Name: 나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 학습하세요 나노 FEM 기법을 통해 형광 단백질이 표지된 단백질을 전자현미경 사진에서 정밀하게 위치시키는 방법을. C. elegans를 이용한 이 상관 현미경 기술은 세포 내 단백질 분포 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 증명 원리 실험, 고정 프로토콜 시약과 격려를 공유 리차드 족쇄를 채우다을위한 PALM 현미경에 대한 접근 랄드 헤스와 에릭 Betzig 감사드립니다. 우리는 DNA 구조에 대한 마이클 데이비슨, 제랄딘 Seydoux, 스테판 Eimer, 루돌프 Leube, 키이스 Nehrke, 기독교 Frøk​​jr - 젠슨, 오드 에이다 - Nguema과 마크 Hammarlund 감사드립니다. 우리는 또한 Zeiss PAL-M, Zeiss Elyra P.1 PALM 현미경의 베타 버전에 대한 액세스를 제공하기 위해 칼 Zeiss 주식회사 감사드립니다.

<ol><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24(2010).</li>
<li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li>
<li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images%3A+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li>
<li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light%2C+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li>
<li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li>
<li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

이 기사에 생산 및 무료 액세스 칼 Zeiss 주식회사가 후원합니다

여기 플라스틱, 전자 현미경을 사용하여 ultrastructure을 섹션에 형광 단백질을 현지화 및 이미지 형광 단백질을 유지하는 방법에 대해 설명합니다. 단백질은 나노 미터 해상도 PALM 현미경을 사용하여 회절 한계 이하로 현지화되었습니다. 특정 표본이 프로토콜을 적응하려면 다음 매개 변수 고려되어야합니다 : 형광, 정량화 및 정렬을. 형광 단백질 또는 유기 형광의 선택은 응용 프로그램 및 모델 시스템에 따라 달라집니다. 우리는 EGFP, YFP, 황수정, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry, 그리고 Dendra 12 등의 형광 단백질의 다양한, 테스트했습니다. 각 형광의 형광의 보존은 형광 단백질은 설명 방법을 사용하여 보존 할 수 있다는 제안, 비슷했다. 이 표현 때문에 우리는 C.에 잘 tdEos를 선택 elegans, 단백질은 tdEos에 융합 할 때 기능 유지, 그리고 또 다른 이유는 그사진 인증 특성은 PALM 현미경을위한 최적했다. 그러나, tdEos의 집합 또는 실패 표현식은 경우에 따라 12 관찰되었습니다. 응용 프로그램에 따라 다른 형광 더 적합한 수 있습니다. 대부분의 경우, 그것은 사진 활성 형광 단백질을 사용할 필요가 없습니다. 간단한 상호 형광 전자 현미경은 사진 활성 형광 단백질을 필요로하지 않습니다. GFP 또는 유기 염료는 회절 한도를 초과 섹션에 태그를 단백질에서 이미지 형광에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 이미지를 형광 현미경을 사용하여 neuropil의 축삭 및 이미징에 의한 전자 현미경에서 특정 축삭 형광 현미경에 형광과 형광 신호를 상관 관계 할 수 있습니다. 이러한 자극 방출 고갈 현미경 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 12, 개별 분자 수익 (GSDIM) 13 다음 바닥 상태의 고갈 현미경과 같은 다른 슈퍼 해상도 기술,구조적 조명 현미경 (SIM) 14 사진 활성 형광 단백질이 필요하지 않습니다. 또한, 유기 염료 9,15,16 또는 형광 프로브 17 본질적인 속성을 사용 슈퍼 해상도 이미징 기술은 쉽게 적용 할 수 있습니다. 각 분자의 형광이 spatially과 시간적으로 분리되어 있기 때문에 PALM에서 분자의 수는 정량화 할 수 있습니다. 산화, undercounting, overcounting 및 overexpression : 그러나, 정량화 네 이유로 오해의 소지가있을 수 있습니다. 첫째, 형광 단백질의 일부가 변성 또는 샘플 처리 5,12 동안 산화 할 수 있습니다. 형광 신호의 ~ 90 %가 우리의 프로토콜에 고정하고 삽입을 통해 보존되었지만 표본이 sectioned되었으며 표면이 산소에 노출 후, 형광 단백질의 산화가 발생할 수 있습니다. 둘째, 사진 activatable 단백질의 활성화 확률이며, 따라서 여러 분자가 될 수 있습니다주어진 회절 제한된 장소 8 활성화. 여러 분자의 형광은 한 점으로 표시됩니다, 따라서 단백질의 총 수는 undercounted됩니다. 셋째, 비슷한 문제가 overcounting 될 수 있습니다. PALM에서 표백하여 각 형광 단백질은 지역화되어 있으며 다음 &quot;삭제&quot;. 그러나, 형광 단백질은 18 영구적으로 표백 않고 어두운 상태에서 돌아갈 수 있습니다. 이러한 분자 그런 다음 여러 번 계산 될 것입니다. 넷째, 태그 단백질은 transgenes으로 표현하고 자주 overexpression 될 수 있습니다 여러 복사본에 제시되어 있습니다. 따라서, PALM의 정량화는 지정된 위치에 분자의 수를 추정하지만, 정확하게 확인할 수 없습니다하는 데 사용할 수 있습니다. 전자 현미경과 PALM 이미지의 정렬은 또한 때문에 전자빔에 의한 빛과 전자 현미경과 왜곡의 해상도 차이에 도전 할 수 있습니다. 골드 입자는 단단히 LOC 제공전자 micrographs의 fiducial 마커를 alized. 그러나, 금 입자의 fluoresecence이 사진 활성화되어 있지 않습니다, 대형 회절 - 제한된 곳으로 나타납니다. 따라서, 전자 현미경을 통해 형광 이미지의 게재 위치는 추정치입니다. 왜곡은 또한 플라스틱 섹션 전자의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 같은 GMA와 같은 아크릴 수지는 전자빔에 따라 덜 안정적이며, 플라스틱의 크기가 변경 될 수 있습니다. 이러한 상황에서 ultrastructure으로 형광을 정렬하면 fiducial 마커의 비 선형 변환이 필요할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 또는 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 고압 냉동기 </td><td> 상자를 </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact과 Wohlwend에서 Leica 또는 hpf-01에서 HPM (100)는도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 자동 동결 대체 단위 </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> 니콘과 Vutara 또한 상업적 PALM의 현미경을 판매하고 있습니다. </td></tr><tr><td> 전자 현미경 </td><td> 페이 </td><td> 노바 나노 </td><td> 기타 고해상도 SEM의 현미경을 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> 오스뮴 tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> 칼륨 과망간산 염 </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민의 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl 아세테이트 </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> 이 회사의 uranyl 아세트산의 pH는 약간 높다. </td></tr><tr><td> 글리콜 메타 크릴 레이트 (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> 낮은 산, TEM 등급. </td></tr><tr><td> N, N-디메틸-P-toluidine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo 튜브 </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 병 </td><td> EMS </td><td> 72,632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar 필름 </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM 캡슐 </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 3 / 8 &quot;디스크 펀치 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 54,741 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 나노 입자 </td><td> 마이크로 - nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> 2 배 농축 솔루션을 요청 </td></tr></tbody></table>

나노 fem : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

단백질의 분포를 매핑하면 셀에 단백질의 기능을 이해하는 것이 필수적입니다. 형광 현미경은 광범위하게 단백질 현지화에 사용하지만, subcellular 문맥 형광 이미지에 자주 결석입니다. Immuno-전자 현미경은 반면에, 단백질을 지역화 할 수 있지만, 대부분의 항원이 표본 표면에 노출되지 않기 때문에 기술은 호환 항체, 형태와 가난한 보존의 부족에 의해 제한됩니다. 상호 접근 방식 중 하나 immuno-형광이나 유전자 태그 단백질, 먼저 전체 셀에서 형광 이미지를 취득 할 수 있습니다. 예제는 다음 고정 및 전자 현미경에 내장하고, 이미지가 1-3 상관이됩니다. 그러나, 낮은 해상도 형광 이미지와 fiducial 마커의 부족은 단백질의 정확한 현지화를 배제. 또한, 형광 이미징은 플라스틱의 표본을 보존 한 후에 수행 할 수 있습니다. 에이 방법은 블록 sectioned이며, 형광 이미지와 동일한 섹션의 전자 micrographs는 4-7를 서로 관련되어 있습니다. 그러나, 상관 이미지에 빛의 회절 한계는 개별 분자의 위치를​​ 가린다하고, 형광은 종종 세포의 경계 넘어 확장합니다. 나노 해상도 형광 전자 현미경 (나노 FEM)이 사진 활성 현지화 현미경 (PALM)과 전자 현미경을 사용하여 이미징 같은 섹션으로 나노 스케일의 단백질을 현지화하기 위해 설계되었습니다. PALM는 영상 개인 형광 단백질에 의해 회절 한계를 극복하고 이후 각 형광 현장 8-10의 중심을 매핑. 우리는 다섯 단계에있는 나노 FEM 기술을 설명합니다. 먼저, 예제는 고정 및 태그 단백질의 형광을 보존 조건을 사용하여 포함하고 있습니다. 둘째, 수지 블록 장착 ultrathin 세그먼트 (70-80 nm 정도)에 sectioned 아르커버 유리에. 셋째, 형광은 Zeiss의 PALM 현미경을 사용하여 이러한 섹션에 이미징된다. 넷째, 전자 고밀도 구조는 스캔 전자 현미경을 사용하여 이러한 동일한 섹션에 이미징 있습니다. 다섯째, 형광 및 전자 micrographs는 fiducial 마커 등의 금 입자를 사용하여 정렬된다. 요약하면, 휘황 태그 단백질의 subcellular 지방화는 약 1 주일 나노 미터 해상도로 결정될 수있다.

우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

단백질의 분포를 매핑하는 것은 세포 내 단백질의 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 형광 현미경은 ...에 광범위하게 사용됩니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 상관 형광 및 전자 현미경법을 사용하여 단백질과 전자 현미경 사진의 위치를 국소화하는 것입니다. 여기에서는 nano FEM으로 알려진 이 방법을 사용하여 C. elegans 내의 단백질 위치를 국소화합니다. 먼저, histone TD eos를 발현하는 형질전환 웜을 플라스틱에 매립하고 절편을 제작합니다.각 섹션은 광활성화 국소화 현미경(PALM)과 주사 전자 현미경(SEM)으로 모두 이미징됩니다. 각 섹션에 대한 두 개의 마이크로그래프는 Photoshop의 기준 마커를 사용하여 정렬됩니다. 상관 관계 이미지는 핵 내 히스톤 분자의 국소화를 보여줍니다.따라서 오늘 설명할 기술의 주요 장점은 면역 전자현미경(immuno EM)을 사용하는 대신 유전적으로 부호화된 형광 단백질을 사용하여 모든 단백질이 형광 단백질과 결합되어 있다는 점입니다. 면역 전자현미경을 다룰 때 많은 항체는 플라스틱과 반응하지 않을 수 있습니다. 이는 단순히 호환되지 않는 문제이며, 설령 호환되더라도 항체가 항원이 있는 절편 깊숙이 침투하지 못하는 경우가 많습니다.형광 단백질을 이용하면 모든 단백질에 형광 표지를 붙일 수 있습니다. 따라서 오늘은 shige wbi가 이 기술을 시연할 예정입니다. 다음 절차는 형광 단백질 TDE os가 표지된 히스톤을 발현하는 형질전환 선충을 사용하여 시연됩니다.본 시연에서는 박테리아를 동결 보호제로 사용하지만, sea elegance를 동결할 때 20% BSA를 사용할 수도 있습니다. 동결 치환 1시간 전에 자동 동결 치환 장치 또는 FS 장치를 액체 질소로 채우십시오. 또한 사전에 동봉된 문서의 지침에 따라 필요한 고정액을 준비하고, 고정액을 1 mL씩 분주하여 cryo vial에 보관한 후 사용 전까지 액체 질소에 넣어두십시오.페인트 브러시를 사용하여 박테리아 층에서 동물들을 떠내어 100 micron 시료 캐리어에 옮겨 담습니다. 공기 방울이 생기지 않도록 컵에 시료를 약간 넘치게 채웁니다. 준비가 완료되면 시료 컵을 고압 냉동기의 암처(armature)에 놓아 동결시킵니다. 그 후 즉시 시료를 냉동 챔버 옆의 액체 질소 조(bath)로 옮깁니다.다음으로, 핀셋과 포셉을 사용하여 시료를 고정액이 들어 있는 cryo vial로 옮깁니다. 시료가 항상 액체 질소에 잠겨 있도록 주의하십시오. 각 시료에 대해 이 과정을 반복한 후, 모든 cryo vial을 FS unit으로 옮깁니다.모든 cryo vial을 FS 장치에 넣은 후 프로그램을 시작합니다. 냉동 및 처리 프로토콜은 이 도식에 나와 있습니다. 초기 -90 °C 배양 동안 유리질 얼음이 아세톤 내의 고정액으로 교체됩니다.그 후 시료의 온도가 상승함에 따라 액체 아세톤 내의 고정제가 시료를 가교 결합하여 구조를 보존합니다. FS 장치의 온도가 -60 °C에 도달하면 95% 아세톤 20 mL가 담긴 신틸레이션 바이알을 FS에 넣어 냉각시킵니다. 이어서 온도가 -50 °C에 도달하면 P 200 팁이 장착된 파스퇴르 피펫을 사용하여 고정제를 제거하고, 각 시료에 미리 냉각시킨 95% 아세톤 약 1 mL를 첨가합니다. 담즙.이 과정을 2시간 동안 20분마다 반복하십시오. 또한, -50 °C 배양 중에 95% acetone에 희석된 0.1% uranyl acetate 20 mL가 담긴 신틸레이션 바이알을 FS 챔버에 넣어 -50 °C로 예냉하십시오. 그 후 마지막 acetone 세척이 끝나면, 각 바이알에 uranyl acetate 용액 약 1 mL를 첨가하여 샘플을 염색함으로써 막의 대비를 높이십시오.프로그램이 일시 중지된 경우, 이를 다시 시작하십시오. 온도가 -40 °C에 도달하면 95% ethanol이 들어 있는 신틸레이션 바이알을 FS 챔버에 넣으십시오. 온도가 -30 °C에 도달하면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 2시간 동안 20분마다 urinal acetate를 95% ethanol로 교체하십시오.아세톤이 있으면 수지가 중합되지 않으므로 이 단계에서는 에탄올을 사용하는 것이 중요합니다. 프로토콜의 다음 부분에서는 시편이 -30 °C 상태일 때 플라스틱에 매립합니다. FS에서 95% 에탄올을 미리 냉각시킨 30% glycol methacrylate 수지 또는 95% 에탄올 내의 GMA로 교체하십시오. 3~5시간 후에 30% GMA를 70% GMA로 교체하고, 4~6시간 후에 70% GMA를 제거한 뒤 시편을 97% GMA에서 하룻밤 동안 배양하십시오.GMA 농도를 단계적으로 높이면 배지가 조직 내부로 침투할 수 있습니다. GMA 레진에 3%의 물이 첨가되므로, 97% GMA는 희석되지 않는다는 점에 유의하십시오. 다음 날 에탄올 처리를 마친 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플을 A FS 내의 임베딩 몰드로 옮깁니다. 샘플을 임베딩 몰드에 넣은 다음, -30 °C에서 6시간 동안 신선하게 제조된 GMA로 97% GMA를 세 번 교체합니다.세 번째 교환 후, 박테리아 매트릭스를 두드려 표본을 동결보호제로부터 분리하십시오. 환기 바이알에 담긴 97% GMA에 개시제인 nn dimethyl udine을 첨가합니다. 개시제의 첨가량은 GMA 1 mL당 1.5 µL입니다. GMA 용액을 각 매립 몰드에 즉시 넣고, 동물들이 고르게 배치되도록 몰드 내에 위치시킵니다.온도가 -20 °C까지 상승하도록 프로그램을 재시작하십시오. 수지는 1시간 이내에 빠르게 중합되지만, 완전히 중합되었는지 확인하기 위해 플라스틱을 -20 °C에서 밤새 경화시키십시오.플라스틱이 경화되면, 시편을 질소 가스가 충전된 진공 백에 넣어 -20 °C에서 보관하십시오. GMA에 매립된 시편의 박절은 광활성화 국소화 현미경 또는 PALM 이미징을 위해 제공된 관련 문서에 기술된 대로 수행해야 합니다. 현미경 시스템의 EMCCD 카메라는 -70 °C 또는 그 이하로 설정되어야 합니다.피펫을 사용하여 100 nm 금 입자가 1×10¹⁰ particles/mL 농도로 포함된 용액 약 50 µL를 이미징할 샘플에 도포합니다. 샘플 위에 검은색 커버 케이스를 덮고, 용액이 커버 슬립 위에서 30초 동안 머물도록 둡니다. 금 용액을 제거하려면 용액을 커버 슬립 가장자리로 밀어낸 후 킴와이프(kim wipe)로 흡수시킵니다.그 다음 진공 그리스를 원형 커버슬립 홀더에 바르고 커버슬립을 삽입합니다. 커버슬립 아랫면에 침유를 도포합니다. 이를 시료 바로 아래로 밀어 넣습니다.샘플 홀더를 현미경 스테이지의 슬롯에 삽입하고, 섹션들이 대물렌즈 위에 정확히 중앙에 위치하며 단단히 고정되도록 조정합니다. 이때 대물렌즈에 닿지 않도록 각별히 주의하십시오. 다음으로, 명시야 조명을 사용하여 10x 대물렌즈로 섹션의 위치를 찾습니다.그런 다음 100 x 대물렌즈로 교체하고 표본의 초점을 맞춥니다. 필요한 경우, 강도를 10%로 설정한 488 nanometer 레이저를 사용하여 형광 조명으로 전환하십시오. 시료의 온도가 평형을 이룰 때까지 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 형광이 가장 밝은 영역을 찾아 초점을 맞춥니다.레이저를 561 nanometers로 전환하고 강도를 100%로 높입니다. 배경 자가형광을 제거하기 위해 샘플을 약 2분 동안 블리칭(bleach)합니다. 블리칭 중에 초점이 변경되면, 초점을 조정하고 이미지를 캡처하기 전 5분 정도 기다립니다. 블리칭이 완료되면 405 nanometer 레이저를 활성화하고 강도를 최저로 설정합니다.초당 20프레임의 속도로 이미지 수집을 시작합니다. 본 실험의 목적을 달성하기에 충분한 프레임을 수집하십시오. 핵 내 584개 히스톤 단백질의 국소화를 결정하기 위해 5,000에서 6,000프레임을 촬영합니다.5,000 프레임이 수집되면, 이미징 소프트웨어가 모든 분자를 식별하고 매핑합니다. 최종 형광 이미지 또는 소위 서프(surf) 이미지는 카메라에서 검출된 모든 형광의 합성물입니다. 이와 대조적으로, 팜(palm) 이미지는 각 형광 점의 OID를 매핑하여 각 단백질이 위치한 지점만을 나타냅니다.SEM 이미징에 앞서, 2.5% urinal acetate 수용액을 사용하여 절편을 4분 동안 염색합니다. 필터링된 milli QE water로 urinal acetate를 충분히 세척합니다. 절편이 건조되면, 커버슬립이 상당히 어두워질 때까지 스퍼터(sputter)를 사용하여 카본 코팅을 수행합니다.커버슬립 표면에 축적되는 전자가 접지될 수 있도록, 커버슬립의 한쪽 끝과 반대편 금속 스터브에 탄소 전도성 테이프를 부착합니다. SEM 챔버에 커버슬립을 장착하고 현미경에서 시료의 위치를 찾습니다. 시료의 저배율 이미지를 촬영한 후, 관심 영역으로 확대하여 고배율 이미지를 얻습니다.모든 섹션의 이미징이 완료될 때까지 새로운 섹션으로 이 과정을 반복합니다. 다음으로, palm 이미지와 EM 이미지를 정렬해야 합니다. 이를 위해 먼저 획득한 SEM 이미지를 Photoshop에서 엽니다.가로 5,000 픽셀, 세로 5,000 픽셀 크기에 해상도 300 pixels per inch인 새 창을 생성합니다. 불러온 배율의 SEM 이미지를 새 창으로 복사합니다. 편집 메뉴에 있는 자유 변형(free transform) 명령을 사용하여 이미지가 창 전체를 채우도록 크기를 조절합니다.그런 다음 고배율 SEM 이미지를 복사하고 필요에 따라 크기를 조정 및 변환하십시오. 이미지 드롭다운 메뉴 바에서 이미지 회전을 선택하고 sum turf 이미지를 수평으로 반전시키십시오. sum turf 이미지를 복사하여 새 레이어에 붙여넣으십시오.편집 메뉴에 있는 자유 변형(free transform) 명령을 사용하여 이미지를 저배율 전자 현미경 사진과 대략 동일한 크기가 되도록 조정하십시오. 그런 다음, 금 입자의 형광 위치가 SEM에서 시각화된 해당 구조와 일치하도록 이미지를 적절히 회전시키십시오. 다음으로, palm 이미지를 새 레이어로 복사하고 동일한 변형을 적용하여 더 높은 배율의 이미지를 추출하십시오.관심 영역을 확대하고 해당 영역에서 팜(palm) 이미지를 복사하십시오. 발표를 위해 이 이미지를 더 높은 해상도의 SEM 이미지에 붙여넣으십시오. 팜 신호는 유지하면서 검은색 배경만 투명해지도록 팜 이미지에 그라데이션 투명도를 적용해야 합니다.변환된 손바닥 이미지를 새 레이어에 복사합니다. 선택 드롭다운 메뉴에서 색상 범위(color range)를 사용하여 배경을 제외한 손바닥 신호만을 선택합니다. 그런 다음 배경 픽셀을 참조로 선택하고 반전(invert) 옵션을 켭니다.원하는 팜 신호를 잘라내어 새 레이어에 붙여넣습니다. 배경 레이어에 투명도를 적용하여 10%로 설정합니다. 이렇게 하면 강도를 손상시키지 않으면서 배경을 투명하게 만들어 팜 신호를 시각화할 수 있습니다. 히스톤 단백질.His 11 태그가 붙은 TD eos는 선충 c elgan에서 안정적으로 발현되었으며, 형질전환 동물은 이 비디오에 설명된 프로토콜을 사용하여 처리 및 이미징되었습니다. PALM 및 전자 현미경 사진은 동일한 절편에서 획득되었습니다. 형광 및 전자 현미경 사진 모두에서 나타나는 금 나노입자는 이후 두 이미지를 정렬하는 데 사용되었습니다.여기서는 현미경 사진의 상단 끝부분 근처 영역을 확대해 보겠습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 핵과 같은 세포 내 세부 구조가 관찰됩니다.핵, 핵공, 그리고 소포체가 관찰될 수 있습니다. 하지만 태그가 붙은 히스톤 분자들은 오직 핵에만 국한되어 위치하며, 핵 외에는 나타나지 않습니다. 예상대로, 상관 팜(palm) 및 전자 현미경 분석을 통해 최고 해상도로 단백질 위치를 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행한 후, 단백질 분포가 포함된 이러한 절편들을 가져와 어레이 토모그래피(array tomography)를 사용하여 쌓음으로써 세포 내 단백질 분포 위치를 보여주는 3차원 구조를 생성할 수 있습니다.그리고 사산화오스뮴(osmium tetroxide)을 사용할 때는 매우 위험한 화학 물질이므로 항상 장갑을 착용해야 함을 기억하십시오.

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

단일 형광체는 피오나를 사용하여 나노 미터 정밀도로 지역화 할 수 있습니다. 여기에 FIONA 기술의 요약보고, 어떻게 FIONA 실험을 수행하는 기술이다.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

학습하세요 나노 FEM 기법을 통해 형광 단백질이 표지된 단백질을 전자현미경 사진에서 정밀하게 위치시키는 방법을. C. elegans를 이용한 이 상관 현미경 기술은 세포 내 단백질 분포 연구에 활용됩니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

더 많은 동영상 탐색