여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

이 절차의 전반적인 목적은 녹색 형광 단백질 리포터 유전자로 표시된 다중 결실을 보유한 효모 균주를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 '프로 몬스터(pro monster)'라고 불리는 반수체 단일 돌연변이체를 준비함으로써 달성되며, 각각의 돌연변이체는 표적 유전자 중 하나 대신 GFP 결실 카세트를 보유하고 있습니다. 두 번째 단계는 프로 몬스터 균주에도 존재하는 GM 툴킷 A 및 GM 툴킷 알파라고 불리는 두 세트의 이배체 및 반수체 선택 마커를 사용하여, 효모 균주의 교배와 포자 형성을 통해 결실을 분배하는 것입니다.

다음으로, 두 개의 결실을 가진 균주를 농축하기 위해 유세포 분석법을 사용하여 감수분열 세포 집단에서 강한 형광을 띠는 세포를 선별합니다. 마지막 단계는 분별된 균주의 유전자형을 확인하는 것입니다. 최종적으로, 결과 균주부터 시작하여 교배와 유세포 분석 농축 과정을 반복함으로써 더 많은 수의 결실을 가진 균주를 생성할 수 있습니다.

마커 재사용을 위한 G 방법이나 순차적 유전자 결실과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 한 사이클당 여러 개의 결실을 획득할 수 있어 다중 돌연변이체의 조립 속도가 더 빠르다는 점입니다. 이 비디오에 첨부된 서면 프로토콜에 설명된 대로 프로몬스터(pro monster)를 생성한 후, 1.6 mL 에펜도르프 튜브에 확립된 프로몬스터 GFP 결실 균주의 배양액을 준비하여 성 사이클링을 시작합니다. 히스티딘이 결핍된 합성 완전 배지(minus his 배지로 지칭) 100 µL에 교배형 A의 결실 균주를 준비합니다. 또한 공기 교환을 위해 1.6 mL 에펜도르프 튜브에 류신이 결핍된 합성 완전 배지(minus lu 배지) 100 µL로 교배형 alpha의 결실 균주를 준비합니다.

70% ethanol로 처리한 푸시핀을 사용하여 튜브 캡에 구멍을 냅니다. 30 °C에서 튜브를 하룻밤 동안 수평으로 회전시킵니다. 이때 회전축은 튜브의 세로축과 평행해야 합니다.

광학 밀도(optical density)를 통해 추정한 GFP 결실 균주의 haplo 세포 약 250,000개와 alpha haplo 세포 약 250,000개를 1.6 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 혼합합니다. 이 세포 수는 보통 각 하룻밤 배양액 7 µL를 넣고 볼텍싱(vortex)한 양에 해당합니다. 먼저 800 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 준비합니다.

상청액을 제거한 후, 70% ethanol로 처리한 푸시 핀을 사용하여 뚜껑에 구멍을 뚫습니다. 공기 교환이 가능하도록 50 µL의 YPDA 배지를 첨가하고, 800 G에서 5분 동안 빠르게 볼텍스 원심분리를 수행합니다. 그런 다음, 빈 팁 박스, 작은 팁 스탠드, 젖은 종이 타월로 만든 습윤 박스에 튜브를 넣습니다.

박스를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 교배 혼합물 10 µL를 G 4 1 8 및 nat 항생제가 포함된 agar 없는 500 µL GNA 배지가 담긴 5 mL 배양 튜브(뚜껑을 느슨하게 닫은 상태)로 옮깁니다. 이때 600 nm에서의 초기 광학 밀도는 대략 0.1입니다. 배양물을 30 °C에서 24시간 동안 회전 배양합니다.

이는 이배체만을 선택할 수 있게 하는데, GM toolkit A의 can MX 4와 nat MX 4를 모두 보유한 이배체만이 G 418과 Nat이 포함된 GN 배지에서 성장할 수 있기 때문입니다. 1일 배양액 20 µL를 G 418과 Nat이 포함된 신선한 GN 배지 500 µL에 접종합니다. 600 nm에서의 시작 흡광도(OD₆₀₀)는 대략 0.2입니다.

세포를 대수 성장기에 도달하게 하기 위해 튜브를 30 °C에서 5시간 동안 회전 배양합니다. 그 후, 이배체를 분리하고 포자를 단리합니다. 서면 프로토콜에 설명된 절차를 따르십시오.

SPO 관련 세포 현탁액을 300 µL씩 두 부분으로 나누어 각각 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 튜브를 800 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 각 튜브의 뚜껑에 구멍을 냅니다.

푸시 핀을 사용하여, 한 튜브의 펠릿에 minus his 배지 100 µL를 첨가합니다. 다른 튜브의 PT에서 alpha haplos를 선택하려면, minus loo 배지 100 µL를 첨가합니다.

튜브를 30 °C에서 하룻밤 동안 회전 배양합니다. 600 nm에서의 최종 흡광도는 0.5 미만이어야 합니다. 600 nm에서의 흡광도가 너무 높게 나타나는 경향이 있다면 실온에서 배양하십시오.

GFP를 유도하려면, 20 µg/mL의 doxycycline이 포함된 신선한 minus hiss 또는 minus LU 배지 100 µL를 각 균주에 첨가합니다. doxycycline의 최종 농도는 10 µg/mL가 됩니다. 튜브를 볼텍싱한 후 30 °C에서 2일 동안 배양합니다.

유세포 분석을 시작하려면, 5 mL 폴리스티렌 튜브의 세포 스트레이너 캡으로 교체한 5 mL 폴리프로필렌 튜브에 미리 여과된 TE 버퍼 900 µL를 넣으십시오. 폴리프로필렌 튜브는 유세포 분석에 적합합니다. 스트레이너 캡은 큰 입자를 제거하기 위해 사용됩니다.

완충액 75 µL를 셀 스트레이너 캡 위에 조심스럽게 분주합니다. 피펫 팁을 메쉬에 밀착시킨 상태에서, 유도된 세포 25 µL를 캡 위의 용액에 추가합니다. 혼합된 용액 전체를 스트레이너로 통과시켜 분주합니다.

스트레이너 캡을 누른 후 튜브를 볼텍싱합니다. minus hiss 또는 minus lube 배지 200 µL가 채워진 1.6 mL fendor 튜브를 사용하여 수집 튜브를 준비합니다. 셀 소터를 작동시키고 제조사 매뉴얼에 따라 설정을 조정합니다.

수집 튜브를 볼텍싱하여 벽면을 배지로 코팅합니다. 또한 세포가 들어 있는 튜브를 세포 분석기에 로딩하기 전에 볼텍싱합니다. 샘플의 유세포 분석 데이터를 획득합니다.

GFP가 없는 균주를 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 높은 GFP 강도를 보일 수 있는 세포 응집체를 제외하기 위해 소팅 게이트를 설정하십시오. 펄스 폭과 펄스 높이 그래프 또는 FSC 면적과 FSC 높이 그래프를 사용하여, 전방 산란광(FSC)의 펄스 폭이나 면적이 비정상적으로 큰 이상치들을 제거하십시오.

세포 응집체의 경우 FSC 값이 높게 나타나므로, FSC 하위 20%에 해당하는 세포만 선택하십시오. 세포 파편이 자주 발견되는 FSC 및 측방 산란광(SSC)의 최저값 영역은 피하십시오. SSC와 GFP 신호는 종종 양의 상관관계를 보입니다.

SSC 값이 더 높은 세포들이 과도하게 농축되는 것을 방지하기 위해, GFP 강도와 SSC 플롯을 사용하여 세포 집단의 주변부를 따라 게이트를 설정함으로써 SSC 축의 각 지점에서 가장 밝은 세포들을 전체적으로 비슷한 비율로 추출하십시오. 이 단계 이전에 FSC 및 SSC 게이트를 통해 선택된 하위 집단의 0.1~1%를 소팅 대상으로 지정하고, 200개를 수집 튜브에 소팅하십시오. 수집 튜브를 볼텍싱하여 소팅된 세포들이 배지로 덮이게 한 후 플레이트에 분주하십시오.

유전자형 분석을 위해 A-Y-P-D-A 플레이트의 세포 일부를 분리합니다. 배양 후 플레이트를 30 °C에서 이틀 동안 배양합니다. 약 12개의 콜로니에 대해 용해물을 제조합니다.

유전자형 분석을 위해 작성된 프로토콜에 명시된 단계를 따릅니다. 정방향 프라이머를 사용하여 10 µL PCR 반응으로 희석된 용해물 1 µL를 분석합니다. 해당 10 µL는 각 결손 유전자의 상류 측면 영역에 결합하며, 모든 결손 유전자좌 내에 결합하는 공통 프라이머와 쌍을 이룹니다.

PCR은 96-well 또는 384-well 포맷으로 수행할 수 있습니다. 증폭 후, 전기영동을 사용하여 PCR 생성물을 분석하십시오.

원하는 유전자형을 가졌을 가능성이 높은 haplo를 식별하십시오. 이 균주들을 새로운 플레이트에 도말하여 배양하십시오. 또한 -80 °C에서 25% glycerol에 동결 보존하십시오.

결손된 유전자의 야생형 서열 부재 확인 및 포스트 필드 겔 전기영동(post field gel electrophoresis)과 같은 추가 테스트를 권장합니다. 유용한 균주를 사용하여 성 주기(sexual cycling)를 반복하십시오. 두 균주의 교배로 얻은 반수체 자손이 GFP를 발현하도록 유도하였습니다.

각 유전자 결손에는 GFP 카세트가 포함되었으며, 유세포 분석기를 사용하여 게이팅을 통해 생성된 세포 집단을 선택했습니다. 이 집단에는 세포 파편이나 세포 응집체가 포함되어 있을 가능성이 낮습니다. 전방 산란광 면적(forward scatter area)과 전방 산란광 높이(forward scatter height)를 기준으로 세포를 게이팅하여 가장 밝은 상위 1%의 세포를 분류하고 회수했습니다.

전방 산란 영역이 불균형하게 크거나, 전방 산란 및 측방 산란을 기준으로 세포를 게이팅했을 때 전방 산란 하위 20%에 해당하는 세포들은 제외되는 경향이 있는 세포 응집체들은 배제되었습니다. 반면, 측방 산란과 GFP 신호를 기준으로 게이팅하여 전방 산란 및 측방 산란이 가장 낮은 데브리스(debris)를 제외한 세포들은 수용되었습니다. 특정 측방 산란 범위 내에서 더 강한 형광을 띠는 세포들을 선택하여, 감수분열 혼합물과 GFP를 발현하지 않는 음성 대조군 샘플을 비교할 수 있도록 하였습니다. P three 집단을 선택하는 데 사용된 것과 동일한 GA가 도표에 표시되어 있습니다. 별도의 haplos에서 유사하게 선택된 음성 대조군 세포들은 GFP를 발현하도록 유도한 후 형광을 기반으로 분류하여 PCR로 분석하였습니다. 무작위 분리로 인해 분류되지 않은 세포에서 예상되는 결실 수는 7.5였습니다.

본 실험에서 분리된 세포들의 평균 결실 수는 8.8 ± 0.3이었으며, 여기에는 결실이 10곳에 발생한 세포 5개가 포함되었습니다. DO 유전자형. 분리된 균주에 대한 PCL은 역방향 프라이머를 사용하여 수행되었습니다.

그 프라이머는 정방향 프라이머와 쌍을 이루어 하류 플랭킹 영역에 어닐링합니다. 그리고 다른 프라이머는 카세트의 끝부분에 어닐링합니다. 밴드가 나타나면 GFP 카세트가 존재함을 나타냅니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 green Monster Method를 사용하여 효모의 결실을 엔지니어링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.