨가량은 GMA 1 mL당 1.5 µL입니다. GMA 용액을 각 매립 몰드에 즉시 넣고, 동물들이 고르게 배치되도록 몰드 내에 위치시킵니다.

온도가 -20 °C까지 상승하도록 프로그램을 재시작하십시오. 수지는 1시간 이내에 빠르게 중합되지만, 완전히 중합되었는지 확인하기 위해 플라스틱을 -20 °C에서 밤새 경화시키십시오.

플라스틱이 경화되면, 시편을 질소 가스가 충전된 진공 백에 넣어 -20 °C에서 보관하십시오. GMA에 매립된 시편의 박절은 광활성화 국소화 현미경 또는 PALM 이미징을 위해 제공된 관련 문서에 기술된 대로 수행해야 합니다. 현미경 시스템의 EMCCD 카메라는 -70 °C 또는 그 이하로 설정되어야 합니다.

피펫을 사용하여 100 nm 금 입자가 1×10¹⁰ particles/mL 농도로 포함된 용액 약 50 µL를 이미징할 샘플에 도포합니다. 샘플 위에 검은색 커버 케이스를 덮고, 용액이 커버 슬립 위에서 30초 동안 머물도록 둡니다. 금 용액을 제거하려면 용액을 커버 슬립 가장자리로 밀어낸 후 킴와이프(kim wipe)로 흡수시킵니다.

그 다음 진공 그리스를 원형 커버슬립 홀더에 바르고 커버슬립을 삽입합니다. 커버슬립 아랫면에 침유를 도포합니다. 이를 시료 바로 아래로 밀어 넣습니다.

샘플 홀더를 현미경 스테이지의 슬롯에 삽입하고, 섹션들이 대물렌즈 위에 정확히 중앙에 위치하며 단단히 고정되도록 조정합니다. 이때 대물렌즈에 닿지 않도록 각별히 주의하십시오. 다음으로, 명시야 조명을 사용하여 10x 대물렌즈로 섹션의 위치를 찾습니다.

그런 다음 100 x 대물렌즈로 교체하고 표본의 초점을 맞춥니다. 필요한 경우, 강도를 10%로 설정한 488 nanometer 레이저를 사용하여 형광 조명으로 전환하십시오. 시료의 온도가 평형을 이룰 때까지 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 형광이 가장 밝은 영역을 찾아 초점을 맞춥니다.

레이저를 561 nanometers로 전환하고 강도를 100%로 높입니다. 배경 자가형광을 제거하기 위해 샘플을 약 2분 동안 블리칭(bleach)합니다. 블리칭 중에 초점이 변경되면, 초점을 조정하고 이미지를 캡처하기 전 5분 정도 기다립니다. 블리칭이 완료되면 405 nanometer 레이저를 활성화하고 강도를 최저로 설정합니다.

초당 20프레임의 속도로 이미지 수집을 시작합니다. 본 실험의 목적을 달성하기에 충분한 프레임을 수집하십시오. 핵 내 584개 히스톤 단백질의 국소화를 결정하기 위해 5,000에서 6,000프레임을 촬영합니다.

5,000 프레임이 수집되면, 이미징 소프트웨어가 모든 분자를 식별하고 매핑합니다. 최종 형광 이미지 또는 소위 서프(surf) 이미지는 카메라에서 검출된 모든 형광의 합성물입니다. 이와 대조적으로, 팜(palm) 이미지는 각 형광 점의 OID를 매핑하여 각 단백질이 위치한 지점만을 나타냅니다.

SEM 이미징에 앞서, 2.5% urinal acetate 수용액을 사용하여 절편을 4분 동안 염색합니다. 필터링된 milli QE water로 urinal acetate를 충분히 세척합니다. 절편이 건조되면, 커버슬립이 상당히 어두워질 때까지 스퍼터(sputter)를 사용하여 카본 코팅을 수행합니다.

커버슬립 표면에 축적되는 전자가 접지될 수 있도록, 커버슬립의 한쪽 끝과 반대편 금속 스터브에 탄소 전도성 테이프를 부착합니다. SEM 챔버에 커버슬립을 장착하고 현미경에서 시료의 위치를 찾습니다. 시료의 저배율 이미지를 촬영한 후, 관심 영역으로 확대하여 고배율 이미지를 얻습니다.

모든 섹션의 이미징이 완료될 때까지 새로운 섹션으로 이 과정을 반복합니다. 다음으로, palm 이미지와 EM 이미지를 정렬해야 합니다. 이를 위해 먼저 획득한 SEM 이미지를 Photoshop에서 엽니다.

가로 5,000 픽셀, 세로 5,000 픽셀 크기에 해상도 300 pixels per inch인 새 창을 생성합니다. 불러온 배율의 SEM 이미지를 새 창으로 복사합니다. 편집 메뉴에 있는 자유 변형(free transform) 명령을 사용하여 이미지가 창 전체를 채우도록 크기를 조절합니다.

그런 다음 고배율 SEM 이미지를 복사하고 필요에 따라 크기를 조정 및 변환하십시오. 이미지 드롭다운 메뉴 바에서 이미지 회전을 선택하고 sum turf 이미지를 수평으로 반전시키십시오. sum turf 이미지를 복사하여 새 레이어에 붙여넣으십시오.

편집 메뉴에 있는 자유 변형(free transform) 명령을 사용하여 이미지를 저배율 전자 현미경 사진과 대략 동일한 크기가 되도록 조정하십시오. 그런 다음, 금 입자의 형광 위치가 SEM에서 시각화된 해당 구조와 일치하도록 이미지를 적절히 회전시키십시오. 다음으로, palm 이미지를 새 레이어로 복사하고 동일한 변형을 적용하여 더 높은 배율의 이미지를 추출하십시오.

관심 영역을 확대하고 해당 영역에서 팜(palm) 이미지를 복사하십시오. 발표를 위해 이 이미지를 더 높은 해상도의 SEM 이미지에 붙여넣으십시오. 팜 신호는 유지하면서 검은색 배경만 투명해지도록 팜 이미지에 그라데이션 투명도를 적용해야 합니다.

변환된 손바닥 이미지를 새 레이어에 복사합니다. 선택 드롭다운 메뉴에서 색상 범위(color range)를 사용하여 배경을 제외한 손바닥 신호만을 선택합니다. 그런 다음 배경 픽셀을 참조로 선택하고 반전(invert) 옵션을 켭니다.

원하는 팜 신호를 잘라내어 새 레이어에 붙여넣습니다. 배경 레이어에 투명도를 적용하여 10%로 설정합니다. 이렇게 하면 강도를 손상시키지 않으면서 배경을 투명하게 만들어 팜 신호를 시각화할 수 있습니다. 히스톤 단백질.

His 11 태그가 붙은 TD eos는 선충 c elgan에서 안정적으로 발현되었으며, 형질전환 동물은 이 비디오에 설명된 프로토콜을 사용하여 처리 및 이미징되었습니다. PALM 및 전자 현미경 사진은 동일한 절편에서 획득되었습니다. 형광 및 전자 현미경 사진 모두에서 나타나는 금 나노입자는 이후 두 이미지를 정렬하는 데 사용되었습니다.

여기서는 현미경 사진의 상단 끝부분 근처 영역을 확대해 보겠습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 핵과 같은 세포 내 세부 구조가 관찰됩니다.

핵, 핵공, 그리고 소포체가 관찰될 수 있습니다. 하지만 태그가 붙은 히스톤 분자들은 오직 핵에만 국한되어 위치하며, 핵 외에는 나타나지 않습니다. 예상대로, 상관 팜(palm) 및 전자 현미경 분석을 통해 최고 해상도로 단백질 위치를 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행한 후, 단백질 분포가 포함된 이러한 절편들을 가져와 어레이 토모그래피(array tomography)를 사용하여 쌓음으로써 세포 내 단백질 분포 위치를 보여주는 3차원 구조를 생성할 수 있습니다.

그리고 사산화오스뮴(osmium tetroxide)을 사용할 때는 매우 위험한 화학 물질이므로 항상 장갑을 착용해야 함을 기억하십시오.