유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

여기에 설명하는 것은 lipopolysaccharide가 유선염을 시뮬레이션 할 수있는 유두, 일반적으로 세균 감염에 의한 조건을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술입니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에 Lipopolysaccharide 사출 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스의 발광 생물 이미징을 통해 시각화.

이 절차의 전반적인 목표는 유선의 유방염 또는 염증을 연구하고, 보다 구체적으로 염증이 있는 수유선 내에서 NF Kary 활동을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 유전자 변형 암컷 NF Kappa b 기자와 야생형 수컷을 교배하여 수행됩니다. 새끼가 태어난 지 8일 후, 리포다당류는 주입 후 6시간 후에 주사 부위의 모든 상처를 손상시키지 않는 입문 주사 기술을 통해 암컷의 수유선에 도입됩니다.

마우스는 유선(mammary gland) 내에서 루시퍼라아제(lucifera) 활성을 감지하기 위해 생물발광 이미징을 거칩니다. 궁극적으로, 결과는 Intraductal injection 방법을 사용한 후 생물 발광 이미징을 통해 LPS 처리된 땀샘에서 상당한 NF KB 활성을 보여줄 수 있습니다. 다른 관내 주사 방법에 비해 우리 접근 방식의 주요 장점은 주사 부위가 어떤 식으로든 손상되지 않는다는 것입니다.

LPS 주사와 관련된 염증을 연구할 계획이라면 부위나 유두가 손상되면 이러한 분석이 중첩되어 혼란스러워질 수 있으므로 이는 절대적으로 중요합니다. NGL Reporter 전이유전자에 대해 양성인 암컷 마우스가 이 절차에 사용됩니다. 1. 암컷은 생후 6주 이상입니다.

M은 har에 의해 FVB 야생형 수컷과 짝짓기를 하고 짝짓기 후 15일에 번식합니다. 암컷에게 임신의 징후, 즉 크게 튀어나온 둘레가 있는지 정기적으로 확인하기 시작하십시오. 임신한 암컷을 자신의 우리로 분리하고 마지막 암컷이 임신하면 번식 케이지에서 수컷을 제거합니다.

적절한 수유를 위해서는 최소 6마리의 새끼가 필요합니다. 그런 새끼가 태어난 지 8일 후. 프로토콜을 진행합니다.

절차에서 가장 어려운 부분은 입문 주사 자체입니다. 꾸준한 손과 많은 연습이 도움이 되지만 항상 함정이 발생할 수 있습니다. 성공을 보장하기 위해 주사 당일에 여러 마리의 마우스를 준비할 준비를 하십시오.

PBS에서 대장균 유래 지질다당류를 마이크로리터당 0.1마이크로그램의 최종 농도로 희석하는 것으로 시작합니다. 이 LPS 용액 50마이크로리터를 유선에 주입합니다. 대조군 주사에 사용할 PBS의 두 번째 튜브를 단독으로 준비합니다.

해부 범위의 무대 옆. 마취를 전달하기 위해 노즈콘 장치를 고정합니다. 필요에 따라 추가 스포트라이트를 사용하여 무대의 밝은 조명을 준비합니다.

해부 설정이 준비되면 불소 기계 및 공기 흐름을 시작합니다. 다음으로, 31게이지 인슐린 주사기에 50마이크로리터의 LPS 용액을 넣고 연습 주사를 위해 주사기를 따로 보관합니다. PBS에 희석된 트리암 블루 염료를 사용하여 결과를 시각화합니다.

다음으로, 호흡이 느려지면 주사할 마우스를 마취합니다. 무대에 놓고 노즈 콘을 통해 iso 불소를 제공합니다. 시술 전반에 걸쳐 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 꼬집는 것을 사용하십시오.

마우스의 호흡 패턴을 모니터링합니다. 불소를 안정적으로 유지하기 위해 지속적으로 조정하십시오. 70% 에탄올을 소량 떨어뜨려 동물의 복부 털을 평평하게 펴고 젖꼭지를 찾습니다.

우발적이지 않은 손에 미세한 집게를 사용하여 하복부에 있는 오른쪽 4번 서혜부 유선의 젖꼭지를 찾습니다. 젖꼭지를 피부에서 조심스럽게 빼냅니다. 집게는 절대 고정되어서는 안 됩니다.

주로 사용하는 손의 젖꼭지에만 가볍게 잡아야 합니다. 사전 장전된 주사기를 시야로 가져와 내용물을 주입하기 위해 위치를 변경할 필요가 없도록 잡습니다. 젖꼭지 중앙에 있는 작은 연성 구멍에 바늘을 조심스럽게 조준합니다.

위치를 변경하지 않고 바늘의 약 1/4을 덕트에 삽입합니다. 주사기의 내용물을 3-5초에 걸쳐 주입합니다. 그런 다음 젖꼭지에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다.

PBS의 50 마이크로 릴리스가 있는 두 번째 주사기를 로드하고 왼쪽의 절차를 반복합니다. 넷째, PBS 컨트롤을 사용한 서혜부 유선유두. 두 주사가 모두 완료되면 마취를 중단하고 마우스를 회복 케이지로 옮깁니다.

암컷은 5분 이내에 움직여야 합니다. 한 시간 후, 퍼프와 함께 그녀를 집 케이지로 돌려보냅니다. 마우스는 주입 6시간 전에 이미지화되어야 합니다.

그 동안 조난 징후가 관찰되면 마우스를 모니터링하십시오. 실험을 중단하고 이미징 시설에서 마우스를 안락사시킵니다. 불소를 사용하여 여성을 마취 할 준비를합니다.

마취제가 상자와 이미징 챔버 모두로 흐르고 있는지 확인합니다. 투명 마취 상자의 isof fluorine Anesthesia 아래에 마우스를 놓습니다. 호흡이 느려지면 a를 사용하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.

다음으로 후안와(retroorbital)에서 26게이지 바늘을 통해 100마이크로리터의 루시퍼 기질을 주입합니다. 주입 후 즉시 마우스를 이미징 챔버로 옮기고 Isof Lorraine을 전달하는 노즈 콘을 부착합니다. 마우스를 누운 위치에 놓고 각 발을 s에 고정합니다.tage 검은색 불투명 테이프로.

IVIS 소프트웨어에 적절한 설정을 입력하여 백색광 사진 이미지와 생물 발광 활동 이미지를 모두 촬영합니다. 노출 시간은 이미지를 획득한 후 10초가 되어야 합니다. 주입 후 설명된 것과 동일한 복구 프로토콜을 따릅니다.

사진 및 발광 이미지는 자동으로 오버레이되어 화면에 표시됩니다. 관심 영역 또는 동일한 크기의 ROI 원을 마우스의 하복부 양쪽에 배치하여 획득한 이미지를 분석합니다. 하나는 PBS가 주입된 분비샘 위에 있고 다른 하나는 LPS가 주입된 분비샘 위에 있습니다.

판독값을 광자로 설정합니다. 각 ROI 내에서 감지된 발광을 나타내는 숫자가 표시되어야 하며, 통계 분석에서 이 숫자를 사용하여 최적의 이미지를 표시합니다. 표시된 신호의 임계값을 추가로 조정합니다.

이렇게 하면 전체 발광 판독값이 변경되지 않지만 PBS 주입된 글랜드에 배경 신호가 없을 때 배경 신호를 제거할 수 있습니다. LPS 처리된 분비선의 증가된 신호는 이미지 실습에서 명백해야 합니다: 주사는 모유 생산이 적을 때 수유 21일째에 수행되었으며 주입의 성공 여부는 성공적으로 주입된 기억샘에서 트리안 블루 염색으로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 유두나 주변 조직에 액체가 쌓였습니다.

8일째에 유관에 LPS를 성공적으로 주입한 결과, 뇌 및 기타 복부 기관에서 구성적인 NF KB 활성으로 인해 분비선 내 NF KB 활성이 증가했습니다. 조작하기 전에 일관된 기준선 신호가 있었습니다. 루시페라아제 활성은 4개의 마우스 그룹에서 PBS를 주입한 분비선보다 LPS 주입된 분비선에서 실질적으로 높았습니다.

LPS 처리된 땀샘 내에서 발광의 통계적으로 유의한 증가가 측정되었습니다. 이 방법은 유선 염증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 암 연구와 같은 다른 연구 분야에도 적용할 수 있습니다.

암세포나 발암 물질을 유관에 직접 주입할 수 있습니다.