Name: 에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑 대장균 합성 유전자 배열을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 배우세요 대장균에서 유전자 상호작용 네트워크를 탐색하는 eSGA 기술을 사용한 고처리량 유전자 스크리닝 방법을. 이 기법은 세균 유전자 기능과 경로 간 관계를 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 게놈 캐나다, 온타리오 유전체학 연구소, 그리고 JG 및 AE AG에 대한 건강 연구 보조금의 캐나다 연구소의 자금에 의해 지원되었다 Vanier 캐나다 대학원 장학금의 수상자이다.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 GI을 조사하여 경로 수준에서 박테리아 유전자 기능을 조사하기 위해 로봇 eSGA 검사를 사용하기위한 단계 - 현명한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 이 접근 방식은 E.에서 개별 유전자뿐만 아니라 전체 생물 시스템을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 대장균. 조심스럽게 모든 적절한 컨트롤을 포함 위에서 설명한 실험 단계를 실행하고, 엄격하게 분석하고 독립적으로 GI 데이터가 새로운 기능 발견을 만드는 eSGA의 성공을 위해 중요한 요소 아르 확인. eSGA, E.에 GI를 연구를위한 개념적으로 유사한 방법 외에 대장균은 거대한 - 대장균 17 칭했다, 종종 proteomic 23 나 혼자 phenotypic 13 화면과 같은 다른 방법에 의해 놓친 아르 소설 기능의 관계를 조명하는 데 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 게놈 차원의 접근 방식과 마찬가지로 제한이 예를 들어 다른 세균 종까지...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. 항생제&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>바이오숍</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Luria-Bertani 배지&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LB 분말</td><td>바이오숍</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>바이오숍</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 박테리아 균주 및 플라스미드&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hfr Cavalli 균주 &amp;#955;&lt;sub&gt;적색&lt;/sub&gt; 시스템 (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;외 등&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 유전 자원 센터, 예일 대학교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; F- 수용체 컬렉션</td><td>일본 국립바이오리소스 프로젝트(NBRP)&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저기능성(Hypomorphic) &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;F- SPA-태그 균주</td><td>오픈 바이오시스템(Open biosystems); Babu &lt;em&gt;외.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 프라이머&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pKD3 기반의 탈염 처리된 정량 프라이머</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>탈염 처리된 맞춤형 프라이머</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>탈염 처리된 맞춤형 프라이머</td><td></td><td></td><td>F2 및 R2: pKD3 서열 기반의 20nt 불변 영역 및 45nt 맞춤형 상동 영역&lt;br/&gt; F2 불변 영역:&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; R2 불변 영역:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
S1 및 S2: SPA-Cm 카세트 증폭 프라이머용 27 nt 상수 영역 및 45 nt 맞춤형 상동성 영역&lt;br/&gt; S1 불변 영역:&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'&#039;&lt;br/&gt; S2 불변 영역:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F 및 KOCO-C: 비필수 유전자 결실 부위 또는 필수 유전자 부위로부터 200 bp 떨어진 지점에 위치한 20 nt 프라이머&lt;br/&gt; 유전자 SPA-태그 삽입 부위</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. PCR 및 전기영동 시약&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNA 폴리머레이스</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10X PCR 버퍼</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>바이오숍</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염색약</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>바이오숍</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE 완충액</td><td>바이오숍</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>바이오숍</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>시그마</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 사다리</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. DNA 분리 및 정제 키트&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>게놈 DNA 분리 및 정제 키트</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi 키트</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. PCR, 형질전환 및 복제 핀팅(Replica-pinning) 장비&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스 겔 전기영동</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기천공기</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm 전기천공법 큐벳</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C 항온수조 쉐이커</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;진탕 배양기</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C 플레이트 배양기</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDA 벤치탑 로봇</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96, 384 및 1,536 핀 밀도 패드</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96개 또는 384개의 롱 핀(long pins)</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. 이미징 장비&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>카메라 스탠드</td><td>카이저</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털카메라, 1,000만 화소</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이트 박스, Testrite 16&quot; x 24&quot; 단위</td><td>테스트라이트(Testrite)</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. 패드 또는 플레이트 재활용 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% 표백제</td><td>모든 판매처</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>제조사 무관</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 증류수</td><td>제조사 무관</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무균 작업대</td><td>제조사 무관</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자외선 램프</td><td>제조사 무관</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. 실험 기구&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50 ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>제조사 무관</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브</td><td>제조사 무관</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 삼각 플라스크</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 멸균 배양 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>냉동 보관 튜브</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>직사각형 플레이트</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 및 384-웰 마이크로타이터 플레이트</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>다중 웰 밀봉용 플레이트 롤러</td><td>시그마</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>플레이트</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>접착식 플레이트 씰</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 냉동고</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes는 물리적 (단백질 단백질 등) 및 기능 (예 : 유전자 - 유전자 또는 유전자)의 상호 작용 (GI) 1의 복잡한 일련의에 의해 결정됩니다. 물리적 상호 작용은 세균의 단백질은 단지로 등록 된 표시 할 수 있지만, 반드시 경로 수준의 기능 relationships1를 공개하지 않습니다. 이 삭제되거나 inactivated 유전자를 베어링 더블 돌연변이의 성장을 측정하고 해당 단일 돌연변이에 비해되어있는 GI 화면, loci 사이 epistatic 종속성을 조명하고 따라서 새로운 기능의 관계 2 검색하고 발견 할 수있는 수단을 제공 할 수 있습니다. 대형 GI지도는 효모 3-7과 같은 진핵 생물에 대해보고 있지만, GI 정보는 박테리아 genomes의 기능 주석을 방해 prokaryotes 8에 대한 희박한 유지되었습니다. 이를 위해, 우리와 다른 사람들은 높은 처리량 정량 세균 GI 검사 방법 9, 10을 개발했습니다 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. 여기, 우리는 양적 E.를 수행하는 데 필요한 주요 단계를 제시 체계적으로 생성하고 식민지 배열 형식의 이중 돌연변이 다수의 피트니스을 측정하기 위해 자연 박테리아 활용과 상동 재조합을 사용하여 대장균 게놈 규모의 9 합성 유전자 배열 (eSGA) 심사 절차. 간단히, 로봇이 전송하는 데 사용됩니다 , 활용을 통해 chloramphenicol (CM)는 - 마크 F-받는 종자 - 엔지니어링 Hfr에서 돌연변이 대립 유전자 (재조합 높은 주파수) kanamycin의 정렬 배열 (관)에 &#39;기증자 변종&#39;을 표시했습니다. 일반적으로, 우리는에 손실 기능을 중요하지 않은 유전자 삭제를 베어링 단일 돌연변이 ( &#39;케이&#39;컬렉션 11 예)와 필수 유전자 hypomorphic 변이를 (감소 단백질 표현, 안정성, 또는 활동 9, 12, 13를 부여 즉 대립 유전자)를 사용 중요하지 않은, 필수 유전자, 고해상도의 기능 연관을 쿼리pectively. 상동 재조합에 의해 활용하고 다음의 유전자 교환 인한 후, 결과를 두 번 돌연변이는 모두 항생제를 포함하는 고체 매체에 선택됩니다. 가지 후, 플레이트는 디지털 이미징하고 식민지 크기는 양적 내부 자동 이미지 처리 시스템 14를 사용하여 채점하고 있습니다. GIS는 이중 돌연변이의 성장 속도가 예상보다 9 중 훨씬 더 나은 또는 더 나쁜 경우 공개됩니다. 악화 (또는 부정적) GIS는 종종 같은 필수 과정 2 가해진 보상 경로에서 유전자 쌍의 손실 기능 돌연변이 사이에 발생. 여기 하나의 유전자의 손실은 단일 돌연변이가 가능한이 같은 것을 버퍼입니다. 그러나 두 경로의 손실이 해로운이며, 합성 lethality 또는 질병 (즉, 느린 성장)에 발생합니다. 반대로, 경감 (또는 긍정적) 상호 작용과 같은 경로 나 복잡한 단백질 2 유전자 사이에 발생할 수 있습니다혼자 두 유전자의 삭제는 종종 경로 또는 추가 섭동 더, 따라서 성장을 활동을 줄이고하지 않는 등 단지의 정상적인 기능을 교란하기에 충분합니다. 전반적으로, 체계적으로 파악하고 GI 네트워크를 분석하는 것은 다른 방법으로 놓친 경로 수준의 정보가 9 유추 할 수있는 유전자, 많은 수의 사이의 기능적 관계의 편견, 글로벌지도를 제공 할 수 있습니다.

GI는 유전자 간의 기능적 관계를 드러냅니다. 마찬가지로, 동일한 경로에 있는 유전자들은 유사한 GI 패턴을 보이며 GI 프로파일의 유사성은 표현형의 일치성을 나타내므로, GI 프로파일을 클러스터링하여 기능적으로 연관된 유전자들을 경로(pathway)로 그룹화할 수 있습니다. GI 및 GI 상관관계 네트워크를 물리적 상호작용 정보나 게놈 컨텍스트(GC) 관계와 같은 다른 연관 데이터와 통합하면, 박테리아의 핵심 생물학적 시스템(및 시스템 간 상호작용)을 정의하는 고차 기능 모듈의 조직 구성을 밝혀낼 수도 있습니다. 예를 들어, 효모4, 6, 7, 26의 경우와 마찬가지로, 완화 상호작용(alleviating interactions)을 보이면서 GI 프로파일이 매우 높은 상관관계를 갖는 E. coli 유전자 쌍은 물리적으로 연관되어 있거나(e.g. 복합체 형성; Figure 4a) 공통의 생화학적 경로에서 일관되게 작용하는(e.g. ...

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이 칭했다<em&gt; 대장균</em&gt;.

표형질은 물리적(예: 단백질-단백질) 및 기능적(예: 유전자-유전자 또는 유전적) 상호작용(GI)의 복잡한 일련의 과정을 통해 결정됩니다. 반면...

이 절차의 목적은 박테리아 유전자와 경로 사이의 기능적 관계를 조사하는 것입니다. 이는 먼저 접합 또는 교배될 단일 돌연변이 균주인 ceia coli 어레이를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 플레이트 상에서 어레이 형식으로 단일 돌연변이들을 접합시키는 것입니다.다음으로, 이중 돌연변이체를 선별합니다. 마지막 단계는 이중 돌연변이 플레이트를 이미지화하고 이중 돌연변이 콜로니를 정량화하여 균주 적합성을 결정하는 것입니다. 최종적으로, 콜로니 크기 데이터를 분석하여 유전적 상호작용 점수를 계산하고 기능적으로 상호작용하는 유전자, 경로 및 프로세스를 식별합니다.무작위 돌연변이 유발과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수많은 개별 이중 돌연변이 균주를 생성할 수 있다는 점입니다. 또한 유전자의 크기, 필수성 또는 단일 유전자 돌연변이의 적응도와 관계없이 여러 유전자 간의 상호작용을 동시에 평가할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 기능 및 경로와 과정 간의 기능적 크로스토크와 관련된 문제 등 시스템 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 함의는 세균 감염 치료까지 확장됩니다. 대부분의 기능적 중심 유전자와 과정에 대한 지식뿐만 아니라, 어떤 세균 유전자, 경로 및 과정의 조합이 교란되었을 때 세균의 적응도가 개선되거나 감소하는지에 대한 이해는 가장 효과적인 개입 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜을 시작하기 위해, 서면 절차에 기술된 대로 PKD3 플라스미드의 클로람페니콜 내성 마커로 표적 오픈 리딩 프레임을 대체하기 위해 2단계 네스티드 PCR 증폭법을 사용합니다.예상되는 생성물을 확인하고 제조사의 프로토콜에 따라 얻은 단편을 PCR 정제합니다. PCR 생성물을 30 µL의 멸균 증류수에 용출시킨 후, 농도가 약 50 mg/µL가 되도록 희석합니다. 정제된 생성물은 형질전환 전까지 -20 °C에서 보관합니다.다음으로, 공여체 구축을 위해 고빈도 재조합(HFR) Caval competent cell을 준비합니다. 먼저, HFR Cavalli 균주의 포화 밤샘 배양액 1 mL를 50 mg/mL Ampicillin 35 µL가 포함된 신선한 LB 배지 70 mL가 담긴 250 mL 플라스크에 접종합니다.흡광도가 약 0.5에서 0.6이 될 때까지 32 °C에서 220 RPM으로 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그 다음, Lambda Red 재조합 시스템의

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에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑

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