에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑

이 절차의 목적은 박테리아 유전자와 경로 사이의 기능적 관계를 조사하는 것입니다. 이는 먼저 접합 또는 교배될 단일 돌연변이 균주인 ceia coli 어레이를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 플레이트 상에서 어레이 형식으로 단일 돌연변이들을 접합시키는 것입니다.

다음으로, 이중 돌연변이체를 선별합니다. 마지막 단계는 이중 돌연변이 플레이트를 이미지화하고 이중 돌연변이 콜로니를 정량화하여 균주 적합성을 결정하는 것입니다. 최종적으로, 콜로니 크기 데이터를 분석하여 유전적 상호작용 점수를 계산하고 기능적으로 상호작용하는 유전자, 경로 및 프로세스를 식별합니다.

무작위 돌연변이 유발과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수많은 개별 이중 돌연변이 균주를 생성할 수 있다는 점입니다. 또한 유전자의 크기, 필수성 또는 단일 유전자 돌연변이의 적응도와 관계없이 여러 유전자 간의 상호작용을 동시에 평가할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 기능 및 경로와 과정 간의 기능적 크로스토크와 관련된 문제 등 시스템 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 함의는 세균 감염 치료까지 확장됩니다. 대부분의 기능적 중심 유전자와 과정에 대한 지식뿐만 아니라, 어떤 세균 유전자, 경로 및 과정의 조합이 교란되었을 때 세균의 적응도가 개선되거나 감소하는지에 대한 이해는 가장 효과적인 개입 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜을 시작하기 위해, 서면 절차에 기술된 대로 PKD3 플라스미드의 클로람페니콜 내성 마커로 표적 오픈 리딩 프레임을 대체하기 위해 2단계 네스티드 PCR 증폭법을 사용합니다.

예상되는 생성물을 확인하고 제조사의 프로토콜에 따라 얻은 단편을 PCR 정제합니다. PCR 생성물을 30 µL의 멸균 증류수에 용출시킨 후, 농도가 약 50 mg/µL가 되도록 희석합니다. 정제된 생성물은 형질전환 전까지 -20 °C에서 보관합니다.

다음으로, 공여체 구축을 위해 고빈도 재조합(HFR) Caval competent cell을 준비합니다. 먼저, HFR Cavalli 균주의 포화 밤샘 배양액 1 mL를 50 mg/mL Ampicillin 35 µL가 포함된 신선한 LB 배지 70 mL가 담긴 250 mL 플라스크에 접종합니다.

흡광도가 약 0.5에서 0.6이 될 때까지 32 °C에서 220 RPM으로 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그 다음, Lambda Red 재조합 시스템의 열 유도를 위해 배양액을 42 °C의 항온수조로 옮겨 160 RPM으로 흔들며 15분 동안 처리하여 유도를 중단시킵니다. 배양액을 차가운 얼음 슬러리 수조로 옮겨 160 RPM에서 10분에서 20분 동안 유지합니다.

형질전환이 완료될 때까지 세포를 차갑게 유지하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 원심분리를 통해 세포를 세척하고 회수한 후, 상청액을 따라내고 펠렛을 500 µL의 얼음처럼 차가운 10% glycerol Eloqua에 재현탁하십시오. 세포를 50 µL씩 분주하여 미리 냉각시킨 개별 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 즉시 형질전환을 진행하십시오.

정제된 유전자 결손 카세트 100 nanograms를 컴피턴트 세포(competent cells)에 첨가합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 섞은 후, 현탁액을 얼음 위에서 5분 동안 둡니다. 그런 다음 현탁액을 미리 냉각시킨 전기천공 큐벳으로 옮기고, 즉시 세포 혼합물에 전기천공을 수행합니다.

실온의 SOC 배지 1 mL를 첨가하고, 배지가 포함된 전기 천공 세포를 15 mL 배양 튜브로 옮깁니다. 220 RPM의 궤도 진탕을 가하며 32 °C에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면, 세포를 4,400 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.

실온에서 상층액을 약 850 µL 제거하고, 남은 액체에 세포 펠렛을 다시 현탁합니다. 17 µg/mL의 chloramphenicol이 포함된 LB 플레이트에 세포를 도말하고 32 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 변이 확인을 위해 두 개의 개별 형질전환체를 LB chloramphenicol 플레이트에 스트리킹하고, 동일한 형질전환체를 LB kanamycin 플레이트에 스트리킹하여 해당 균주가 kanamycin 내성이 없음을 확인합니다.

다음으로, 서면 프로토콜에 설명된 대로 세 가지 서로 다른 넉아웃 확인 프라이머 세트를 사용하여 DNA를 증폭합니다. 첫 번째 프라이머 세트는 표적 부위의 200 base pairs 상류에 위치한 20 nucleotide 플랭킹 순방향 프라이머와 클로람페니콜 저항성 카세트에 상보적인 역방향 프라이머로 구성됩니다. 이 증폭을 통해 445 nucleotide 크기의 앰플리콘이 생성될 것으로 예상됩니다.

두 번째 세트에는 클로람페니콜 저항성 카세트 서열에 결합하는 정방향 프라이머와, 결손된 유전자의 3' 말단에서 200 base pairs 하류에 어닐링하도록 설계된 역방향 플랭킹 확인 프라이머가 포함됩니다. 이 증폭 반응을 통해 309 nucleotide의 앰플리콘이 생성될 것으로 예상됩니다. 세 번째 PCR에는 상류 및 하류 플랭킹 프라이머가 모두 포함됩니다.

이 반응은 선택한 균주가 한 유전자 궤적은 카세트로 대체되고 다른 궤적은 중복되었으나, 그 외에는 야생형 유전자 복사본이 여전히 존재하는 marrow diploid가 아님을 확인하기 위해 필요합니다. 이 증폭 과정에서는 1.4 KB 크기의 산물이 생성될 것으로 예상됩니다. e coli ke io 단일 비필수 유전자 결손 돌연변이 컬렉션은 로봇을 통해 24 384로 복제 배양되었습니다.

웰당 80 µL의 액체 LB 배지가 담긴 마이크로플레이트를 준비합니다. 양성 대조군으로 사용하며 플레이트 정규화 및 자동 콜로니 정량 분석을 돕는 경계 제어 균주를 위한 공간을 확보하기 위해, mL당 50 µg의 카나마이신을 첨가합니다. 각 플레이트의 가장 바깥쪽 웰에서 접종된 배지를 제거하여 새 플레이트로 옮기고, 가장 바깥쪽 웰은 비워 둡니다.

마찬가지로 각 플레이트 내의 다른 위치에서 두 가지 균주를 제거하고 이를 새 플레이트로 옮겨 음성 대조군 스팟을 생성합니다. 다음으로, 테두리 대조군 웰과 음성 대조군 웰을 포함한 빈 웰에 17 µg/mL의 chloramphenicol이 함유된 LV 배지를 채웁니다. 이러한 음성 대조군 스팟은 수용체 및 이중 돌연변이 플레이트에서 비어 있을 것으로 예상됩니다.

이는 이미징 번호를 매기거나 플레이트를 핀닝할 때 처리 또는 플레이트 핸들링 오류가 없었는지 확인하는 역할을 합니다. 서면 절차에 기술된 대로 테두리 양성 균주를 준비한 후, 어레이 균주와 테두리 양성 균주를 32 °C에서 190 RPM 궤도 진동과 함께 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 테두리 웰에 하룻밤 배양한 배양액을 약 80 µL 채웁니다. 이렇게 조립된 플레이트는 다음 섹션에 설명된 교배에 사용할 수 있습니다.

또는 장기 보관을 위해, 수용 플레이트의 각 웰에 15% glycerol을 첨가하고 배지와 glycerol을 혼합합니다. 그 다음 플레이트를 -80 °C에서 보관합니다. chloramphenicol 내성 카세트로 표지된 쿼리 유전자 결손을 보유한 HFR 공여자 균주를 17 µg/mL의 chloramphenicol이 포함된 rich LB 액체 배지에서 32 °C로 하룻밤 동안 배양하여 교배 절차를 시작합니다.

TH 주문 수신자 돌연변이 컬렉션을 384-콜로니 밀도로 50 µg/mL의 kanamycin이 첨가된 고체 LB 플레이트에 접종하였습니다. 이와 동시에 공여 쿼리 돌연변이 균주를 동일한 수의 LB 플레이트에 384-콜로니 밀도로 접종하였습니다.

17 µg/mL의 chloramphenicol을 첨가합니다. 균주를 접합시키기 위해 플레이트를 32 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 3x84 콜로니 하룻밤 배양 공여체 플레이트에서 공여체를 고체 LB 플레이트로 핀(pin) 전사합니다.

그 다음, 384-콜로니 수용 균주 플레이트에서 균주를 채취하여 갓 접종한 공여균 위에 핀(pin)하여 옮깁니다. 접종된 접합 플레이트를 32 °C에서 16~24시간 동안 배양합니다. 이어서, 각 384 밀도 접합 플레이트를 chloramphenicol이 함유된 단일 고체 LB 플레이트에 핀으로 옮겨 접종합니다.

모든 접합 플레이트의 핀닝(pinning)이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 새로 핀닝된 1차 선택 플레이트를 32 °C에서 16~36시간 동안 배양합니다. 배양 후, 각 1차 선택 플레이트의 콜로니가 4개의 콜로니로 나타나도록 1536 SPOT 형식의 2차 이중 약제 선택 플레이트에 다시 핀닝합니다.

두 번째 선택 플레이트에서 16~36시간 동안 플레이트를 배양합니다. 32°C에서 최종 이중 돌연변이 선택 플레이트를 촬영하여 돌연변이의 성장 적응도를 정량적으로 측정하고 유전자 쌍 간의 상호작용을 분석합니다. 동일한 경로에 있는 유전자들은 밀접하게 상관된 GI 패턴을 나타내므로, S score 프로파일의 전반적인 유사성에 따라 클러스터링하여 기능적으로 연관된 유전자들을 그룹화할 수 있습니다.

GI 프로파일 유사도는 두 유전자의 돌연변이 발생 시 나타나는 표현형의 일치성을 나타내며, 이는 두 유전자가 동일하거나 중첩되는 경로에서 작용하는지를 보여주는 지표가 됩니다. 여기에는 물리적으로 상호작용하는 단백질을 인코딩하는 유전자 쌍의 GI 프로파일 간 상관 계수 분포와 무작위로 추출한 유전자 쌍의 분포가 나타나 있습니다. 정자 배출에 필요한 헤테로삼량체 복합체를 형성하는 두 수송체의 상관된 유전적 프로파일 산점도 예시가 효모 ecoline 유전자의 발현과 함께 제시되어 있습니다.

매우 높은 상관관계를 가진 GI 프로필과의 완화 상호작용(alleviating interactions)은 일반적으로 물리적으로 연관되어 있거나 공통의 생화학적 경로에서 일관되게 작용하는 경로들을 인코딩하는 경향이 있습니다. 여기에서는 필수적인 과정에 공동으로 참여하는 기능적 중복 경로인 ISC 및 SUF 철-황 생합성 경로의 구성 요소들이 서로 구별되는 클러스터를 형성하고, 이들이 광범위한 악화 상호작용(aggravating interactions)에 의해 서로 연결되어 있는 대표적인 사례가 제시되어 있습니다. 통계적 척도를 사용하여 특정 경로 조합 간의 상호작용에 대한 유의미한 농축(enrichment)을 확인하거나, GI 네트워크를 물리적 상호작용 및 게놈 컨텍스트와 같은 기타 기능적 연관 데이터와 통합할 수 있습니다.

관계 분석을 통해 박테리아의 핵심 생물학적 시스템을 정의하는 고차원 기능 모듈의 구성을 밝힐 수 있습니다. 또한 클러스터 분석을 GI 네트워크에 적용하여 주석이 달린 유전자의 기능을 예측할 수 있습니다. 클러스터링 알고리즘은 다양하므로.

하지만 클러스터링을 통해 결정된 추정 기능 할당은 독립적인 실험적 검증이 필요합니다. 이 절차를 시도할 때, 모든 필요한 양성 및 음성 대조군을 포함해야 함을 기억하는 것이 중요합니다. 특정 유전자의 기능뿐만 아니라 유전자와 경로 간의 기능적 관계의 성격에 관한 추가적인 의문에 답하기 위해 프로테오믹스, 생화학적 후속 실험 및 화학 유전체학 등의 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 E. coli 내 유전자와 프로세스 간의 기능적 관계를 조사하기 위해 이중 돌연변이 균주를 구축하고, 수용체 어레이를 조립하며, ESGA 스크리닝을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.