Name: Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: 배우세요 지질 입방상에서 재배된 막 단백질 크리스털의 수확 및 크라이오 냉각 방법을 통한 구조 생물학 연구. 이 기술은 X선 결정학을 위한 고품질 크리스털 준비에 필수적입니다.

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이 작품에 공헌하고 대부분의 구조 캐 프리 막 및 기능 생물학 그룹, 과거와 현재 회원 모두에서 많은 사람이 있습니다. 모든, 특히 Jingquan 단, 요셉 라이언스에, 우리는 따뜻한 감사와 감사를 확장합니다. 이 작품은 과학 재단 (NSF) 아일랜드 (07/IN.1/B1836), 국립 보건원 (GM75915, P50GM073210 및 U54GM094599) 및 FP7 COST와 마리 퀴리 작업 (CM0902와 PIEF-GA-2009 교부금의 일부 지원이 -235612).

1. 실험실 설정 사전 수확 <ol><li> 수확을위한 준비, 액체 질소로 건조 폼 Dewar을 입력 수확이 자리를 대신하는 것입니다 현미경 옆에 놓으십시오. </li><li> 잠기 저장 퍽은 폼 Dewar 내부의 액체 질소에 끝을 열고 그에게 완전히 시원한 수 있습니다. </li><li> 자기 지팡이 (그림 5)에 수확 할 크리스탈 일치하는 크기의 마이크로 마운트를 고정합니다. 그것은 손에 그 사람 bolus에서 여러 결정을 수확 할 필요가있는 상황을 수용하기 위해 마이크로 마운트가 미리로드 예비 자기 지팡이의 번호가하는 것이 중요합니다. 예비 지팡이는 항상 사용할 수 있습니다. </li><li> micropipette, 도움말 및 수확 현미경 옆에 크리스탈의 성장에 사용 된 침전제 솔루션을 배치합니다. 이 mesophase을 커버하고 잘 열 때 건조 방지하기 위해 필요할 수 있습니다. </li><li> 벤치에 노트북과 펜 가까운 및 / 또는 한컴퓨터 엽니 다. 이러한들은 cryo - 냉각, 수확 및 저장에 배치하기 때문에 결정의 품질, 외관, 위치, 저장 퍽 번호, 등을에 관한 관찰을 기록하는 데 사용됩니다. </li><li> 조수는 사람이 분명히 다음 될 프로토콜의 여러 단계가 진행되는 순서, 그리고 전체 과정에서 그들의 역할을 이해해야 수확에 도움을 사용할 수있는 경우. </li></ol> 장소에 자재 및 장비의 모두와 우리의 다음 작업은 다음과 같습니다 : 2. 크리스탈을 포함 접시와 웰스를 식별 <ol><li> harvestable 크리스탈을 찾기위한 가장 간단하고 직접적인 방법은 일반으로하고 짓밟 편광과 현미경을 사용하여 손으로 우물을 검사하는 것입니다. 현미경의 조명 빛의 강도를 조정하는 결정을 찾는데에 도움을 줄 수 있습니다. </li><li> 또한, 플레이트는 보통 자동으로 검사되고 영상이 극성을 넘어D 빛이, 결정을 찾기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 눈으로 평가는 컴퓨터 모니터에 디지털 이미지를 기록했다. </li><li> 분명 크기, 품질 및 노트북에 mesophase 또는 컴퓨터에있는 크리스탈의 위치에 수확과 기록 덧글에 대한 결정과 함께 그 우물을 표시합니다. </li><li> 영상에서 수확에 대한 결정을 포함하는 플레이트를 제거합니다. </li></ol> 3. 입방 mesophase과 잘 열기. 방법 1 결정은 meso 방법에 의해 성장하는 번호판은 유리 샌드위치 플레이트 (그림 2)입니다. mesophase과 그 안에 결정에 액세스하려면, 그것은 우물을 열 필요가 있습니다. 이 문제는 잘 밀봉 한 다음 제거 할 수있는 상부 coverglass을 잘라 유리 절단 도구를 사용하여 수행됩니다. 절단 잘 결정을 통해에서 coverglass를 제거하는 여러 가지 방법이 있습니다. 사용하는 하나의 유형 O에 의해 결정됩니다F mesophase있는 크리스탈이 성장 발견됩니다. 이것은 매우 점성과 끈적 입방 단계 (그림 3A) 또는 이상 유체 변형, 스폰지 단계 (그림 3B)이 될 수 있습니다. 이 동영상 글에서 우리는 우물을 열려면 이러한 호스팅 자료 모두에서 결정을 수확하는 방법을 보여줍니다. <ol><li> 가벼운 현미경의 무대에 유리 샌드위치 결정 플레이트를 배치합니다. </li><li> 스페이서 위에 불과 우물의 경계 외곽에 위치한이 동심 서클과 가볍게 유리 절삭 공구 점수 coverglass을 사용합니다. 새로운 절삭 도구, 채점은 최소한의 적용 압력이 필요합니다. 점수에 필요한 압력도 fractionally 증가하는 하나의 도구를 교체,이 일반적으로 10 우물을 열 후에 발생합니다. </li><li> 내부 coverglass을 출시하기위한 목적으로 두 골을 원 사이의 공간에 유리를 봐라. 이 유리 파편과 먼지를 많이 생성합니다. moistened과 함께 치워종이 타월. </li><li> 좋은 스쳐 핀셋과 거리에서 틸팅을 함께하고 잘 나가지을 그립하여 석방 coverglass를 제거합니다. 이 경우 입방 단계는 붙어 남아 우물의 기초 판에 장소 인치 </li><li> 지금 크리스탈 수확에 사용하기위한 준비가 입방 mesophase의 선명한보기를 얻을 확대합니다. </li></ol> 4. 큐빅 Mesophase로 잘 열기. 방법 2 <ol><li> 잘의 한면과 잘 자체에 걸쳐 연장이 coverglass 똑바로 평행 선 도구 점수를 절단 유리를 사용합니다. 이 쉽게 핀셋의 액세스 및 coverglass 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 이 특정 예제에서, coverglass은 끈적 스페이서 표면에서 coverglass을 자유롭게에 웃긴다. 이 과정에서 coverglass 위치에 연속 근무 침전제는 입방 단계에서 분리합니다. coverglass가 해제 될 때 침전제 중 일부는 함께갑니다. 우리는 노출 B로 남아 있습니다모든 주변 침전제없이 mesophase의 olus. 즉시, 나가 건조 및 결정에 손상을 줄 수 위상 변화를 겪고에서 mesophase을 방지하기 위해 micropipette를 사용하여 bolus의 상단에 1 μl 신선한 침전제를 추가합니다. bolus 지금은 크리스탈 수확에 사용 할 준비가되어 있습니다. 5. 스폰지 단계로 잘 열기. 실패 스폰지 단계 때문에 흐름에 그 능력과 함께 일을 할 덜 관대합니다. 잘 모세관 현상의 경계에 연락 스폰지 단계에서 그 흐름 결과는 mesophase을 끌어되고 결정이 손실됩니다. 이런 일이 있었는지의 예는이 비디오 클립에 표시됩니다. <ol><li> 스펀지 단계에서의 확대와 스폰지 단계에서 결정을 찾습니다 정상과에 X 편광간에 전환 할 수 있습니다. </li><li> 잘 점수를 열고 제 3 항에 설명 된대로 coverglass을 잘라 준비합니다. 이 과정에서 coverglass가 웃긴다. 시도잘 균열의 방향으로 거꾸로의 변화를 엽니 다 들죠 결국은 스페이서과 접촉. 침전제는 스폰지 위상 및 손실 크리스탈의화물의 일부를 간다와 함께. </li></ol> 이 특정 순서에서 현미경에 polarizers는 완전히 교차되지 않고 결정은 잘하고 내용이 표시 유지를 동시에 밝은 객체로 볼 수 있습니다. 6. 스폰지 단계로 잘 열기. 성공적으로 <ol><li> 스펀지 단계를 확대하고 두 정상과에 X 편광의 크리스탈을 파악할 수 있습니다. </li><li> 점수는 섹션 4.1에서와 같이 잘 다루는 coverglass의 한 부분을 잘라 제거합니다. 불완전하게 교차 편광는 크리스탈을 추적하는 데 사용됩니다. </li><li> 그냥 침전제 솔루션을 감동까지 coverglass의 개구를 통해하고 잘 건조로 조직 종이를 소개합니다. 주의 솔루션을 멀리 위크통증은 거의 모두 사라졌다 한 후 조직을 제거 할 때까지. 이 coverglass 아래 철회, 장소는 아직 결정으로, 나머지 침전제와 스폰지 단계가 발생합니다. </li><li> 점수는, 잘라 내기, 섹션 4.1에서와 같이 핀셋 coverglass의 나머지 부분과 제거 할 수 있습니다. 이 경우 스폰지 단계는 분할, 일부는 coverglass에 잘 일부 막대기에 남아 있습니다. 크리스탈은 coverglass에 bolus에 있습니다. 거의 거꾸로의 존재가 있기 때문에, 스폰지 단계에서 건조에 가능성 때문에 위상 전환을 받아야하기 시작합니다. 이것은 bolus의 중심으로 마이그레이션 복굴절의 고리로 볼 수 있습니다. 즉시 전환을 중단 할 bolus에 침전제 추가 할 수 있습니다. bolus 지금은 크리스탈 수확에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 7. 큐빅 단계에서 수확 및 Cryo 냉각 크리스털 <ol><li> 오픈 잘에 입방 상 bolus로 결정을 찾습니다 정상과에 X 편광간에 이동합니다. t에서최대 네 복굴절 결정에 자신의 동영상 순서가있는 것 같은데 편광과 입방 상 bolus로 볼 수 있습니다. </li><li> 사용 cryo 루프 (그림 5) 수확 즉시 Dewar에서 액체 질소로, 결정에 대한 신선한 노출 mesophase에 꼽는 결정을 낚시하고 다음을 내려가하려면 cryo 루프에 포함 된 장착.주세요 이상적으로, 수확 및 스냅 - 냉각 하나의 연속과 빠른 움직임에 발생합니다. 가능성이 조금은 준수 mesophase은 크리스탈과 함께 수확해야합니다. 우리의 경험에서, cryo-protectant는에 meso-재배 결정으로 필요하지 않습니다. </li><li> 그것은 바로 크리스탈이 성공적으로 수확 된 것을 암시가 더 이상 없다는 것을 확인하는 수확에 사용되는 mesophase의 bolus를 검사 수확 후 cryo-루프에서 크리스탈을 찾기 위해 수 없습니다 때문입니다. </li></ol> 8. 스폰지 단계에서 수확 및 Cryo 냉각 크리스털 <ol><li> 오픈 잘에있는 스폰지 위상 bolus로 결정을 찾습니다 정상과에 X 편광간에 이동합니다. 이 비디오 시퀀스에서 여러 복굴절 결정가있는 것 같은데 편광 아래의 bolus로 볼 수 있습니다. </li><li> 사용 cryo - 루프 (그림 5) 수확 즉시 Dewar에서 액체 질소로, 스폰지 단계에서 결정을 낚시하고이를 내려가하기 위해, 또는 cryoloop에 포함 장착.주세요 입방 단계에서 수확과 마찬가지로, 이상적으로, cryo - 냉각 과정은 크리스탈이 실제 수확 이벤트 사이에 elapsing 및 액체 질소로 폭락 가능한 한 짧은 시간에 수확 즉시 발생합니다. 가능성이 조금은 준수 스폰지 단계는 크리스탈과 함께 수확해야합니다. 명시된 바와 같이, cryo-protectant는에 meso-재배 결정으로 필요하지 않습니다. </li></ol> 9. Dewars에 크리스탈을 저장 <ol><li> 액체 NI에 탑재 된 루프를 급락 것으로trogen는 폼 Dewar에 저장 퍽의 보관 슬롯 중 하나에 배치합니다. 모든 조작은 루프를 완료, 자기 지팡이와 퍽의 상단은 액체 질소에 잠겨. </li><li> 노트북 및 / 또는 컴퓨터에서 위치와 세부 사항 수확과 cryo 냉각 크리스탈을 기록합니다. </li><li> 폼 Dewar에 퍽 전체 또는 일이 저장 또는 운송 Dewar에 선반 퍽 홀더에 퍽 전송 완료에 수확 할 때 액체 질소로 가득. 결정은 회절 데이터 수집을위한 싱크로트론 시설에 수송 Dewars에 배송 할 수 있습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 수확 및 cryo 냉각 연습의 목적은, cryo-루프로 호스팅 mesophase에서 크리스탈을 전송할 고리 크리스탈 약품으로하고 Dewar의 액체 질소에 보관에 배치하는 것입니다 여기에 보여 주었다. 수확 및 C 위치를 이상적인 상황은료 냉각은 크리스탈의 회절 품질이 과정에서 보존하는 방식으로 이루어집니다. 가능한 한 작은 mesophase은 크리스탈과 함께 수확해야합니다. 이 크리스탈을 찾아하고 vitrification에 전망 cryo - 냉각 속도를하고, 회절 데이터 수집 동안 mesophase의 배경 분산을 방해 최소화하기 위해, X-선 빔이 훨씬 도전에 중심하는 것입니다. 크리스탈은 볼 수없는 수 cryo 냉각 샘플의 예는 그림 6에 표시됩니다. 크리스탈은 눈으로 볼 수없는 곳은 데이터 수집 27의 빔에 크리스탈을 발견하고 그 중심에하기 위해 회절 rastering에 의존하는 보통 필요합니다. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1.와있는 지질 이중층을 표시하는 생물 멤브레인의 개략도 ARe는 단백질의 다양한 위치하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 완전히로드와 봉인 96 - 웰 유리 샌드위치 결정 판. 각각의 잘 50 NL 입방 단계 1 μl 침전제 솔루션이 포함되어 있습니다. 명확성을 위해, 입방 단계는 수단 레드 물들과 침전제 솔루션은 메틸렌 블루를 포함하고 있습니다. 인용 발명 5에서. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. lipidic mesophase에서 성장 막 단백질의 크리스털.. H.에서 bacteriorhodopsin의 크리스탈과 입방 상 E.에서 비타민 B12 수용체 / 전송, BtuB의 크리스탈을 포함하는 halobium. B. 스폰지 단계, 대장균. 참조 25 일부터. 입방와 스폰지 단계는 appea를 대비 한rances는 패널에게를 비교하여 명확하고 원래의 모양이 매우 점성하고 유지에 입방 단계 B.. 이 흐르지 않습니다. 이 거칠게 모습을 mesophase bolus의 가장자리에서 특히 명백합니다. 계약으로 스폰지 단계는 상당히 적은 점성하고 흐름을하지 않습니다. 따라서, 스폰지 단계는 원래의 모양을 유지하는 데 실패하고 가장자리는 특질 상 부드러운 있습니다. Jeffamine을 포함 Precipitants, PEG 400, 2 - 메틸-2 ,4-pentandiol, propoxylate butanediol 및 헥산 디올 pentaerythritol은 입방에서 스폰지 단계 4,26으로 전환 될 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4는. 순서도는 meso-재배 막 단백질 결정의 생산, 수확 및 cryo - 냉각 (A)에 관련된 단계를 요약 한 것입니다. 점선 빨간색으로 둘러싸인 만 단계선, 그리고 (B)에 자세히 설명은이 목성 문서에 나와 있습니다. A는 인용 발명 3부터 패널. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 빈 cryo-루프는 자기 지팡이에 장소에 개최되는 핀에 장착. 핀 (A) 및 마이크로 마운트의 확장 전망 (B) 수확 및 cryo 냉각이 중요한 도구로 표시됩니다. B의 마이크로 마운트의 끝 부분에 빈 루프는 직경 30 μm이다. 광범위하게 다른 루프 형식을 테스트하지면서, 우리는 MiTeGen는 입방와 스폰지 단계 모두 잘 표시 작업을 루프 것을 알게됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="그림 6" /> cryo-루프와 같은 싱크로트론 빔라인에서 인라인 현미경으로 보았습니다. A, B의 막 단백질의 그림 6. 수확 및 cryo 냉각 결정. 수확 결정의 예 (caa3 시토크롬 산화 효소 34 (A), diacylglycerol의 키나아제, DgkA (B)) 크리스탈 (파란색 화살표)는 수확 크리스탈은 cryo 루프에 cryo 냉각 mesophase에 표시되지 곳의 cryo 루프. C. 예에 cryo 냉각 mesophase를 통해 볼 수있는 곳. 루프의 끝은 빨간색 화살표로 식별됩니다. 준수 cryo 냉각 mesophase는 파란색 화살표로 식별됩니다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 동영상 글에서 우리는 lipidic mesophase에서 재배 결정은 수확과 회절 데이터 수집에 사용하기 위해 준비하고 궁극적으로 구조 결정에 대한 cryo - 냉각하는 방법을 보여 주었다. 호스팅 mesophase은 점성과 끈적 입방 단계 또는 더 유연 스폰지 4 단계가 될 수 있습니다. 유리 샌드위치 판을 열 방법과 결정은 매우 수확하는 방법은 mesophase 유형에 따라 달라집니다. 그것은 미리 처리되어 두 사람의인지 알아 것이 중요합니다. 호스팅 지질 및 사용 침전제의 신원은이 문제와 관련하여 중요한 있으며, 결정의 mesophase bolus의 신체적 인 외모가 잘 (그림 3)을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 두 mesophase 형식에서 수확는이 문서에서 설명되었다. 유리 샌드위치 플레이트의 lipidic mesophase의 작은 결정을 수확하는 것은 시간, 기술, exper을 요구하는 정성 과정ience, 인내와 침착. 모든 물자와 장비를 사전에 손에 있습니다 있도록 그것은 수확 시간의 적절한 금액을 따로 설정하고 실험을 설정하는 것이 중요합니다. 수확을 지원하는 두 번째 사람이 중요하지 않지만 권장합니다. 그 사람은 수확을하는 개인에게 사전 마크 접시를 공급뿐만 아니라 저장 퍽에 수확 결정으로 cryo 냉각 장착 루프를 배치에 도움을 줄 수 있습니다. 조수는 회절 데이터 수집 동안 중요한할만한 수확하는 동안 한 결정에 관찰을 문서화하는 데 중요한 지원 역할을 재생할 수 있습니다. 비서의 부재에서 음성 반응 오디오 녹음 장치가 문서에 유리하게 사용될 수있다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜을 따라하면 뷰어의 설치 및 크리스탈 수확을 실행하는 데 도움이됩니다. 그러나 프로세스가 간단하지 않으며 것을 감사하는 것이 중요하다 레슨ctice는 귀중한 막 단백질 결정 수확을 실행하기 전에 필요합니다. 그것은 특히 유용한하지 않은 단백질의 결정과 테스트 판을 처음으로 실험을 할 수하는 것이 좋습니다. 이 유리를 절단의 귀중한 경험과 초보 사제을 제공 할 것, 유리 파편을 제거 mesophase 이상에서 coverglass를 리프팅, 결정을 확인하고 수확하는 동안 그들을 추적하는 현미경에 편광 기능을 사용하여, 마지막 mesophases의 다른 유형을 취급 그들과 수확. , 및 확장 결정을 수확 할 수있는 용이성에 의해, mesophase의 질감이 결정하는 동안 시간이 변경됩니다. 그것은 가치가 덜하고 결정을하지만 더 가치들과 같은 조건에서 재배 한 그 사람들과 수확 연습을하는 것이 중요합니다. 이 meso 또는 lipidic 입방 단계 방법 28에 의해 라이소자임과 thaumatin의 결정 성장을 할 수 있으며, 이것들은 consid해야자료와 방법으로 친숙를 취득 의해 ered. 하나는 또한 vagaries의 내용은 첫째 단백질 무료 mesophase 작업을 고려해야합니다. 여기를 입증 절차는 모두 편안한 20 ° C에서 또는 그 당시 수행되었다. 그것은 낮은 온도에서 meso 방법에 의해 결정 성장을 할 수 있습니다. 따라서, metastable 단계 상태에서 호스팅 지질 등의 monoolein은 4 ° C 1,2,29,30에서 사용할 수 있습니다. 대안은 저온 결정화 31 이성적으로 설계된 7.9 MAG을 사용하는 것입니다. 우리는 특정 막 단백질 타겟 정기적으로 저온 crysallogenesis 해. 이 경우, 크리스탈 성장과 수확은 대형 4 ° C 냉장고에서 이루어집니다. 이러한 조건 하에서 일하는 것은 따뜻하고 편안한 복장이 필요하지 않습니다 적어도 고유의 문제가 있습니다. macromolecular의 crys를 사용하여 구조 결정의 전체 프로세스의 다음 단계tallography이 결정 수확이 문서에서 보여준 것처럼 스냅인 냉각에 회절 데이터를 수집하는 것입니다. meso 자체에서 결정은 일반적으로 작은 수 있습니다. 그러나, 유용한 회절 데이터 수집은 20 μm 9 최대 크기를 갖는 결정 가능했습니다. 이를 위해, 마이크로 빔 싱크로트론 X-방사선를 사용하고이 시리즈 32,33에서 별도의 주피터 기사의 초점입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 구성 요소들 </td></tr><tr><td> 구부러진 핀셋 </td><td> 시그마 </td><td> F4142 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 일회용 피펫 팁 </td><td> Gilson </td><td> 여러 </td><td> 처분 할 수있는 </td></tr><tr><td> 폼 dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 유리와 금속 폐기물 용기 </td><td> 다니엘스 건강 </td><td> DD479OL </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 수확 루프 </td><td> MiTeGen </td><td> 여러 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 현미경을 수확 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ1500 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 랩 노트 </td><td> 여러 </td><td> NA </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 자기 추진버튼 샘플 로딩 지팡이 </td><td> 햄튼 연구 / 분자 크기 </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 원본 퍽 (단 ALS 스타일의 로봇과 함께 사용하기 위해) </td><td> 크리스탈 위치 확인 시스템 </td><td> CP-111-035 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> Pipetting 장치 </td><td> Gilson </td><td> 여러 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 침전제 솔루션 </td><td> 여러 </td><td> 여러 </td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 퍽 벤트 Cryo-통 </td><td> 크리스탈 위치 확인 시스템 </td><td> CP-111-030 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 갈고리 핸들 및 잠금 막대와 퍽 선반 운송 지팡이 (원본 ALS-스타일) </td><td> 크리스탈 위치 확인 시스템 </td><td> CP-111-029 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 물을 정화 </td><td> Millipore </td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 안전 고글 </td><tD&gt; 다양한 </td><td> NA </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 샘플 핀베이스 - 자기 (비 구리) </td><td> 크리스탈 위치 확인 시스템 </td><td> CP-111-015 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 배송 dewar </td><td> 테일러 - 워튼 </td><td> CX100 </td><td> 수단 </td></tr><tr><td> 조직 </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 처분 할 수있는 </td></tr><tr><td> 텅스텐 탄화물 유리 커터 (TCT 선침) </td><td> Silverline 도구 (Yeovil, 영국) </td><td> 633657 </td><td> 수단 </td></tr></tbody></table>

macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 lipidic mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 cryo 냉각 크리스털

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

단백질은 기계론의 수준에서 작동하는 방법 이해에 중요한 경로는 이상적으로 원자 해상도에서 사용할 수있는 대상 단백질의 구조를 가지고하는 것입니다. 현재이 통합 막 단백질 (그림 1), 그리고 그들이 형성 단지에 적용과 같은 정보를 캡처하는 방법은 하나이며, 그 방법은 macromolecular X-선 결정학 (MX)입니다. MX 회절 품질 결정은 막 단백질의 경우, 어떤이 필요한하려면 쉽게 형성하지 않습니다. lipidic mesophases, 특히 입방와 스폰지 단계 1-5,의 사용을 포함 막 단백질을 crystallizing하기위한 방법은 (는 G 단백질 결합 수용체 필드 6-21에있었습니다 성공에 늦게 인해 상당한 관심을 받고있다 <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">WWW . mpdb.tcd.ie</a> ). 그러나, 방법, 금후 meso 또는 lipidic 입방 단계 방법에라고, 자신의 기술을 갖추고 있습니다도전. 이러한 인해 종종 마이크로 결정하는 결정이 성장하는 lipidic mesophase의 일반적으로 점성과 끈적 자연, 부분적으로 발생합니다. 결정을 조작하는 것은 22,23 수확하는 동안 결과로 어렵고 특히 이렇게된다. 문제는 cryo - 냉각 및 최종 X, 수확을 위해 결정 안에 결정합니다 (그림 2) 24,25 성장하는 유리 샌드위치 플레이트가 mesophase의 bolus를 노출 개설하는 요구되는 수확 앞에 단계에서 너무 발생하고, 선 회절 데이터 수집. 결정을 수확해야되는 입방와 스폰지 mesophase 변종 (그림 3)은 아주 다른 rheologies에게 4,26가 있습니다. 입방 단계는 두꺼운 치약과 유사한 점성과 끈적입니다. 대조적으로, 스폰지 단계 흐름에 뚜렷한 경향으로 더 많은 액체입니다. 개방 결정 우물 containi에 따라서, 서로 다른 접근 방식입방와 스폰지 단계에서 성장 NG 결정은 정말로 다른 방법이 두 mesophase 형식에서 결정을 수확하는 데 필요한대로에라고합니다. 세련되고 구현 된 막 구조 및 기능 생물학 (MS &amp; FB) 그룹에,이 목성 문서 (그림 4)에 자세히 설명되어 있습니다되었습니다 만 이에 대한 프로토콜. 예는 결정이 성공적으로 수확하고 cryo - 냉각되는 상황으로 주어집니다. 우리는 또한 문제가 크리스탈 회복 할 수없는 손해에 해당 리드를 발생 가지 경우 예를 제공하고 이러한 문제를 방지 할 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 Viewer는 수확을 위해, 유리 샌드위치 결정 우물을 열 및 입방와 스폰지 단계의 성장을 막 단백질의 cryo - 냉각 결정에 대한 단계별 지침을 제공합니다.

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용하기 위해 lipidic 입방와 스폰지 단계에서 재배 수확 및 cryo-시원한 막 단백질 결정에 대한 구조 및 기능 생물학 그룹 팀장 막에서 구현 절차를 설명합니다.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

단백질이 기전적 수준에서 어떻게 기능하는지 이해하기 위한 중요한 경로는 표적 단백질의 구조를 확보하는 것이며, 이상적으로는 ... 정도의 해상도에서 확보하는 것입니다.

안녕하세요, 막 구조 및 기능 생물학 그룹(Membrane Structural and Functional Biology Group)에 오신 것을 환영합니다. 저는 Martin Caffery입니다. 이번 영상은 in meso 또는 지질 입방상(lipidic cubic phase) 방법을 이용한 구조 결정을 위한 막 단백질 결정화에 관한 JoVE 시리즈 기사의 다음 편입니다.첫 번째 논문인 Jo of 1 7 1 2에서, 단백질이 함유된 입방상(cubic phase)을 준비하는 방법과 점성이 높고 끈적이는 misa 상을 결정화 실험을 위해 유리 샌드위치 결정화 플레이트에 수동으로 분주하는 방법을 시연하였습니다. 본 비디오 논문에서는 in meso 방식으로 성장시킨 결정을 수확하고 저온 냉각(cryo cooling)하는 방법을 설명합니다. in meso 방식으로 성장시킨 결정을 수확하고 저온 냉각하는 데 필요한 재료와 장비가 여기에 나와 있습니다.준비물로는 향후 참조를 위해 결정 및 수확 세부 정보를 기록할 실험 노트, 안전 고글, 유리 및 금속 폐기물 컨테이너, 결정이 수확될 유리 샌드위치 결정화 플레이트가 포함됩니다. 결정이 들어 있는 웰은 읽기 쉽게 표시하며, 결정화 웰을 여는 데 사용할 유리 절단 도구, 티슈, 물병, 곡선 핀셋, 침전제 스크리닝 용액, 마이크로피펫 및 팁, 결정 수확용 크라이오 루프, 자석봉, 결정이 담긴 냉각 루프 보관용 포크가 필요합니다. 액체 질소가 채워진 크라이오 냉각용 폼 듀어, 결정용 집게, 운반 또는 보관용 듀어 및 수확용 현미경을 준비합니다.수확 준비를 위해, 폼 도어(foam doer)를 액체 질소로 채우고 수확이 진행될 현미경 옆에 미리 배치해야 합니다. 개구부가 위를 향하도록 한 보관 퍽(storage puck)을 도어 내의 액체 질소에 담가 냉각시키고, 수확할 결정의 크기에 맞는 크라이오 루프(cryo loop)를 마그네틱 완드(magnetic wand)의 마이크로 마운트에 고정하여 모든 재료와 장비를 갖추어야 합니다. 다음 단계는 결정이 포함된 플레이트와 웰을 식별하는 것입니다.두 가지 방법 중 하나를 선택하여 수행할 수 있습니다. 가장 간단하고 직접적인 방법은 일반 광원과 편광 광원을 사용하는 현미경으로 웰을 수동으로 검사하는 것입니다. 두 번째 방법은 플레이트를 일반 광원과 편광 광원으로 자동 스크리닝하는 이미저(imager)를 사용하는 것입니다.디지털 이미지는 이미저로 기록되며 컴퓨터 모니터에서 평가됩니다. 수확할 결정이 들어 있는 웰은 명확하게 표시해야 합니다. 이미지 내 결정의 크기, 품질 및 위치에 대한 의견은 실험 노트나 컴퓨터에 기록해야 합니다.이는 수확 단계에서 도움이 됩니다. 여기서, 수확할 결정이 들어 있는 플레이트를 이미지 분석기에서 제거하여 웰을 엽니다. 엔드-메소(end meso) 방법으로 결정이 성장한 플레이트는 여기에 표시된 것과 같은 유리 샌드위치 플레이트입니다. 메조(mease)와 그 안에 있는 결정에 접근하려면 웰을 열어야 합니다.이는 유리 절단 도구를 사용하여 웰을 밀봉하고 있는 상단 커버 글라스를 절단한 후 제거함으로써 수행됩니다. 이를 위한 몇 가지 방법이 있으며, 결정이 성장하고 있는 매질의 종류에 따라 적절한 방법을 선택합니다.이는 매우 점성이 높고 끈적거리는 큐빅 상(cubic phase)이거나, 스폰지 상(sponge phase)이라고 불리는 더 유동적인 변형체일 수 있습니다. 본 비디오 논문에서는 이러한 두 가지 호스트 재료 모두에서 웰을 열고 결정을 수확하는 방법을 보여줍니다. 이 비디오 시퀀스에서는 점성 큐빅 상이 포함된 웰의 커버 글라스를 스코어링하는 두 가지 방법을 시연합니다.광학 현미경으로 관찰하여 스코어링과 커팅 과정을 상세히 보여줍니다. 먼저 단일 결정화 웰을 조사하여 각 부분을 확인하는 것으로 시작합니다. 첫 번째 빨간색 화살표는 결정이 포함된 mease 덩어리를 가리킵니다.참고로, 이 특정 시퀀스에서는 결정이 보이지 않습니다. 두 번째 화살표는 메이즈(mease)를 둘러싸고 있는 침전제 용액을 가리킵니다. 세 번째 화살표는 웰의 가장자리를 가리킵니다.네 번째 화살표는 커버 글라스를 고정할 때 사용하는 더블 스틱 스페이서를 가리킵니다. 유리 절단기를 사용하여 웰의 외곽 바로 바깥쪽에 두 개의 동심원을 가볍게 긋습니다. 그런 다음 유리 절단기를 이용해 두 개의 절단선 사이의 유리를 깨뜨려 제거합니다.내부 커버 글라스를 분리하는 과정에서 많은 유리 파편과 먼지가 발생하며, 이는 젖은 종이 타월로 닦아내어 제거할 수 있습니다. 분리된 커버 글라스는 원형 가장자리를 따라 스페이서 위에 놓이게 됩니다. 끝이 뾰족한 핀셋으로 커버 글라스를 잡고 웰에서 바깥쪽으로 기울여 들어 올려 제거합니다.이 경우, 입방상(cubic phase)은 웰 바닥에 그대로 고정된 상태로 남게 됩니다. 침전제의 일부는 커버 글라스와 함께 제거되지만, 상당량의 침전제는 메이즈 볼루스(mease bolus) 주변에 그대로 남아 있습니다. 확대해서 보면, 이제 결정 수확에 사용할 준비가 된 입방형 메이즈를 더 명확하게 관찰할 수 있습니다.다음 순서에서는 점성이 있는 입방상(cubic phase)이 포함된 결정화 웰을 여는 두 번째 방법을 보여드립니다. 이 경우에는 웰의 한쪽 측면에서 웰 전체를 가로지르는 추가적인 직선형 스코어 및 컵 라인을 커버 글라스에 만듭니다. 이렇게 하면 핀셋으로 커버 글라스에 더 쉽게 접근하여 제거할 수 있습니다.이 특정 시연에서는 커버 글라스가 깨지며, 끈적한 공간이나 표면에서 커버 글라스를 분리하는 과정에서 커버 글라스 자체가 이동하여 침전물이 큐빅 상(cubic phase)에서 분리됩니다. 커버 글라스를 들어 올리면 침전물의 일부가 함께 딸려 올라옵니다. 삽입 그림은 이 과정의 확대 전 모습을 보여줍니다.이제 주변에 침전제가 없는 상태로 mease 덩어리가 노출되어 있는데, 이 상태에서는 mease가 건조되어 상전이가 일어날 수 있으며 이는 결정에 손상을 줄 수 있습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 덩어리 위에 신선한 침전제를 추가합니다. 이제 이 덩어리를 결정 수확에 사용할 수 있습니다.스펀지 상은 유동성으로 인해 다루기가 다소 까다롭습니다. 이러한 유동성으로 인해 스펀지 상이 웰의 주변벽에 닿게 되면 외부로 끌려 나가 결정이 손실될 수 있습니다. 이러한 현상이 발생하는 사례가 다음 비디오 클립에 제시되어 있습니다.먼저 스펀지 상(sponge phase)을 확대하여 관찰한 다음, 일반광과 직교 편광 사이를 번갈아 전환하며 관찰합니다. 일반광에서는 식별하기 어려운 결정들이 직교 편광 하에서는 검은 배경 위의 밝은 굴절광으로 뚜렷하게 보입니다. 웰을 열기 위해, 앞서 설명한 방식대로 커버글라스를 긁어 절단합니다.하지만 그 과정에서 커버 글라스의 엉뚱한 부분이 깨지게 됩니다. 웰(well)을 여는 과정을 계속 진행하기 위해 몇 가지 조작을 수행하지만, 침전제가 균열 방향으로 이동하여 결국 스페이서와 접촉하게 되며, 불행히도 침전제와 함께 스펀지 상(sponge phase)의 일부와 그 안에 포함된 물질들이 함께 유실됩니다. 물론 이 특정 시퀀스의 결정들에서는 현미경의 편광판이 완전히 교차되지 않아, 웰과 그 내부 내용물이 보이는 동시에 결정들이 밝은 물체로 관찰될 수 있습니다.다음 영상에서는 과잉 침전제를 먼저 제거하여 문제를 해결하는 방법을 보여줍니다. 먼저 스펀지 상을 확대하여 일반광과 직교 편광 상태 모두에서 결정을 확인한 후, 커버 글라스의 일부를 깎아내고 잘라내어 웰 위에서 조심스럽게 제거합니다. 결정의 상태를 계속 확인하기 위해 다시 한번 편광을 이용하며, 이때 결정이 선명하게 빛나는 것을 볼 수 있습니다.마른 티슈 한 조각을 커버 글라스의 개구부를 통해 웰 내부로 삽입하여 침전액에 살짝 닿게 합니다. 용액이 거의 다 사라지고 스펀지 상(sponge phase)이 심지 방향으로 이동하기 시작할 때까지 용액을 조심스럽게 흡수시켜 제거합니다. 티슈를 제거하면 남은 침전제와 결정이 그대로 유지된 스펀지 상이 커버 글라스 아래로 다시 수축합니다.명확한 이해를 위해 마지막 시퀀스를 느린 화면으로 다시 보여줍니다. 커버 글라스의 나머지 부분을 홈을 내어 절단합니다. 앞서 설명한 대로, 이제 핀셋을 사용하여 커버 글라스를 들어 올립니다.삽입도는 전체 과정의 확대 전 모습입니다. 이 특정 사례에서는 스펀지 단계에서 일부 잔여물은 웰에 남고 일부는 커버 글라스에 부착됩니다. 직교 편광판을 통해 확인하면 결정이 커버 글라스 위의 볼러스 내에 있음을 알 수 있습니다.스펀지 단계에서 결정이 명확하게 보이지만, 침전제가 매우 적게 존재하기 때문에 건조로 인해 상전이가 일어나기 시작합니다. 이는 볼루스의 중심부로 이동하는 바이오 프린지(bio fringes) 링의 형태로 관찰될 수 있습니다. 볼루스에 침전제를 추가하면 이 과정이 중단 및 역전될 수 있으며, 이를 통해 다음 단계인 결정 회수 작업을 준비할 수 있습니다.웰을 열어 호스트 Misa 상을 노출시킨 후, 다음 단계는 결정을 수확하는 것입니다. 다음 클립에서는 입방체 상(cubic phase)과 스펀지 상(sponge phase)에서 결정을 수확하는 예를 보여줍니다. 갓 열린 웰 내의 mea 상을 현미경으로 관찰하여 적절한 결정을 찾습니다.명시야광과 편광 사이를 번갈아 관찰하면 이 과정에 큰 도움이 될 수 있습니다. 건조 속도를 늦추거나 중단시키기 위해 볼러스에 첨가할 수 있는 침전제 용액을 즉시 사용할 수 있도록 준비해 두어야 합니다. 그런 다음, 마운트된 크라이오 루프를 사용하여 새로 노출된 비스 코스(visa phase)에서 결정을 탐색하여 건져낸 후, 수확 즉시 크라이오 루프째로 액체 질소에 급냉시킵니다.이어지는 내용에서는, 4개의 Biore 프레임에 이르기까지의 수확 과정에서 점성이 있고 끈적거리는 입방상(cubic phase)으로부터 먼저 수확하는 모습을 보여주며, 편광을 통해 입방상 볼루스 내의 결정을 확인할 수 있습니다. 크라이오 루프가 오른쪽에서 들어와 가능한 한 적은 양의 매질이 붙도록 결정을 떠낸 후 즉시 급속 냉각시키며, 루프는 액체 질소 하의 보관 퍽에 배치됩니다. 이 영상에서 수확 과정은 총 세 번 반복됩니다.편광판은 결정의 위치를 확인할 때마다 사용합니다. 하베스팅 후에는 크라이오 루프 내에서 결정을 찾는 것이 불가능하므로, 결정이 더 이상 남아 있지 않은지 확인하여 하베스팅이 성공적으로 이루어졌음을 검증하기 위해 결정이 채취된 메사 상(mesa phase)을 확인하는 것이 좋습니다. 다음 시퀀스에서는 보다 유동적인 스펀지 상(sponge phase)에서의 하베스팅 과정을 보여주며, 큐빅 상과 마찬가지로 스펀지 상은 결정과 함께 아주 적은 양만 채취되어야 합니다.결정을 둘러싼 크라이오 루프(cryo loop)에 물질이 많을수록 육안으로 결정을 찾기가 더 어려워집니다. 이는 회절 데이터 수집 시 더 많은 배경 산란을 일으켜 회절 측정에 영향을 줄 수 있습니다. 다음 순서에서는 즉시 수행해야 하는 크라이오 냉각 과정을 보여드리겠습니다.결정 수확 시점부터 액체 질소에 침전시키기까지의 시간 간격을 최대한 단축하여 수확합니다. 마운팅 루프를 액체 질소에 침전시킨 후, 도어에 있는 보관 퍽의 홀딩 슬롯 중 하나(본 사례에서는 1번 위치)에 배치하고 마그네틱 완드에서 분리합니다. 이 시점에서 수확 및 급속 냉각된 결정의 위치와 세부 사항을 실험 노트 또는 컴퓨터에 기록해야 합니다.폼 서랍의 퍽이 가득 찼거나 당일 수집 작업을 마친 경우, 퍽을 액체 질소가 채워진 보관 또는 운송용 J의 선반형 퍽 홀더로 옮기십시오. 다음 두 이미지는 수집이 완료되어 크라이오 루프에 담긴 저온 냉각 결정의 모습입니다. 위의 프로토콜을 따르면, 루프 내의 meza 상 내부에 결정이 뚜렷하게 보입니다.하지만 이 경우에는 결정이 보이지 않으므로 회절 분석을 통해 위치를 찾아야 합니다. 거대분자 결정학을 이용한 구조 결정의 전체 과정 중 다음 단계는 본 논문에서 시연한 바와 같이 수집된 결정으로부터 회절 데이터를 수집하는 것입니다. 이는 보통 방사광 X선을 사용하여 수행하며, 본 시리즈의 별도 JoVE 논문에서 중점적으로 다룹니다.

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용 lipidic mesophases의 막 단백질의 높은 처리량 결정에 로봇 접근 방식을 설명합니다. 방법 통합 점성과 끈적 끈적한 단백질을이고 mesophase을 처리 할 수​​있는 로봇을 소개합니다.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

이 기사의 목적은 시청자에게 대규모 단일 단백질 결정을 성장시키기 위한 소량의 증기 확산 프로토콜을 직렬 결정학을 위한 대용량 배치 미세 결정화 방법으로 변환하는 방법에 대한 확실한 이해를 제공하는 것입니다.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

배우세요 지질 입방상에서 재배된 막 단백질 크리스털의 수확 및 크라이오 냉각 방법을 통한 구조 생물학 연구. 이 기술은 X선 결정학을 위한 고품질 크리스털 준비에 필수적입니다.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

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