에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑 대장균 합성 유전자 배열을 사용하여

이 절차의 목적은 박테리아 유전자와 경로 사이의 기능적 관계를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 접합 또는 짝짓기될 단일 돌연변이 균주인 ceia coli의 배열을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 단일 돌연변이를 플레이트에 배열 형식으로 접합

다음으로 이중 돌연변이가 선택됩니다. 마지막 단계는 이중 돌연변이 플레이트를 이미지화하고 이중 돌연변이 군체를 양자화하여 균주 적합성을 결정하는 것입니다. 궁극적으로 군집 크기 데이터를 분석하여 유전적 상호 작용 점수를 계산하고 기능적으로 상호 작용하는 유전자, 경로 및 과정을 식별합니다.

무작위 돌연변이 유발과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 많은 개별 이중 돌연변이 균주를 생성할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 많은 유전자 간의 상호 작용은 유전자 크기, 필수성 또는 단일 유전자 돌연변이 적합성에 관계없이 동시에 평가할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 기능 및 경로와 프로세스 간의 기능적 혼선과 관련된 것과 같은 시스템 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 세균 감염 치료로 확장되는데, 그 이유는 가장 기능적으로 중심적인 유전자 및 과정에 대한 지식뿐만 아니라 교란될 때 박테리아 유전자, 경로 및 과정의 조합이 박테리아 적합성을 개선하거나 감소시키는 것이 가장 효과적인 중재 전략을 개발하는 데 도움이 될 것이기 때문에 이 프로토콜을 시작하기 위한 가장 효과적인 중재 전략을 개발하는 데 도움이 되기 때문입니다. 2단계 중첩. PCR 증폭은 서면 절차에 설명된 대로 표적 개방 판독 프레임을 PKD 3 플라스미드의 클로람페니콜 저항 마커로 대체하기 위해 사용됩니다.

예상 제품을 확인하고 PCR은 제조업체의 프로토콜에 따라 얻어진 단편을 정제합니다. PCR 생성물을 30마이크로리터의 멸균 증류수에 용출한 후 마이크로리터 농도당 약 50밀리그램으로 희석합니다. 정제된 생성물은 변형 전에 섭씨 영하 20도에서 보관됩니다.

다음으로, 공여체 구축을 위해 고주파 재조합 또는 HFR Caval 역량 세포를 준비합니다. 먼저 HFR Cavalli 균주의 포화 야간 배양 1ml를 70ml의 새로운 LB 배지에 35마이크로리터의 밀리리터당 50밀리그램을 접종합니다. 250 밀리리터 플라스크에 담긴 암피실린.

약 0.5 내지 0.6의 광학 밀도가 얻어질 때까지 220 RPM으로 부드럽게 흔들어 섭씨 32도에서 배양물을 배양합니다. 그런 다음 배양물을 수조로 옮겨 섭씨 42도에서 15분 동안 Lambda Red Recombination 시스템의 열 유도를 위해 160RPM으로 흔들어 유도를 중지합니다. 배양물을 160 RPM으로 10-20분 동안 냉각된 얼음 슬러리 수조로 옮깁니다.

변형이 끝날 때까지 세포를 차갑게 유지하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 원심분리로 세포를 세척하고 수확한 후, 센나를 디캔팅하고 펠릿을 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 10%글리세롤 Eloqua에 재현탁탁합니다. 50 μl 부피의 세포를 개별 사전 냉각된 1.5 millil micro centri tube에 넣고 즉시 형질전환을 진행합니다.

100 나노그램의 정제된 유전자 결실, 카세트를 적격 세포에 추가합니다. 튜브를 튕기고 서스펜션을 얼음 위에 5분 동안 놓아둡니다. 다음 전 식힌 electroporation vete 전기에 현탁액을, 즉각 운영합니다 세포 혼합물을 옮기십시오.

실온 SOC 배지 1ml를 추가하고 배지의 전기천공된 세포를 15ml 배양 튜브로 옮깁니다. 섭씨 32도에서 220RPM의 궤도 흔들기로 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 4, 400회 G의 세포를 5분 동안 원심분리한다.

실온에서 약 850마이크로리터의 supnate를 제거하고 나머지 액체에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 밀리리터당 17마이크로그램, 클로람페니콜이 포함된 LB 플레이트에 세포를 펴고 밤새 섭씨 32도에서 배양합니다. 다음 날, 돌연변이 확인을 위해 LB 클로람페니콜 플레이트에 두 개의 개별 형질전환체를 줄무늬를 제거하고, LB 캔 마이신 플레이트에 동일한 형질전환체를 줄무늬를 제거하여 균주가 캔 마이신에 내성이 없음을 확인합니다.

다음으로, DNA는 서면 프로토콜에 설명된 대로 세 가지 다른 세트의 knockout confirmation primer로 증폭됩니다. 첫 번째 프라이머 세트는 표적 영역의 상류에 위치한 200개의 염기쌍에 위치한 20개의 뉴클레오티드 측면 전방 프라이머와 클로람페니콜 내성 카세트를 보완하는 역 프라이머로 구성됩니다. 이 증폭은 445 뉴클레오티드 앰플리콘을 생성할 것으로 예상됩니다.

두 번째 세트에는 전방 프라이머, 클로람페니콜 내성 카세트 서열에 무릎을 꿇는 프라이머, 그리고 결실된 유전자의 3개의 프라임 말단의 다운스트림에서 200개의 염기쌍을 ane으로 설계한 역 측면 확인 프라이머가 포함됩니다. 이 증폭 반응은 309 뉴클레오티드 앰플리콘을 생성할 것으로 예상됩니다. 세 번째 PCR에는 업스트림 및 다운스트림 측면 프라이머가 모두 포함되어 있습니다.

이 반응은 선택된 균주가 하나의 유전자 자리가 카세트로 대체되고 다른 유전자 자리가 복제된 골수 이배체가 아닌지 확인하는 데 필요하지만, 그렇지 않으면 야생형 유전자 사본이 여전히 존재합니다. 이 증폭은 1.4KB 제품을 생산할 것으로 예상됩니다. e coli ke io single non-essential gene deletion mutant collection은 24 384에 로봇으로 고정된 복제품입니다.

음, 웰당 80마이크로리터의 액체 LB 매체를 포함하는 마이크로플레이트. 밀리리터당 50마이크로그램의 마이신을 첨가하여 국경 통제 균주를 위한 공간을 만들 수 있는데, 이는 양성 대조군으로 부족하고 플레이트 정규화 및 자동화된 콜로니 양자화에 도움이 되지 않았습니다. 각 플레이트의 가장 바깥쪽 웰에서 접종된 매체를 제거하고 가장 바깥쪽 웰은 비워 두고 새 플레이트로 옮깁니다.

마찬가지로, 각 플레이트 내의 다른 위치에서 두 개의 균주를 제거하고 변형을 새 플레이트로 이동하여 음의 제어 지점을 만듭니다. 다음으로, 국경 통제 우물과 음극 대조군 우물을 포함한 빈 우물을 1밀리리터당 17마이크로그램의 클로람페니콜을 함유한 LV 매체로 채웁니다. 이러한 음성 대조군 반점은 수용체에서 비어 있을 것으로 예상되므로 이중 돌연변이 플레이트가 있을 것으로 예상됩니다.

그들은 플레이트에 번호를 매기고, 이미징하거나 고정할 때 처리 또는 플레이트 취급 오류가 없는지 확인하는 역할을 합니다. 서면 절차에 설명된 대로 보더 포지티브 스트레인을 준비한 후, 어레이 스트레인과 보더 포지티브 스트레인을 섭씨 32도에서 하룻밤 동안 성장시키고 다음날 190RPM 궤도 쉐이킹으로 보더 웰을 약 80마이크로리터의 하룻밤 배양물로 채웁니다. 조립된 플레이트는 다음 섹션에서 설명하는 대로 결합에 사용할 수 있습니다.

대안적으로, 장기 보관을 위해, 수용 플레이트의 각 웰에 15%글리세롤을 보충하고 배지와 글리세롤을 혼합합니다. 그런 다음 플레이트는 섭씨 영하 80도에서 보관됩니다. 클로람페니콜 핀의 밀리리터당 17마이크로그램이 있는 풍부한 LB 액체 배지에서 섭씨 32도에서 하룻밤 동안 클로람페니콜 내성 카세트로 표시된 쿼리 유전자 결실을 지니고 HFR 공여체 균주를 성장시켜 짝짓기 절차를 시작합니다.

TH는 3 84 콜로니 밀도의 수용자 돌연변이 컬렉션을 고체 LB 플레이트에 주문했습니다. 마이신 캔 밀리리터당 50마이크로그램이 보충되었습니다. 병렬로 donor query 돌연변이 균주를 3 84 콜로니 밀도의 돌연변이 균주를 동일한 수의 LB 플레이트에 고정합니다.

클로람페니콜 밀리리터당 17마이크로그램이 보충되었습니다. 균주를 접합하기 위해 섭씨 32도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 3 84 colony 오버나이트 기증자 플레이트의 기증자를 단단한 LB 플레이트에 고정합니다.

그런 다음 단일 3 84 콜로니 하룻밤 수령 플레이트의 균주를 새로 고정한 기증자 위에 고정합니다. 고정된 접합 플레이트를 섭씨 32도에서 16-24시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 384 밀도 접합 플레이트를 클로람페니콜을 포함하는 단일 고체 LB 플레이트에 고정합니다.

그리고 mycin은 모든 conjugation plate가 고정될 때까지 이 과정을 반복할 수 있습니까? 갓 핀한 첫 번째 선택 플레이트를 섭씨 32도에서 16-36시간 동안 배양합니다. 배양 후 각 첫 번째 선택 플레이트를 1536 SPOT 형식의 두 번째 이중 약물 선택 플레이트에 다시 고정하여 각 첫 번째 선택 콜로니가 4개의 콜로니로 표시되도록 합니다.

두 번째 선택 플레이트에서 플레이트를 16-36시간 동안 배양합니다. 32도에서 oss는 돌연변이의 성장 적합성을 정량적으로 측정하고 유전자 쌍 간의 상호 작용을 분석하기 위해 최종 이중 돌연변이 선택 플레이트를 촬영합니다. 동일한 경로에 있는 유전자는 밀접하게 상관된 GI 패턴을 나타내기 때문에 기능적으로 관련된 유전자는 S 점수 프로필의 전반적인 유사성에 따라 클러스터링하여 그룹화할 수 있습니다.

GI 프로파일 유사성은 두 유전자의 돌연변이에 대한 표현형의 일치성을 나타내며 두 유전자가 동일한 경로에서 작용하는지 또는 겹치는 경로에서 작용하는지를 나타내야 합니다. 여기에 표시된 것은 물리적으로 상호 작용하는 단백질을 인코딩하는 유전자 쌍과 무작위로 추출된 유전자 쌍의 GI 프로필 간의 상관 계수 분포입니다. 정자 배설에 필요한 이종삼합체(heterotrimeric complex)를 형성하는 두 수송체에 대한 상관된 유전적 프로필의 산점도(scatterplot)의 예는 효모 에콜린 유전자(yeast ecoline gene exhibiting)와 같이 표시된다.

상관관계가 높은 위장관 프로파일과의 상호작용을 완화하면 물리적으로 연관되어 있거나 공통의 생화학적 경로에서 일관되게 작용하는 경로를 인코딩하는 경향이 있습니다. 여기에는 기능적으로 중복된 ISC 및 SUF 철 황 생합성 경로의 구성 요소가 필수 과정에 공동으로 참여하는 것이 광범위한 악화 상호 작용에 의해 함께 연결된 별개의 클러스터를 형성하는 대표적인 예가 나와 있습니다. 통계적 측정은 특정 경로 조합 간의 상호 작용, GI 네트워크와 물리적 상호 작용 및 게놈 컨텍스트와 같은 기타 기능적 연관 데이터 간의 상호 작용에 대한 상당한 풍부화를 찾는 데 사용할 수 있습니다.

관계는 박테리아의 핵심 생물학적 시스템을 정의하는 고차원 기능 모듈의 조직을 드러낼 수 있습니다. 군집 분석은 GI 네트워크에 적용하여 주석이 달린 유전자의 기능을 예측할 수도 있습니다. 클러스터링 알고리즘이 다양하기 때문입니다.

그러나 클러스터링을 통해 결정된 추정 기능 할당에는 독립적인 실험적 검증이 필요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 필요한 모든 양수 및 음수를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 단백질체학(proteomics), 생화학적 추적 실험 및 화학 유전체학(chemical genomics)과 같은 다른 방법을 수행하여 특정 유전자 기능에 대한 추가 질문과 유전자와 경로 간의 기능적 관계의 특성에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이중 돌연변이 균주를 구성하고, 수용자 배열을 조립하고, 대장균의 유전자와 프로세스 간의 기능적 관계를 조사하기 위한 ESGA 스크리닝을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.