Name: 유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 배우세요 유도만능줄기세포에서 성체 마우스를 생성하는 사배체 배아 보완법을 통한 방법입니다. 이 기술은 줄기세포의 만능성을 검증하고 재생의학 연구에 활용됩니다.

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KKB에 지원, MJB, JLH 및 KLN는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소, 퓨 자선 신탁 바이오 메디컬 학자 프로그램, 에스더 B. O&#39;Keeffe 가족 재단과 샤피로 가족 재단에 의해 제공되었다. KKB는 도널드 E.와 델리아 B. 박스터 재단 학부 학술 수 있습니다.

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
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<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
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<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

TEC의 assays를 사용하여 iPSC 라인에서 생성 마우스는 iPSC 라인의 pluripotency에 대한 엄격한 기능 테스트를 제공합니다. 이 테스트는 다른 재 프로그래밍 방법의 상대적 효능을 평가하거나 체외에서 특정 세포 유형을 생성하기 위해 가장 유용 할 수 있습니다 iPSC 라인을 식별 할 유용 할 수 있습니다. iPSCs에서 생성 된 쥐들이 stringently 장기적인 안정성과 iPSC 파생 조직의 tumorigenicity을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 완전히 만능 iPSC 선 또는 iPSC 쥐를 생성하거나 다른 재 프로그래밍 방법의 상대적 유틸리티를 비교하고자 조사에 도움이 될 것입니다. 완전 만능 iPSCs의 생성 및 식별을 통제 메커니즘은 제대로 이해하고 일부 iPSC 라인이이 방법을 사용하면 TEC 테스트를 통과하지 않습니다 생산 가능성이 있습니다 유지합니다. 많은 요인은 유전 적 배경, lentiviral titer, lentiviral 전의 패턴 등을 포함하여 실험을 사이에 다를 수 있습니다nsertion, 기증자 인구의 세포주기 매개 변수는 TEC 절차의 여러 단계와 iPSCs의 변수 경향에 간 실험실 차이는 유전자 또는 epigenetic aberrations을 품다합니다. 최고의 성공을 보장하기 위해, 우리는 각각의 바이러스가 충분히 감지 유전자 발현 적어도 80 %의 이상적인 100 % 생산 집중되도록 제어 MEFs에 바이러스 dilutions를 테스트하여 iPSC 유도 실험에서 lentiviral 유전자 발현의 적절한 수준을 설정하는데주의를 기울여야 MEFs. 이 MEFs에 독성을 제한하고 우물 인구 과잉없이 식민지를 생산하는 동안 우리는 서로 다른 lentiviruses의 여러 사본 라인을 확인할 수 있습니다. 그것은 여러 다른 프로토콜은 전체 pluripotency에 대해 여러 경로가 1,8-13,15가 존재하고 있다는 것을 암시 여러 방법과 공여 세포 소스를 사용하여 전체 개발 잠재력을 지닌 iPSCs를 생성하기 위해 표시되었음을 주목해야한다. 현재, 그러나,의 확실한 biomarker가 완전히 만능 iPSC식별 및 따라서 TEC 분석은 iPSC 줄은 유기체의 모든 세포 lineages을 생성 할 수 있는지 여부의 금을 표준 시험 남아있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM (고농도 포도당)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ES 세포 배양 적격 FBS</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>태아송아지혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-메르캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>시그마</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 젤라틴</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (마우스 LIF)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>발프로산</td><td>시그마</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca (칼슘 함유 인산완충식염수)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 무료</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>과배란 유도를 위한 임신마 혈청 성선자극호르몬, 동결건조, 2,000 IU</td><td>Harbor-UCLA 연구소</td><td>제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td></td></tr><tr><td>인성 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>시그마</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제가 포함된 FHM 배지</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-1/2 AA 배지</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>배아 이식 및 배아 검사용 증류수</td><td>시그마</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일, 배아 테스트 완료</td><td>시그마</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>시그마</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>시그마</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-만니톨</td><td>시그마</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>소혈청알부민(BSA), 배아 테스트 완료</td><td>시그마</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>비조사 마우스 배아 섬유아세포</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;본 번역 서비스에서는 제공된 소스 텍스트(`jove_content`)가 없으므로 번역을 수행할 수 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.&quot;&gt;&lt;강한&gt;본 프로토콜에 사용된 배지 및 완충액&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.&quot;&gt;HEK293T 성장 배지. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 10 mg/ml streptomycin. transfection 당일에 사용하는 HEK 배지에서는 penicillin과 streptomycin을 제외한다. HEK 배지는 4℃에서 보관할 수 있다. &amp;deg;최대 1개월 동안 C에서 보관하십시오.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;제공해주신 원문 텍스트가 없습니다. 번역할 JoVE 콘텐츠를 입력해 주시면, 요청하신 지침에 따라 연구자, 임상의, 교육자 및 대학생을 위한 전문적인 학술 한국어로 정밀하게 번역해 드리겠습니다.&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;하이퍼파라미터 최적화(HPO)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM 덱스트로스. pH를 7.1 +/- 0.1로 맞춘다. pH 조절이 매우 중요하다! 멸균 여과 후 4°C에서 보관한다. &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.&quot;&gt;마우스 배아 섬유아세포(MEF) 성장 배지(피더 세포용으로도 사용 가능). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 10 mg/ml 스트렙토마이신. 4°C에서 보관하십시오. &amp;deg;최대 1개월 동안 C에서 보관하십시오.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.&quot;&gt;ESC 성장 배지. 85% DMEM, 15% ES 세포 적격 FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM 비필수 아미노산, 0.1 mM &amp;#946;-메르캅토&amp;#8211;에탄올, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml 페니실린 및 10 mg/ml 스트렙토마이신. ESC 배지는 4°C에서 보관할 수 있습니다. &amp;deg;최대 3주 동안 C에서 보관하십시오.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 JoVE 콘텐츠를 입력해 주세요.&quot;&gt;전기융합 배지. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 그리고 배아 테스트 용수(embryo tested water)에 3% BSA를 포함한다. 4°C에서 보관한다. &amp;deg;최대 3개월 동안 C에서 보관하십시오.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

체세포의 세포에서 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 생산은 기초 연구를위한 유용한 도구를 만들 수있는 방법을 제공하며 재생 치료에 대한 환자와 일치하는 세포의 소스를 생성 할 수 있습니다. iPSCs는 여러 프로토콜을 사용하여 생성하고 여러 셀 소스에서 파생 될 수 있습니다. 일단 생성, iPSCs는 pluripotency 마커에 대한 immunostaining, embryoid 기관 및 기형 종, 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 germline 기여 2 나없이 키메라 마우스의 생산과 유전자 표현의 비교에서 세 배아 층의 생성 등의 assays 다양한을 사용하여 테스트 . 중요한 것은,이 테스트를 통과 iPSC 라인은 여전히 다른 차별화 된 세포 유형 2를 생산하기 위해 자신의 능력에 따라 다릅니다. 이것은 어려운 iPSC 파생 프로토콜, 기증자 세포 소스 또는 선택 방법이 다른 응용 프로그램에 가장 유용 할 수립 만들었습니다. 가장 엄격한 시험줄기 세포 라인 유기체의 생존에 필요한 모든 조직을 생성 할 수있는 발달 가능성이 있는지 여부를의 (칭했다 전체 pluripotency) tetraploid 배아 complementation (TEC) 3-5입니다. 기술적으로는, TEC는 blastocyst 무대 6 체외에서 배양 할 수 tetraploid (4N) 한 세포 배아를 생성하는 두 세포 배아의 electrofusion을 포함한다. Diploid (2N) 만능의 줄기 세포 (예 ESCs 또는 iPSCs) 다음 tetraploid blastocyst의 blastocoel 캐비티에 주입하고 (그림 1 참조) 형성에 대한받는 여성으로 전송됩니다. diploid 세포가 주입 줄기 세포 라인에서 완전히 파생 된 태아의 결과로, 배아는 적절한 구성하는 반면 보완 배의 tetraploid 구성 요소 extraembryonic 조직 (태반, 난황 주머니)에 거의 독점적으로 기여하고있다. 최근, 우리는 reproducibly 성인 쥐를 생성하는 iPSC 라인의 유도를보고TEC 하나를 통해. 이 iPSC 줄이 ESCs 3,4,7 비교하고 가장 다른 iPSC 라인 8-12 대해보고보다 높을 5-13%의 효율성을 가능한 새끼로 상승을 제공합니다. 이 보고서는 직접 재활는 TEC 테스트에서 새끼를 생성하는 자신의 발달 가능성과 효율성에 ESCs 일치 완전히 만능 iPSCs를 생성 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 현재 완전히 만능 iPSCs의 정확성과 강력한 라인 13-15 구분을 명확하게하지 않습니다. 또한이 재활 방법이 가장 효율이 줄을 생산됩니다 삭제합니다. 여기 iPSC 라인의 pluripotency을 비교하거나 다른 재 프로그래밍 방법의 동등한을 수립하고자하는 조사에 도움이 될 수 있습니다 완전히 만능 iPSCs와 &quot;모든 iPSC&quot;마우스를 생산하는 한 가지 방법을 설명합니다.

단계 3 "MEF로부터 iPSC 유도"에서는 doxycycline/VPA 첨가 후 4-5일째부터 형태학적 불균일성과 미성숙 iPSC 콜로니 형성이 관찰되기 시작하며, 7-10일 사이에 성숙한 콜로니가 나타납니다(그림 2). 단계 5에서의 단세포 4배체 배아 생성 효율은 매우 높습니다(그림 3). 처리된 2세포 배아의 최대 95%가 성공적으로 융합되어 4배체 단세포 배아를 생성하는 것을 정기적으로 관찰할 수 있습니다. 4배체 배반포에 iPSC를 주입하는 프로토콜(단계 6, 그림 4)은 키메라 생쥐를 생성하기 위해 2배체 배반포에 ESC를 주입하는 프로토콜과 유사하며, 숙련된 미세주입 전문가가 수행할 수 있습니다. 태어나는 살아있는 새끼의 수는 세포주에 따라 다릅니다(표 1).
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="5">MEF 전프로그래밍 효율 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="5">TEC에 의한 iPSC 마우스 생성 효율</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>이름</td>
			<td>설명</td>
			<td>주입된 배반포 수</td>
			<td>생존 신생아 수</td>
			<td>생존 성체 수</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1. 대표 결과.
<img alt="4배체 배반포 보완 다이어그램; 2배체 E13 배아로부터의 iPSC 마우스 제작." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. 실험 설계 개요도. 왼쪽 상단: 4배체 배반포 제작. 알비노 마우스의 수정된 2세포 배아를 전기 융합하여 4배체 1세포 배아를 생성하고, 이를 배반포 단계까지 in vitro 배양함. 왼쪽 하단: 리프로그래밍. 마우스 배아 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 역 테트라사이클린 활성 단백질인 rtTAM2.2를 인코딩하는 렌티바이러스 입자를 도입함. 독시사이클린을 첨가하면 트랜스지니가 발현되어 iPSC로의 리프로그래밍이 시작됨. 오른쪽: iPSC 마우스 제작. 색소 마우스에서 유래한 iPSC를 4배체 배반포의 배반포강에 주입한 후, 가임 상태의 수용 마우스에 외과적으로 이식함. 갓 태어난 iPSC 마우스는 제왕절개술로 분만하여 대리 양육함. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> 여기를 클릭하여 더 큰 그림 보기</a>.
<img alt="세포 리프로그래밍 과정; 현미경 이미지; 10배, 20배 배율에서의 MEF에서 iPSC로의 전환." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 2"> 
그림 2. 리프로그래밍과 관련된 형태학적 변화. 왼쪽에서 오른쪽으로: 리프로그래밍 실험 과정 중 섬유아세포에서 iPSC 콜로니로 진행되는 형태학적 변화의 예시. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기</a>.
<img alt="배아 발달 단계: 2-세포(2n), 할구 융합, 1-세포(4n); 현미경 이미지." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 3"> 
그림 3. 4배체 배아의 생성. 이배체 2-세포 배아에 전기 펄스를 가하여 할구 융합을 유도하고 1-세포 4배체 배아를 생성한다.
<img alt="배반포 내 iPSC 주입, iPSC 신생 생쥐 및 3주령 생쥐 생성; 세포 연구 결과." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 4"> 
그림 4. iPSC 생쥐의 생성. 왼쪽: iPSC를 4배체 배반포의 배반포강 내로 주입한다. 가운데: 신생 iPSC 생쥐는 색소가 있는 눈으로 구분된다. 오른쪽: 출생 후 3주가 된 iPSC 생쥐.

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을 설명<sup&gt; 1</sup&gt;.

체세포로부터 유도만능줄기세포(iPSCs)를 제작하는 것은 기초 연구를 위한 유용한 도구를 창출하는 수단을 제공하며, 또한...

이 절차의 전반적인 목표는 4배체 배아 보완법(tetraploid embryo complementation)을 통해 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)로부터 성체 생쥐를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 OCT four, SOX two, KLA four 및 c-myc을 운반하는 렌티바이러스를 사용하여 마우스 배아 섬유아세포로부터 iPSCs를 유도하고, 배지에 발프로산(valproic acid, VPA)을 첨가함으로써 달성됩니다.iPSC가 생성되면 면역 염색, 염색체 수 측정 및 배아체 형성을 통해 특성을 분석합니다. 다음 단계는 융합 및 체외 배양을 통해 수용체 4배체 배반포를 생성하는 것입니다. 이어서 iPSC를 4배체 배반포에 주입하고, 보충된 배반포를 수용자 암컷에 이식하여 임신시킵니다.마지막 단계에서, 만삭의 동물을 제왕절개술을 통해 분만하여 대리모에게 옮깁니다. 이를 통해 출생 후 발달 과정을 모니터링할 수 있습니다. 궁극적으로 생존 가능한 만삭 동물이 생성되는지 확인합니다.해당 분석의 IPSC 라인은 완전한 다능성을 가진 것으로 간주됩니다. iPSC를 생성하는 다른 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은, 본 방법이 재현성 있게 완전한 다능성 IPS 세포주를 생성한다는 점입니다. 이러한 방법으로 생성된 IPS 세포주는 자신의 IPS 세포의 다능성을 비교하거나 다른 리프로그래밍 방법의 동등성을 입증하고자 하는 다른 연구자들에게 유용할 수 있습니다. 또한, 이 방법들은 인비트로(in vitro) 분화 분석과 같은 특정 하위 응용 분야를 위해 완전한 다능성 IPS 세포주를 생성하려는 연구자들에게 유용할 것입니다.더 나아가 모든 iPSC 마우스의 생성을 진행합니다. 텔로미어 보충법(telo complementation)을 사용하는 것은 다양한 세포주들의 유전적 및 후성유전적 안정성을 결정하는 유용한 수단이 될 수 있습니다. 사배체 배아 보충법(tetraploid embryo complementation)에 포함된 미세 조작은 기술적으로 매우 까다롭습니다.iPSC가 개발된 이 기술에 능숙해지기까지는 수개월이 걸릴 수 있습니다. 이 기술은 전통적인 ESC 유전자 타겟팅 실험에 사용되는 것과 유사한 배양 조건이 필요합니다. 렌티바이러스로 HEC 2 9 3 T 세포를 형질전환한 24시간 후에, 성장 배지를 제거하고 25 milliliters의 신선한 예열된 배지로 교체하십시오.형질전환된 HEC 2 9 3 T 세포를 배양기로 되돌려 24시간 동안 배양한다. 렌티바이러스로 HEC 2 9 3 T 세포를 형질전환한 지 48시간 후에, 형질전환된 세포로부터 렌티바이러스 입자가 포함된 성장 배지를 수집한다. 4°C에서 3000 Gs로 5분 동안 원심분리하여 바이러스 함유 배지에서 입자성 부스러기를 제거한다. 그다음, 4°C에서 112, 000 Gs로 2시간 동안 20% sucrose cushion을 통해 초원심분리하여 바이러스를 농축한다.바이러스 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 오염 제거용 폐기물 용기에 조심스럽게 따라냅니다. 바이러스 펠릿을 0.4 milliliters의 마우스 배아 섬유아세포 배지에 재현탁시킨 후 튜브를 밀봉합니다. 그다음 4 °C에서 15~30분 동안 부드럽게 흔들어 섞어줍니다.바이러스 입자를 -80 °C에서 보관하고 1회분씩 분주하여 사용하십시오. iPSC 라인은 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 세포로부터 유도됩니다. iPSC 콜로니가 밝은 굴절성과 뚜렷한 경계를 가지며 30~50개의 세포를 포함하게 되면, 이를 수동으로 피킹하여 독립적인 iPSC 라인으로 확장할 준비가 된 것입니다.겔 로딩 파이펫 팁을 사용하여 단일 콜로니를 선택하고, 각 콜로니를 20 µL의 0.25% trypsin EDTA가 들어 있는 U-bottom 96-well 플레이트의 개별 웰로 직접 옮깁니다. 선택한 콜로니와 trypsin을 37 °C에서 약 8분 동안, 또는 콜로니가 단일 세포로 해리될 때까지 배양합니다. 광학 현미경을 통해 해리 진행 정도를 모니터링합니다. 필요 시 가볍게 탭핑(tapping)해 줄 수 있습니다.분리된 세포 현탁액을 피더 층(feeder layer)과 doxycycline 및 VPA가 첨가된 ESC 배지 150 microliters가 포함된 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에서 iPSC 콜로니가 다시 나타나면, 표준 ESC 유도 및 세포 배양 절차를 사용하여 분석 및 세포 뱅킹을 위해 더 큰 웰로 분할하여 4배체 배반포 보조(tetraploid blast assist) 생성을 위한 절차를 시작합니다. 암컷 생쥐로부터 수집한 1세포 배아를 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건의 KSOM에서 하룻밤 동안 배양하여 2세포 배아로 성장시킵니다. 다음 날, 10 centimeter 페트리 접시에 BTX 마이크로 슬라이드를 놓습니다.슬라이드가 용액에 잠길 만큼 충분한 양의 상온 전기 융합 배지를 붓되, 전극의 극이 완전히 잠기지 않도록 주의하십시오. BTX electro cell manipulator ECM 2001과 BTX enhancer 400의 전원을 켭니다. ECM 케이블을 마이크로 슬라이드 전극에 연결하고, 슬라이드가 의도치 않게 움직이는 것을 방지하기 위해 케이블을 페트리 접시 측면에 고정하십시오.BTX enhancer의 수치를 확인하기 위해 수동 펄스를 1회 가동하고, 인가되는 DC 전류의 전압을 기록하십시오. AC 전류는 전극 사이에서 배아가 정렬되는 속도를 제어합니다. DC 전류는 blastomeres를 융합시키며, 펄스 시간은 DC 펄스의 길이를 설정합니다.적절한 시작 조건은 AC 3 V, DC 100 V, 그리고 0.05 ms입니다. 최적의 DC 전압은 90에서 150 V 범위에서 다양합니다. 마우스 피펫을 사용하십시오.KSOM 배양액에서 30~42개의 세포 배아를 꺼내 전기 융합액 방울로 옮깁니다. 여러 방울의 전기 융합 배지를 통해 세척합니다. 다음으로, 마이크로 슬라이드 디쉬에서 신선한 전기 융합 배지를 마우스 피펫으로 흡입합니다.세척된 배아를 취하여 마이크로 슬라이드 전극 사이의 1 mm 간격 공간에 배치합니다. 배아가 간격 중앙에 정렬되도록 하고, 배아끼리 서로 접촉하지 않도록 주의하십시오. 수동 시작 버튼을 눌러 AC 전류를 가합니다.배아는 블라스토미어 접촉면이 전극과 평행해질 때까지 AC 장 내에서 회전하게 됩니다. 배아가 몇 초 내에 정렬되지 않으면 AC 설정을 높이십시오. 배아가 정렬되면 피펫 내에 전기 융합 배지가 있는 상태에서 수동 시작 버튼을 다시 눌러 DC 펄스를 가합니다.마이크로 슬라이드에서 배아를 수집하여 KSOM 배지 방울을 이용해 여러 번 세척한 후, 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 미네랄 오일 하에서 KSOM 배지로 배양합니다. 할구 융합은 30분 이내에 완료되어야 합니다. 배양 과정에서 할구가 성공적으로 융합된 배아를 모니터링하고 선택합니다.융합된 배아는 1세포기처럼 보일 것입니다. 배양 30분 후 용해된 배아와 2세포기 배아는 폐기하고, 융합된 배아는 37°C, 5% CO₂ 조건에서 미네랄 오일을 덮은 KSOM 마이크로 드롭 내에서 계속 배양하십시오. 배반포 주입을 위한 IPC를 준비하려면, 이전에 보관된 IPC를 해동하여 ESC 배지가 담긴 피더 세포 위에 플레이팅하십시오. 주입에 사용하기 전, 피더 세포 위에서 적어도 한 번 계대 배양하십시오.70~80% 정도로 합류(confluent)된 IPC가 포함된 6-웰 플레이트의 웰 하나만으로도 주입에 충분한 수의 세포를 확보할 수 있습니다. 성장 배지를 흡입하여 제거하고, 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 3 mL로 세포를 세척하십시오. 예열된 0.05% trypsin EDTA 0.5 mL를 세포에 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 배양하며 가끔씩 흔들어 줍니다. ESC 배지 3.0 mL를 첨가하고 반복하여 단일 세포 현탁액을 얻으십시오. 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 단일 세포 현탁액이 되었는지 확인하십시오. 콜로니나 세포 응집체가 있으면 주입 피펫이 막히게 됩니다. 단일 세포 현탁액이 형성되면, 웰에 ESC 배지 1 mL를 추가하고 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 다시 옮기십시오.약 15분 동안 또는 대부분의 피더 세포가 부착되기 시작할 때까지 배양한 후, IPC가 포함된 배지를 조심스럽게 제거합니다. 이때 이미 부착된 피더 세포가 떨어지지 않도록 주의하십시오. IPC를 5 mL의 ESC 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 넣고 200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡입하고 마이크로 파이펫을 사용하여 남은 ESC 배지를 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 펠렛을 떨어뜨린 다음, 미리 냉각된 FHM 배지 0.2~0.5 mL에 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 배아 배양 배아(blast assists)에 주입하기 전과 주입하는 동안 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 배아 배양 배아 주입 프로토콜은 본 논문의 부수 원고와 이전에 출판된 JoVE 논문을 참조하시기 바랍니다. 해당 논문의 발췌본이 현재 화면에 표시되고 있습니다.리프로그래밍 실험 과정 동안 섬유아세포에서 iPSC 콜로니로 변하는 형태학적 진행 과정의 예가 이 이미지들에 나와 있습니다. 패널 B에서 E까지 나타난 바와 같이, doxycycline VPA 첨가 후 4~5일부터 형태학적 이질성과 부분적으로 리프로그래밍된 iPSC 콜로니 형성이 관찰되어야 합니다. 패널 F에서 보는 것처럼 iPSC와 유사한 콜로니는 7~10일 사이에 나타나야 합니다. 이배체 2세포 배아의 전기 융합을 통한 일세포 텔로 배아 생성은 매우 효율적입니다.처리된 2세포 배아의 최대 95%가 성공적으로 융합되어 4배체 1세포 배아가 형성되는 것을 관찰하는 것이 일반적입니다. 본 실험에서 4배체 배반포 보조 세포(blast assist)에 iPSC를 주입하는 데 사용된 프로토콜은, 2배체 키메라 생성을 쉽게 배제하기 위해 2배체 배반포 보조 세포에 E SES를 주입하여 키메라 마우스를 생성하는 프로토콜과 유사하며, iPS 및 4배체 배아 생성에 사용되는 마우스 계통의 색소 침착은 가능할 때 세심하게 선택됩니다. 본 예시에서는 알비노 계통에서 4배체 배아를 생성하고, 색소가 있는 계통에서 iPSC를 생성하였습니다.따라서 신생 IPSC 마우스는 색소성 눈을 가지며 성체가 되었을 때 균일한 색소성 털색을 띠는 반면, 이배체 kyras는 알비노와 색소성 색상이 혼합되어 나타납니다. 태어난 생존 강아지 수는 이 표에 표시된 것과 같이 세포주에 따라 다릅니다. 평균적으로 우수한 IPSC 라인의 경우, 실험자는 주입된 배반포의 1%에서 10% 사이에서 생존 신생 강아지가 태어날 것으로 예상해야 합니다.이 영상을 시청하고 나면, 완전한 다능성 IPS 세포를 유도하는 방법과 이들의 발달 잠재력을 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. MES의 유도부터 신생 IPSC 생쥐의 탄생까지, 4배체 보완 분석법(tetraploid complementation assay) 기술을 숙달하면 약 2~3개월 만에 완료할 수 있습니다. I PSC의 개발 및 유지에는 높은 수준의 세포 배양 기술이 필요합니다.ESL 배양에 대한 이전 경험이 필수적입니다. 렌티바이러스, 특히 농축된 렌티바이러스를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 항상 소속 기관에서 요구하는 개인 보호 장구를 착용해야 하며, 본 절차를 수행한 후 바이러스와 접촉한 모든 물질을 10% bleach로 최소 20분 동안 처리하십시오.모든 IPSC 마우스와 해당 조직은 생리학적, 병리학적 및 행동 표현형에 대해 분석될 수 있습니다.

generation-of-mice-derived-from-induced-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

이 프로토콜은 녹아웃 SR의 cryopreservation 매체 인간의 IPS 세포를 cryopreserving 완벽한 마네 SR 공급기 무료 (KSR - FF) 중간 또는 피더 기반 마네의 SR 매체에서 이러한 세포를 복구하는 자세한 절차를 설명합니다.

Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

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