Name: 유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 학습하세요 마우스 유선염 모델에서 LPS 관내 주입 기법과 NF-κB 리포터를 활용한 생체영상 분석 방법. 이 기술은 염증 반응을 실시간으로 시각화하여 유방 선 조직의 면역학적 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 F Yull와 재향 군인의 담당 부서 (TS 블랙웰)에게 수여 NIH 보조금 CA113734로 운영되었습니다.

모든 동물 실험은 밴더빌트 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 트렌스 제닉 마우스 준비 <ol><li> NGL (N F-κB-G FP-L uciferase) 기자 transgene (이전 1 설명)에 대한 긍정적 인 여성 생쥐는이 절차에 사용됩니다. 여성의 나이가 최소한 육주 때, FVB 야생 형 남성과 그들을 친구. 번식 (1 남자와 새장에서 최대 4 여성) 사용할 수 있습니다 하렘. (참고 :. FVB 변형 마우스는 같은 C57Bl6과 같은 어두운 변형 마우스도 사용할 수 있습니다 본 연구에 사용되었지만,이 마우스는 이전 이미지로 면도해야합니다.) </li><li> 15일 후 결합에서 시작하여, 임신의 징후 (대형 돌출 둘레)에 대해 정기적으로 여성을 선택합니다. 각각의 여성은 임신 한 분리 지난 여성이 임신을 먼저하게되면 수컷은 번식 케이지에서 제거해야합니다. </li><li> 분리 여성보기D 쓰레기가 나타납니다 출생의 날짜를 확인합니다. 최소 6 새끼의 쓰레기는 충분한 젖 분비가 필요합니다. 쓰레기의 출생 후 8 일이 프로토콜 (타임 라인 도식에 대한 그림 1 참조)와 함께 진행합니다. </li></ol> 2. 사출을위한 준비 <ol><li> E.를 해산 0.1 μg / μl의 최종 농도로 PBS에서 대장균의 LPS. 이 솔루션, 또는 5 μg의 총 50 μl은 유선에 주입 될 것입니다. 제어 분사에 사용되는 PBS 혼자의 두 번째 튜브를 준비합니다. </li><li> 박리 범위와 isoflurane 마취 장비를 설정합니다. 코 - 콘 장치는 마우스가 배치 될 해부 범위의 무대에 고정해야합니다. 좋은 광원은 범위 자체에서 또는 추가 스포트라이트에서 여부도 준비해야합니다. </li><li> 설정이 완료되면, isoflurane 기계 및 공기 흐름을 시작합니다. </li></ol> 3. LPS의 Intraductal 주입 <ol><li> LPS 솔루션 50 μl로 짧은 바늘 주사기를로드합니다. 옆을 설정하십시오. </li><li> 첫째 번 호흡이 둔화되어 후 isoflurane 가득 상자에 여성을 배치하고하여 주입 할 마우스를 마취, 무대에 그녀를 이동하고 코 - 콘에서 그녀의 코를 넣습니다. 마우스가 완전히 anesthetized이 확인 발가락 핀치를 사용하십시오. 절차를 통해 마우스의 호흡을 모니터하고 그에 따라 isoflurane 수준을 조정할 수 있습니다. 댐이 절차 후 반환 할 수있을 때까지 여성이에서 촬영되었는지 새끼의 쓰레기를 포함하는 케이지는 신중하게 옆 설정해야합니다. </li><li> 코트는 평면 얘긴 못 나오게하고 마우스의 낮은 복부의 오른쪽 # 4 사타구니 유선에 부착 젖꼭지를 시각화하기 위해 70 % 에탄올의 작은 방울을 사용합니다. </li><li> 유두의 최적의보기에 대한 해부 범위를 집중하십시오. 조심스럽게 멀리 피부에서 젖꼭지를 잡아 들일 고급 집게 세트를 사용하지만 소중히하지 않거나 어떤 방식으로 젖꼭지를 손상.포셉은 단단히 조직을 조작 할 때 함께 고정 없지만, 유두에 스트레스의 최소한의 금액을 요구하는 빛을 보류와 함께 사용해서는 안됩니다. </li><li> 부드럽게 제자리에 젖꼭지를 잡고 왼쪽 손에 포셉을 사용합니다. 천천히 오른손을 사용하여보기의 입력란에 사전로드 된 주사기를 가지고. 주사기는 더 재배치는 내용을 삽입하기 위해 발생이 없습니다 있도록 실시해야합니다. </li><li> 일단 주사기가보기에, 젖꼭지의 중심에서 작은 ductal 개구에 신중하게 목표로하고 주사기를 삽입합니다. </li><li> 손을 변경하지 않고, 주사기의 내용을 삽입하고 유두에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 제어 분사에 대한 PBS의 50 μl로 두 번째 주사기를로드합니다. 무대와 마우스의 낮은 복부의 다른 측면에 왼쪽 # 4 사타구니 유선의 유두를 가장 잘 볼 수있는 방법은 마우스를 변경할 수 있습니다. PBS-로드 주사기를 사용하여 단계 3.4-3.7를 반복합니다. </li><li> 두 주사는 compl이되면, 어서! 마취를 중지하고 복구 케이지에 마우스를 이동합니다. 그녀는 5​​ 분 내에 이동이된다고 보장 할 수있는 여성을 모니터링 할 수 있습니다. 마우스가 1 시간에 복구 케이지에 남아 있도록 허용합니다. 복구 1 시간 후, 새끼 그녀의 쓰레기와 함께 케이지에 여자를 다시 넣습니다. 이미지로 이동하기 전에 마우스는 정기적으로 6 시간의 포스트 분사에 대한 모니터링해야합니다. 우리의 경험에서 더 불리한 결과가 주입 및 이미징 사이의 기간 동안 여성이나 새끼 하나에 언급되지 않았습니다. 고민의 흔적이 (물고 또는 분사 사이트, 일반 혼수를 지키고, 예를 들어 hunched 자세) 또는 새끼 (NO 운동, 피부의 푸른 색) 여성에서 관찰하는 경우 그러나, 실험은 중단되어야한다. </li></ol> 4. 발광 생물 이미징은 NF-κB 활동을 시각화하는 방법 <ol><li> 일단 마우스가 이미지 시설로 이송되었으며, 소프트웨어를 열고 기계를 초기화하여 이미징 절차를 시작합니다. 이 켜십시오마취가 상자 및 이미징 챔버 모두 흐르는 있도록 oflurane 기계 및 공기 흐름. </li><li> 맑은 마취 상자에 isoflurane 마취에서 마우스를 놓습니다. 호흡이 둔화되면 마우스를 완전히 anesthetized이 확인 발가락 핀치를 사용합니다. 그런 다음, 멸균 주사기를 사용하여 복고풍 궤도 분사 (5)에 의해 마우스에 luciferin 기판의 100 μl를 삽입. </li><li> 즉시 이미징 챔버에 마우스를 전송하고이 자리 잡고 코 - 콘 isoflurane에서 그녀의 코를 넣습니다. 마우스가 위로 향한해야합니다. 테이프와 함께 무대에 각각 발을 고정합니다. </li><li> IVIS 소프트웨어에 입력 적절한 설정을 하얀 빛 사진 이미지와 발광 생물 활동의 이미지를 모두 취할 수. 노출 시간은 10 초 있어야합니다. 이미지를 취득. </li><li> 일단 이미지가 획득 한, 마우스가 복구 할 수 있도록하고 그녀의 새끼와 함께 우리에 그녀를 배치하고 주기적으로 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 사진 및 발광이미지는 자동으로 중첩과 그림 2에서와 같이 화면에 표시됩니다. 마우스의 낮은 복부의 각 측면 (PBS 주입 된 선 이상 하나 LPS 주입 된 선에 하나)를 통해 관심 지역 또는 동일한 크기의 &quot;ROI&quot;원을 배치하여 획득 한 이미지를 분석합니다. 광자로 읽기 시작했다. 번호는 (그림 2B 참조) 각 투자 수익 (ROI) 이내에 감지 발광을 나타내는 표시됩니다. 통계 분석에서이 번호를 사용합니다. </li><li> 최적의 이미지를 표시하려면 추가로 표시 신호의 임계 값을 조정합니다. 이 전체 발광을 읽어 아웃 변경되지 않습니다하지만, 제어 및 LPS-처리 선 사이의 차이를 배경 신호를 제거하고 시각화 할 수 있습니다. PBS 주입 된 글 랜드 배경 신호의 무료 될 때까지 표시 발광의 양을 줄이십시오. 이 그림 2에서 볼 수있는 이미지에서 아직 뚜렷한 LPS-처리 선에서 증가 신호 상태를 유지해야합니다. </li><li> Additiona단백질과 RNA의 assays를 포함한 리터 분석은, 6 사후 여성에서 수집 한 유방 조직을 완료 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 이러한 방법의 interpretable 결과를 얻으려면, LPS (또는 PBS) 인접 조직은 그대로두고, 단지 유방 덕트에 주입해야합니다. 젖꼭지를 둘러싼 피하 조직에 주입 오히려 시뮬레이션 감염보다 부상으로 인해 염증이 발생할 수 있습니다. 기술을 배우고 PBS에 희석 trypan 파랑 염료의 주입은. 도움이 될 것입니다 그림 3A는 PBS에 trypan 파랑의 100 μl를 주입 성공적으로 주입 선을 보여줍니다. 도시 된 바와 같이, 만 ductal 나무 주입 솔루션으로 가득해야하고, 사출 사이트에서 더 bolus이 없어야합니다. 이런 상황에서는 A &quot;bolus&quot;는이 유두에서 또는 ductal 나무에 주입하지 않고 젖꼭지를 주변 조직에 주입 액체의 구축이다. 이 쉬입니다그림 3B에서 자신의. 그림 3에 표시된 연습 주사는 젖 분비의 날 21시 여성에 완성 된 되오니, 이용에 참고하여주십시오. 젖 분비의 높이 (일 8-10, LPS는 현재 프로토콜을 사용하여 분사되는 단계) 동안, 우유 풍부한이며 관을 시각화 및 분사가 제대로 완료되었는지 확인하기 어렵습니다. 따라서, 젖 분비에 나중에 점은 연습 주사를위한보다 나은입니다. 의 유방 덕트 결과에 LPS의 성공적인 주입은 선 (腺)에서 NF-κB의 활동을 증가했다. 이 IVIS 이미징시 기자 마우스에 분명해야하고, LPS 주입 된 선이 (평균도 2에 도시 된 바와 같이, PBS 주입 된 선보다 실질적으로 더 높은 루시 페라 제 활동을 (광자 수에 의해 측정)이해야 LPS의 선은 읽 PBS 제어 신호 200 %). 빌려와 LPS-처리 분비 내 발광에 통계적으로 의미있는 증가contralateral 제어 ared은 4 마우스 4 그룹의 완성 불구하고 달성했다. 또 다른 연구는 또한 E. 하나의 intraductal 유방 주사를 활용 한 NF-κB 기자 트렌스 제닉에 대장균 또는 LPS. 우리 자신의 작품과 마찬가지로,이 저자는 E. 후 기자 활동을 6 시간에서 크게 증가했다 대장균 주입 2. 이전의 조작에도 기준에서 이미징 때 뇌 및 기타 복부 장기의 제정 NF-κB 활동으로 인해주의를하시기 바랍니다, 우리의 기자 마우스의 머리와 abdomens 지속적으로 신호를 보여줍니다. 따라서이 신호는이 실험에 관한 무시해야합니다. 명백한 신호는 이미지 읽기 아웃은 PBS의 선에 배경 발광을 최소화하기 위해 조정 한 후 LPS 주입 된 유선 내에 유지됩니다. 그림 2는 배경이 감소하여 이미지를 보여줍니다. 선에 실패한 주입 거예요유두에 손상 가능성이 가장 높은 결과를 가져올 수도 있습니다. 이 영상에 분명합니다 지적, 피부 수준의 염증의 원인이됩니다. 남긴 상처 신호의 이러한 유형의 관에 성공적으로 LPS 주입 후 본 바와 같이, 선 전역에서 나오는 아니라 매우 강하고 피해가 발생한 유두 영역에 국한 될 것입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> 1 그림. 절차의 개략적. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> 그림 2. 배경이 감소하면서 IVIS 발광 생물 이미징.의 대표 결과는 (A) LPS 주입 된 선으로 증가 루시 페라 제 활동을 공개, 이미지 획득. (B)에서 이미지이자 quantifications의 지역이 추가로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt는 = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3 사례 분사 :.. 유선은 intraductal 주입을 통해 색소를 주입 유두를 통해 전달의 정확성을 테스트하려면, 젖 분비의 날 21에서 마우스가 PBS에 희석 trypan 푸른 염료의 100 μl를 주입했다. 희생 후, 선은 시각화를 위해 노출되었다. (A) 성공 분사와 유두에서 염료의 (B) bolus.

<ol><li>Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+and+intensity+of+NF-%CE%BAB+activity+determine+the+severity+of+endotoxin-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury.</a> The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).</li>
<li>Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+NF-%C3%8E%C2%BAB+activity+during+Escherichia+coli-induced+mammary+gland+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of NF-ÎºB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection.</a> Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).</li>
<li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+in+endotoxin-induced+murine+mastitis+is+strictly+dependent+on+mammary+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages.</a> Veterinary Research. 41, 10(2010).</li>
<li>Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nuclear+factor+kappaB+in+mammary+epithelium+promotes+milk+loss+during+mammary+development+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection.</a> J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. (21), e2828(2011).</li>
<li>Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Research. 11, R66(2009).</li>
<li>Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+lipopolysaccharide-induced+mastitis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model.</a> Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).</li>
<li>Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D+%22Intraductal+Injection+into+the+Mouse+Mammary+Gland.+Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research%22">Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).</li>
<li>Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+bovine+soluble+CD14+reduces+severity+of+experimental+Escherichia+coli+mastitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice.</a> Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).</li>
<li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+neutrophils+but+not+mammary+alveolar+macrophages+in+a+murine+model+of+acute+Escherichia+coli+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis.</a> Veterinary Research. 41, 53(2010).</li>
<li>Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+LPS-binding+protein+in+bovine+blood+and+milk+following+bacterial+lipopolysaccharide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge.</a> Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).</li>
<li>Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+needed+to+restrict+the+invasion+of+Escherichia+coli+P4+into+mammary+gland+epithelial+cells+in+a+murine+model+of+acute+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis.</a> Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).</li>
<li>Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+in+Escherichia+coli-induced+mastitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Immunology%2C+Microbiology%2C+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice.</a> Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).</li>
<li>Osterman, K. L., Rahm, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactation+mastitis%3A+bacterial+cultivation+of+breast+milk+symptoms%2C+treatment%2C+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome.</a> Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).</li>
<li>Sordillo, L. M., Streicher, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+Gland+Immunity+and+Mastitis+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).</li>
<li>Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically+altered+mice+to+investigate+the+role+of+nuclear+factor-kappa+B+activation+and+cytokine+gene+expression+in+sepsis-induced+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS.</a> Chest. 116, 73S-74S (1999).</li>
<li>Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+NF-kappaB+activation+promotes+urethane-induced+lung+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).</li>
<li>Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+signaling+in+fetal+lung+macrophages+disrupts+airway+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis.</a> The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).</li>
<li>Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+IKKepsilon+regulates+energy+balance+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice.</a> Cell. 138, 961-975 (2009).</li>
<li>Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+kinase+II+triggers+cell+membrane+injury+by+inducing+complement+factor+B+gene+expression+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

다음은 유전자 변형 NF-κB의 기자 마우스 및 모델 유선염에 최적화 된 사출 기술을 활용, 유방 조직의 염증이 가장 일반적으로 세균 감염에 의해 발생. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 intraductal 주사 자체입니다. 실제로, intraductal 주입이 성공했는지 여부를 보통 명백합니다. 대리인의 주입 (LPS 또는 PBS)는 유체 생각해야하며 주사기가납니다으로 저항 거의가 있어야합니다. 가장 일반적인 함정은 선에 방해 통로로 이어지는 유두에 손상입니다. 이 해부 범위를 통해 유두를보고하여 시각화 할 수 있습니다. 손상 충분한 연습 젖꼭지를 조작 진미, 그리고 (31G 이상) 바늘 만 작은이 절차를 수행하는 데 사용됩니다 수 있도록하여하여 방지 할 수 있습니다. 바늘이 제대로거나 위치하지 않는 경우 또한, 그것은 중반 사출, 빌드를 미끄러 져LPS 또는 PBS의 업은 주입 사이트에서 형성 할 수 있으며 액체가 관을 전면적으로 퍼지다하지 않습니다. 이 경우, 여러분은 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 대장균에서 Lipopolysaccharide (LPS) </td><td> 시그마 </td><td> L 2880 </td><td> 혈청 형 055 : B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech 주식회사 </td><td> 46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 31 게이지 인슐린 주사기 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 328438 </td><td> 짧은 바늘 </td></tr><tr><td> 집게 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 15,908 </td><td></td></tr><tr><td> 범위를 해부 </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> 테럴 Isoflurane, USP </td><td> RX 엘리트에 대한 MINRAD (주) </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 이미징 시스템 &lt;/ TD&gt; <td> 캘리퍼스 (이전 Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> luciferin 주입을위한 주사기 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 309597 </td><td> 1cc, 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-Luciferin 반딧불, 나트륨 염 일 수화물 (Luciferin 기판) </td><td> Biosynth 화학 및 생물학 </td><td> L-8240 </td><td> 10 MG / ML에 희석 </td></tr></tbody></table>

유선염의 마우스 모델로 lps의 intraductal 주입 : 신호는 nf-κb 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

인간의 질병의 동물 모델은 사전 임상 모델은 개입을 테스트로 엄격하게, 궁극적으로 질병의 진행 및 관련 메커니즘의 단계를 공부하고하기 위해 필요합니다. 이러한 방법으로, 우리는 lipopolysaccharide가 (LPS) 선의 유두 효과적으로 모델링 유선염, 또는 염증을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술을 설명합니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에이 시뮬레이션 감염 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스 1 발광 생물 이미징을 통해 시각화. 이러한 방법을 개발에 우리의 궁극적 인 목표는 lactating 자주 빨갛게이 포함되어 선, 붓기, 그리고 면역 세포 침투 2,3에서 유선염과 관련된 염증을 연구하는 것이 었습니다. 따라서 절개 또는 위해 피부, 젖꼭지, 또는 선에 남긴 상처의 유형은 수 LPS을 소개하는 것을 절실히 알고 있었다그 접근 방식이 가능성 염증의 읽기 아웃 먹이고 있기 때문에 우리의 방법으로 이용 될 수 없습니다. 우리는 또한 특별히 만든 손으로 그린​​ 피펫 또는 장소에서 이러한 전문 도구를 개최 마이크로의 사용을 필요로하지 스트레이트 포워드 방법을 원하는. 따라서, 우리는 상업적으로 이용 가능한 인슐린 주사기를 사용하고 그대로 유두의 유방 덕트에 에이전트를 주입하기로 결정. 이 방법은 성공하고 우리는 분사의 과정에서 중첩 추가 효과없이 LPS 주입과 관련된 염증을 공부 할 수있었습니다. 또한이 방법은 또한 시각 및 양적 NF-κB는 LPS 주입 된 선 4에서 신호를 증가 보여 NF-κB 루시 페라 제 리포터 유전자 변형 마우스와 발광 생물 이미징 기술을 활용. 이러한 방법은 궁극적으로 lactating 유선에서 모델 질병에 기술을하고자하는 다양한 분야의 연구자의 관심을 끌 수있는여기에 설명이 물질의 수의 주입에 활용 될 수 있으며, 만 LPS에 한정되지 않습니다.

여기에 설명하는 것은 lipopolysaccharide가 유선염을 시뮬레이션 할 수있는 유두, 일반적으로 세균 감염에 의한 조건을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술입니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에 Lipopolysaccharide 사출 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스의 발광 생물 이미징을 통해 시각화.

유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

질병 진행 단계와 그와 관련된 메커니즘을 엄격하게 연구하고, 궁극적으로 ... 함에 있어 인간 질병의 동물 모델이 필요합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 유선염 또는 유선의 염증을 연구하는 것이며, 더 구체적으로는 염증이 발생한 수유 중인 유선 내의 NF-κB 활성을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 NF-κB 리포터 형질전환 female과 wild type male을 교배함으로써 이루어집니다. 새끼가 태어난 지 8일 후에, 주사 부위의 모든 조직을 손상시키지 않는 도입 주입 기술을 통해 female의 수유 중인 유선에 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 주입하며, 주입 6시간 후에 관찰합니다.유선 내의 루시퍼레이스(luciferase) 활성을 검출하기 위해 마우스의 생체 발광 이미징을 수행합니다. 최종적으로, 관내 주입법을 사용한 후 생체 발광 이미징을 통해 LPS 처리된 유선에서 유의미한 NF KB 활성을 확인할 수 있습니다. 다른 관내 주입 방법과 비교했을 때 본 접근법의 주요 장점은 주입 부위에 어떠한 손상도 입히지 않는다는 점입니다.LPS 주입과 관련된 염증을 연구하려는 경우, 부위나 젖꼭지에 가해지는 모든 손상이 분석 결과에 중첩되어 혼란을 줄 수 있으므로 이 과정은 절대적으로 중요합니다. 이 절차에는 NGL 리포터 트랜스진 양성인 암컷 마우스가 사용됩니다. 첫째, 암컷 마우스의 연령은 최소 6주 이상이어야 합니다.교배 15일 후, M 암컷을 FVB 야생형 수컷과 함께 케이지에 넣고 교배시킵니다. 암컷의 복부가 크게 팽창하는 등 임신 징후가 있는지 정기적으로 확인하기 시작합니다. 임신한 암컷은 별도의 케이지로 분리하고, 마지막 암컷이 임신하면 교배 케이지에서 수컷을 제거합니다.적절한 유즙 분비를 위해서는 최소 6마리 이상의 새끼가 포함된 한 배의 새끼들이 필요합니다. 이러한 새끼들이 태어난 지 8일 후에 프로토콜을 진행하십시오.이 절차에서 가장 까다로운 부분은 초기 주입 그 자체입니다. 손의 떨림이 없어야 하며 충분한 연습이 도움이 되겠지만, 항상 예상치 못한 실수가 발생할 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해 주입 당일에 여러 마리의 마우스를 준비하시기 바랍니다.먼저 E. coli 유래 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 PBS에 희석하여 최종 농도를 0.1 µg/µL로 만듭니다. 이 LPS 용액 50 µL를 유선 조직에 주입합니다. 대조군 주입에 사용할 PBS 단독 용액이 담긴 두 번째 튜브를 준비합니다.해부 현미경의 스테이지 옆에 마취제를 투여하기 위한 노즈콘 장치를 고정합니다. 필요에 따라 추가 스포트라이트를 사용하여 스테이지에 밝은 조명을 준비합니다.해부 준비가 완료되면, isof fluorine 기기와 공기 흐름을 시작하십시오. 다음으로 31 gauge 인슐린 주사기에 50 µL의 LPS 용액을 채운 후, 연습 주사용으로 따로 둡니다. 결과물을 시각화하기 위해 PBS에 희석한 triam blue 염료를 사용하십시오.다음으로, 호흡이 느려지면 주입할 마우스를 마취합니다. 마우스를 스테이지 위에 놓고 노즈 콘을 통해 iso fluorine을 공급합니다. 시술 전 과정 동안 완전히 마취된 상태인지 확인하기 위해 꼬집기 반응(pinch test)을 사용하십시오.마우스의 호흡 패턴을 모니터링하십시오. 호흡을 일정하게 유지하기 위해 이소플루린(isof fluorine)의 양을 지속적으로 조절하십시오. 70% 에탄올 한 방울을 사용하여 동물의 복부 쪽 털을 눕히고 유두의 위치를 확인하십시오.비우세손의 미세 포셉을 사용하여 하복부에 위치한 오른쪽 4번 서혜부 유선(inguinal mammary gland)의 젖꼭지를 찾습니다. 젖꼭지를 피부에서 조심스럽게 끌어냅니다. 이때 포셉을 너무 세게 조이지 않도록 주의하십시오.우세손으로 유두를 가볍게만 잡아야 합니다. 미리 충전된 시린지를 시야 내로 가져와, 내용물을 주입할 때 위치를 다시 조정할 필요가 없도록 고정합니다. 바늘을 유두 중심의 작은 유관 개구부를 향해 조심스럽게 조준하십시오.바늘의 약 4분의 1을 위치를 변경하지 않고 유관에 삽입합니다. 주사기 내용물을 3~5초에 걸쳐 주입합니다. 그 후 유두에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다.두 번째 주사기에 50 µL의 PBS를 채우고 왼쪽의 서혜부 유선 유두(4번)에 PBS 대조군 주입 절차를 반복합니다. 두 번의 주입이 모두 완료되면 마취를 중단하고 마우스를 회복 케이지로 옮깁니다.암컷 생쥐는 5분 이내에 움직이기 시작해야 합니다. 1시간 후, 생쥐를 베딩이 있는 홈 케이지로 옮깁니다. 주입 6시간 후에 생쥐를 영상 촬영해야 합니다.그동안 마우스에게 고통의 징후가 관찰되는지 모니터링하십시오. 징후가 보이면 실험을 중단하고 영상 촬영 시설에서 마우스를 안락사시키십시오. 이소플루레인(isof fluorine)을 사용하여 암컷 마우스를 마취할 준비를 하십시오.마취 가스가 박스와 이미징 챔버 모두에 흐르고 있는지 확인하십시오. 마우스로 투명 마취 박스 내에서 isof fluorine 마취 상태로 둡니다. 호흡이 느려지면, 꼬리 꼬집기(pinch test)를 통해 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.다음으로 안와하 정맥에 26게이지 바늘을 통해 Lucifer 기질 100 µL를 주입합니다. 주입 직후 마우스를 이미징 챔버로 옮기고 Isoflurane을 공급하는 노즈콘을 장착합니다. 마우스를 배측으로 눕힌 상태로 배치하고 검은색 불투명 테이프로 각 발을 스테이지에 고정합니다.IVIS 소프트웨어에 적절한 설정을 입력하여 백색광 사진 이미지와 생물 발광 활성 이미지를 모두 촬영하십시오. 이미지 획득 후 노출 시간은 10초로 설정해야 합니다. 주사 후 설명된 것과 동일한 회복 프로토콜을 따르십시오.사진 이미지와 발광 이미지가 자동으로 겹쳐져 화면에 표시됩니다. 마우스 하복부의 양측에 동일한 크기의 관심 영역(ROI) 원을 배치하여 획득한 이미지를 분석하십시오. 하나는 PBS가 주입된 샘 위에, 다른 하나는 LPS가 주입된 샘 위에 배치합니다.판독 값을 광자(photons)로 설정하십시오. 각 ROI 내에서 검출된 발광을 나타내는 수치가 표시되며, 이 수치를 통계 분석에 사용하여 최적의 이미지를 구현하십시오. 표시되는 신호의 임계값을 추가로 조정하십시오.이는 전체 발광 측정값에는 영향을 주지 않으나, PBS가 주입된 유선에 배경 신호가 없을 때 해당 배경 신호를 제거할 수 있게 해줍니다. LPS 처리된 유선에서 증가한 신호는 이미지에서 뚜렷하게 나타나야 합니다. 주입은 우유 생산량이 적은 수유 21일 차에 수행되었으며, 주입 성공 여부는 tripan blue 염색을 통해 쉽게 시각화할 수 있었습니다. 성공적으로 주입된 유선에서는 관상 구조(ductal tree)만 용액으로 채워졌으나, 주입에 실패한 경우에는 젖꼭지나 주변 조직에 액체가 고이는 현상이 나타났습니다.8일 차에 유관으로 LPS를 성공적으로 주입한 결과, 뇌 및 기타 복부 장기에서의 지속적인 NF KB 활성으로 인해 유선 내 NF KB 활성이 증가했습니다. 모든 조작 전에는 일관된 기저 신호가 관찰되었습니다. 4마리의 마우스 그룹에서 LPS를 주입한 유선은 PBS를 주입한 유선보다 루시퍼라제 활성이 상당히 더 높았습니다.LPS 처리된 유선 내에서 통계적으로 유의미한 발광 증가가 측정되었습니다. 이 방법은 유선 염증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 암 연구와 같은 다른 연구 분야에도 적용될 수 있습니다.암세포나 발암 물질을 유관에 직접 주입할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Radulovic, K. 외 장벽 돌파 후 미생물 유래 산물이 유입되는 모습을 모방하기 위해 쥐에 지폴리당을 주입하는 것. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 복강 내 주사를 통해 전신 염증을 유도하기 위해 쥐에게 지다당류(LPS)를 주입하는 단계별 절차를 시연합니다.

전신 면역 반응 연구를 위한 쥐 내 박테리아 지방다당류 내 주사

마우스 유방 동맥에 수성 시약의 비 침습성 췌관 전달을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 특히 유방 덕트를 대상으로 유 방 땀 샘의 젖꼭지로 지역화 주입을 활용합니다. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제와 작은 분자를 포함한 화합물의 다양한 적응할 수있다.

마우스 유선 화 된 약물 전달을위한 췌관 주입

임상 적으로 전이성 유방암에서 유방 유관 시스템 결과에 아데노 바이러스 크레와 잠재 돌연변이의 활성화. YFP 발기인의 설립은 말초 전이성 종양 세포의 추적을 할 수 있습니다. 이 모델은 잠재 전이, 항 종양 면역, 유방암을 치료하는 새로운 면역 요법을 디자인을 공부하는 데 유용합니다.

유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

이 프로토콜의 목표는 마우스 유방 땀샘으로 Cre 발현 아데노바이러스의 자궁 내 주입에 기초한 새로운 유방암 모델링 접근을 기술하는 것입니다. 이 접근은 세포 모형 및 기관 특정 조작을 시간적으로 통제한 방식으로 oncogenic 사건을 둘 다 허용합니다.

마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

우리는 두개골에 안정될 수 있는 끝에 바늘을 구부린, 따라서 근본적인 자렌치에 손상의 리스크를 제거하는 intracisternal 주입을 기술합니다. 이 접근법은 렙토메닝 세포의 유전적 운명 매핑 및 조작및 뇌척수액 이동 추적에 사용될 수 있습니다.

내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도

생체 내 이미징 및 유방암 예방을 위한 마우스 유방 덕트 트리에 대한 에탄올 계 성 절제용용 시약의 내분사 주입 방법이 설명되어 있다. 젖꼭지 개구부에 직접 주사하면 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 유방 상피 세포를 대상으로 할 수 있습니다.

마우스 모델에서 유방암의 예방 및 지역 치료를 위한 에탄올 기반 담약 솔루션의 내배송 및 X선 시각화

본 프로토콜은 유방 상피 세포에 관심 유전자를 전달하기 위해 젖꼭지를 통한 바이러스 벡터의 관내 주입을 설명합니다.

생체 내 유방 관내 주입을 통한 마우스 유방 상피 세포로의 유전자 전달

학습하세요 마우스 유선염 모델에서 LPS 관내 주입 기법과 NF-κB 리포터를 활용한 생체영상 분석 방법. 이 기술은 염증 반응을 실시간으로 시각화하여 유방 선 조직의 면역학적 메커니즘 연구에 활용됩니다.

유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

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