Name: 여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 배우세요 Green Monster 방법을 이용하여 GFP 마커로 표시된 다중 유전자 삭제를 운반하는 효모 균주를 생성하는 기술입니다. 유성 교배와 유세포 분석을 통해 효율적으로 다중 돌연변이체를 조립할 수 있습니다.

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이 작품은 FPRFPR에 YS, RSL의 알프레드 P. 슬로안 재단의 교부금 및 건강 교부금의 미국 국립 연구소 R01 HG003224와 R21 CA130266에 미국 국방 고급 연구 프로젝트 기관 계약 N66001-12-C-4039에 의해 지원했던 건 또한 고급 연구 캐나다 연구소에서 친목 의해 캐나다 우수 연구 의자 프로그램에 의해 지원됩니다.

1. ProMonsters의 생성 <ol><li> tetO 2 GFP 마커와 순서와 프리 머를 사용하여 플라스미드 pYOGM012 (암피실린 저항)에서 URA3 마커를 증폭하여 보편적 인 GFP 교체 카세트 준비 : GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG 및 GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (굵게 표시된 지역 타겟이 분명한 교체를 허용 KanMX4 카세트의 측면을 노릴 지역에 호몰 로지를 제공합니다). PCR 반응은 Phusion의 효소 HF 버퍼, 그리고 0.5 NG / μl의 템플릿 DNA 농도로 시작 3퍼센트 디메틸 sulfoxide (뉴 잉글랜드 BioLabs)를 수행해야합니다. PCR 프로그램은 98 10 초 30 초 및 98 ° C의 35주기위한 ° C, 49 ° 30 초에 C, 그리고 1.5 분 72 ° C입니다. 반응 볼륨 각 변환 실험에 충분한 DNA를 제공하기 위해&gt; 50 μl해야합니다. 우리는 정화열 당 처리 PCR 반응 ~ 50 μl로 QIAquick PCR 정화 키트 (Qiagen)를 사용하지만, 정화 단계를 건너 뛰는 제품은 transformants의 수익율을 증가시킬 수있다. 또는 제한 효소 EcoRI (뉴 잉글랜드 BioLabs)를 사용하여 플라스미드 pYOGM057 (암피실린 저항)를 소화하여 타겟팅이 tetO 2 GFP 및 KanMX4에 대한 동종 URA3 마커뿐만 아니라 지역을 포함하는 조각을 놓습니다. 이 반응에서 DNA의 농도는 ~ 30 NG / μl해야합니다. 반응 볼륨&gt; 34 μl해야합니다. KanMX4 이외의 지역에 GFP 카세트 통합은 적절한 동종 시퀀스에 위의 PCR의 프리 머의 호몰 로지 영역을 조정합니다. </li><li> 보편적 인 GFP 삭제 카세트와 KanMX4 효모 한방 수집 12-haploid 부담을 변환 할 수 있습니다. 의 우즈와 Gietz 13 0.34 μl의 프로토콜에 따라DNA 샘플은 (정화 PCR 제품 또는 비 정화 제한 다이제스트) 각 변환 실험을 위해 사용되어야합니다. 판 CAA-우라 판로 변환 혼합물의 다섯 번째 (0.67 % 효모 질소 기지, 2 % 포도당, 0.6 % casamino 산, 0.0025 % 아데닌 hemisulfate, 0.005 %의 트립토판, 2 %의 한천). </li><li> 절연 식민지를 얻기 위해 신선한 CAA-우라 판에 transformants에서 승리. </li><li> 성장의 부족을 확인하기 위해 200 μg / ML G418을 포함하는 YPDA 판에 식민지에서 세포를 전송합니다. (1.9) 식민지 PCR을 수행 할 수 있습니다 - 성공적인 GFP 통합을 확인하려면 다음 단계 (1.5)가 따르십시오. </li><li> 0.2-ML PCR 튜브 또는 96 - 웰 플레이트 잘에 용해 버퍼 2 μl (0.1 M의 인산 나트륨, 산도 7.4, ZymoResearch에서 1 단위 zymolyase)에 식민지에서 가져온 세포를 추가합니다. 피펫 팁의 확대 및 솔루션을 pipetting하여 섞는다. </li><li> P200 Pipetman (Gilson)를 사용하여 미네랄 오일 한 방울 (약 20 μl)와 중첩. </li><li> 37 혼합물을 품다 °95의 다음 20 분 및 ° 10 분에 C에 대한 C. </li><li> 50 μl 물 lysate를 희석. 열 번과 아웃 솔루션을 pipetting하여 섞는다. </li><li> 상류 측면을 노릴 지역 anneals의 순서 CCTGAGAAAGCAACCTGACC (카세트의 처음부터 285 BP)의 입문서와 페어링하는 (A) 앞으로 입문서로 10 μl PCR 반응을 사용하여 lysate 1 μl, (B) 역을 분석 프라이머 그 순서 GCATTGGGTCAACAGTATAG (끝에서 375 BP)의 입문서와 짝을 하류 지역에 anneals (C)은 두 시퀀스를 CGTACTCCTGATGATGCATG과 (181 BP) GACGAAATACGCGATCGCTG과 KanMX4에 단련 프리 머, 그리고 (D)은 두 프리 머 그 대상 유전자 (그림 4)의 야생 형 시퀀스로 어닐링. 삭제 컬렉션에있는 긴장의 약 8 %가 aneuploidy 14을 포함하는 것으로 알려져 있기 때문에 (D) 중요합니다. 올바른 transformant가 함께 긍정적이어야합니다 (A)와 (B) 및 제외 어있는 (C)와 (D). </li><li> 를 소개하려면transformant에 GMToolkit은 1.6 ML Eppendorf 튜브에 변형 변형에서 약 250,000 세포 있으며 RY0146 (GMToolkit -을 포함) 또는 RY0148 (GMToolkit-α를 포함하는)의 250,000 셀을 추가 할 수 있습니다. 와동. RY0146 및 RY0148의 genotypes은 MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit - [CMVpr - rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5]와 MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr - rtTA NatMX4 STE3pr - LEU2], 각각. 홍보 발기인를 나타냅니다. 휴대폰 번호는 앞의 문화의 광학 밀도의 추정해야합니다. </li><li> 2 분 800 XG에 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 공기 교환을 할 수 있도록 70 %의 에탄올로 치료 고정 핀을 사용하여 뚜껑에 구멍을합니다. </li><li> YPDA 미디어 (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 %의 포도당, 그리고 0.003 % 아데닌 hemisulfat의 50 μl를 추가합니다E). 와동. </li><li> 5 분 800 XG에 원심 분리기. </li><li> 젖은 상자에서 튜브를 놓습니다. 이 작업은 빈 팁 상자, 작은 팁 스탠드, 그리고 젖은 종이 타월로 생성 할 수 있습니다. </li><li> 30에서 밤새 상자를 품다 ° C. </li><li> 먼저 CAA-우라 판에있는 셀을 좋겠어하여 정합 diploids을 선택합니다. 하루 30 ° C에서 판을 품다. </li><li> diploids을 선택에 대해 200 μg / ML G418을 포함 YPDA 판에서 분리 된 식민지 (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 %의 포도당, 0.003 % 아데닌 hemisulfate, 2 %의 한천)을 만들기 위해 대량 지​​역, 연속에서 그들을 세포를 촬영 포함 GMToolkit - 또는 100 μg / ML nourseothricin (NAT) GMToolkit-α를 포함하는 diploids 선택을위한 15. </li><li> 3 일 동안 30 ° C에서 판을 품다. </li><li> 격리 된 식민지에서 시작은, 한천없이 GNA 매체 500 μl로 세포의 대부분을 이전 (1 % 효모 추출물, 3% Difco 영양소 국물, 그리고 5 % 포도당, 압력솥 포도당과 t의 나머지그는 구성 요소는 별도로으로 뚜껑이있는 5 ML 문화 관 caramelization을 방지하기 위해 2 × 솔루션)은 느슨하게. </li><li> 30에 다섯 시간 동안 수평 관을 회전 ° C. 회전의 축은 튜브의 길이 방향 축에 평행 있어야합니다. </li><li> 에서 사용되는 식민지를 확인 (1.21) 우라는 + CAA-우라 판에 그들을 좋겠어으로. </li><li> 2 분 800 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 최소한의 sporulation 매체 (, 필터 소독 1 % 칼륨 아세테이트, 0.005 %의 아연 아세테이트) 500 μl를 추가합니다. 와동. </li><li> 2 분 800 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 반복 (1.25) - (1.26) 두 번. </li><li> 7.5 μg / ML 리신, 7.5 μg / ML 류신, 5 μg / ML 히스티딘, 5 μg / ML 메티오닌, 그리고 1.25 μg / ML uracil (auxotrophic 긴장의 sporulation 속도를 향상하기 위해)를 보충 최소한의 sporulation 매체 1 ML을 추가 . 와동. </li><li> 하루 실온에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 2 일 30 ° C에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 2 분 800 XG에서 1.6 ML Eppendorf 튜브에이 혼합물의 125 μl를 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> zymolyase 솔루션 (100 MM 나트륨 인산염 버퍼, 산도 7.4, 1 M sorbitol 및 ZymoResearch에서 2 단위 zymolyase) 50 μl를 추가합니다. 피펫 팁의 확대 및 솔루션을 pipetting하여 섞는다. </li><li> 1 시간에 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> 0.02 % NP-40의 50 μl를 추가합니다. 피펫 팁의 확대 및 솔루션을 pipetting하여 섞는다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 관 둡니다. </li><li> 물 500 μl를 추가합니다. </li><li> 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> Sonifier 450 (브랜슨)와 3.2 mm microtip를 사용하여 15 초 1의 출력 설정 (약한 설정)에서 두 번이 혼합물을 Sonicate. sonication의 두 발 사이에, ~ 0 ° C.에 온도를 반환 얼음에 튜브를 넣어 </li><li> 5 분 800 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> SC-우라 - 그의 200 μl를 추가합니다() 또는 교차 GMToolkit - 또는 GMToolkit-α를 통합인지 여부에 따라 SC-우라 - 레우 (α) 매체. 미디어를 준비하려면 SC-우라 - 그의 - 레우 매체 (0.67 % 효모 질소 기지, 2 % 포도당, 0.01 % 아르기닌, 0.01 % 아스파르트 산, 0.01 % 글루탐산, 0.01 % 이소류신, 0.01 % 리신, 메티오닌 0.01 % 할 , 0.01 %의 페닐알라닌, 0.08 %의 세린, 0.04 %의 트레오닌, 0.002 %의 티로신, 0.03 %의 발린, 0.0025 %의 아데닌, 0.005 %의 트립토판, 0.003 %의 아데닌, 그리고 0.005 % 트립토판) 및 멸균 히스티딘 또는 류신로 보충을 사용하기 전에 0.01 %의 최종 농도. </li><li> 70 % 에탄올로 치료 고정 핀을 사용하여 뚜껑에 구멍을 확인합니다. </li><li> 2 일 30 ° C에서 수평 관을 회전합니다. 회전의 축은 튜브의 길이 방향 축에 평행 있어야합니다. </li><li> SC-우라 - 그의 또는 SC-우라 - 레우 한천 플레이트 (위의 동일한 재료를 플러스 2 % 한천에있는 세포에서 승리는, 트레오닌과 아스파르트 산 후 추가해야합니다utoclaving, ProMonster의 변종에 대한 절연 식민지를 만들기 위해) 주입 전에 히스티딘 또는 류신를 추가합니다. </li></ol> 2. 성적 사이클링 <ol><li> 100 SC-그의의 μl (A) 또는 30에서 결합 유형에 따라 SC-레우 (α)의 설립 GFP 삭제 스트레인의 문화를 회전 ° C 하룻밤 1.6 ML Eppendorf 튜브을 사용합니다. 공기 교환의 경우 70 % 에탄올로 치료 고정 핀을 사용하여 구멍을합니다. 수평 관을 회전합니다. 회전의 축은 튜브의 길이 방향 축에 평행 있어야합니다. 호텔은 실내 masse 결합을 통해 여러 변종을 넘는 할 수 있습니다. 정렬 샘플은 직접 2 일 30 ° C에서 200 μl이 목적, 문화, 전지에 사용하는 경우. SC-우라 - 그의 - 레우 매체와 히스티딘 (0.01 %) 나 루신 (0.01 %) : 매체를 준비하려면, uracil을 (0.0025 % 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 1.6-ML Eppe에 250,000 - haploid 세포와 GFP를 삭제 긴장의 250,000 α-haploid 세포를 혼합ndorf 관. 와동. </li><li> (1.17) - 다음 단계 (1.11)에 의해 이러한 세포를 버려. </li><li> 느슨하게 뚜껑으로 5 ML 문화 튜브에 200 μg / ML G418과 100 μg / ML NAT를 포함 500 μl GNA 매체에 결합 혼합물의 10 μl를 전송합니다. 시작 OD 600 약 0.1이다. </li><li> 24 시간 30 ° C에서 문화를 회전합니다. 만 diploids가 모두 KanMX4을 포함하기 때문에이 diploids의 선택을 허용 GMToolkit - GMToolkit-α 및 NatMX4는 G418 및 NAT의 존재 (그림 3)에서 증가 할 수 있습니다. </li><li> G418 및 NAT를 포함하는 신선한 GNA 500 μl에 하루 문화의 20 μl를 전송합니다. 시작 OD 600 약 0.2이다. </li><li> 로그 단계 (~ 1 OD 600)에 셀을 가져 오 시간에 30 ° C에서 튜브를 회전합니다. </li><li> diploids을 sporulate과 포자를 분리하고 (1.38) - 단계 (1.24)를 따르십시오. </li><li> 이 300 μl에 sporulated 세포 현탁액을 분할부품은 별도의 1.5 ML Eppendorf 튜브에 각각 넣어. </li><li> 5 분 800 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 한 튜브의 펠렛으로, A-haploids을 선택 SC-그 중간의 100 μl를 추가합니다. 다른 튜브의 펠렛으로, α-haploids를 선택 SC-레우 매체 100 μl를 추가합니다. </li><li> 30 ° C 하룻밤에 튜브를 회전합니다. 최종 OD 600 0.5 미만이어야합니다. OD 600 너무 높은 경향이있는 경우 실온에서 배양을 시도해보십시오. </li><li> GFP를 유도하기 위해 신선한 SC-그의 () 또는 20 μg / ML의 doxycycline가 포함 된 SC-레우 (α) 매체입니다. 100 μl를 추가합니다 doxycycline의 최종 농도는 10 μg / ML입니다. 와동. </li><li> 2 일 30 ° C에서 튜브를 회전합니다. </li></ol> 3. 유동 세포 계측법 <ol><li> 캡 5 ML 폴리 프로필렌 튜브 (BD 팔콘 # 352063)에 10 μg / ML doxycycline을 포함하는 사전 필터링 TE 버퍼 900 μl (산도 7.5)를 추가로 교체 세포5 ML 폴리스티렌 튜브의 스트레이너 캡 (BD 팔콘 # 352235). 폴리 프로필렌 튜브는 유동 세포 계측법에 적합합니다. 스트레이너 캡은 대형 입자를 제거하기 위해 원하는 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 셀 스트레이너 캡에 doxycycline과 TE 버퍼의 75 μl를 놓습니다. </li><li> 캡의 솔루션으로 유도 세포의 25 μl를 추가합니다. </li><li> 메쉬에 대한 Pipetman의 끝을 누르면 있지만, 스트레이너를 통해 통합 솔루션을 모두 쏴. </li><li> 스트레이너 캡과 소용돌이 관을 누릅니다. </li><li> SC-그의 또는 SC-레우 200 μl로 가득 수집 튜브를 (1.6-ML Eppendorf 튜브) 준비합니다. </li><li> 셀 정렬을 시작하고 제조업체 설명서에 따라 설정을 조정합니다. </li><li> 소용돌이 수집 관 (코트 매체로 벽을에)와 셀 정렬에를로드하기 전에 세포를 포함하는 관 모두. </li><li> 샘플의 유동 세포 계측법 데이터를 수집. GFP을 포함하지 않는 변형은 대조군이 될 수 있습니다. </li><li> 정렬을위한 문을 그립니다. (A)높은 GFP의 강도를 전시 할 수 셀 집계를 방지하기 위해 FSC 높이의 줄거리와 FSC를 사용하여 펄스 폭 및 펄스 높이 MoFlo 정렬 또는 불균형 작은 FSC 높이의 도면을 사용하여 앞으로 분산 (FSC)에 어울리지 않게 큽니다 펄스 폭과 특이점을 취소 FACSAria 정렬 (그림 5, 왼쪽 위 패널)의 공간을 제공합니다. (B) 대형 FSC (면적)은 세포 집계에 예상되어 있기 때문에, 낮은 FSC, 측면 분산 (SSC) 세포 파편은 종종 발견되는 값으로 지역을 피하면서 만 FSC의 낮은 20 %에 세포를 (그림 5, 오른쪽 상단 패널). (C) SSC (지역)와 GFP 신호 (지역) 종종 긍정적으로 서로 관련되어 있습니다. 단순히 위의 문 주어진 가장 밝은 세포를 복용 때문에도 높은 SSC 값이 세포에 풍부 것, 각 지점에서 가장 밝은 세포의 비슷한 비율을 취할 GFP 강도와 SSC의 도면을 사용하여 인구의 주변을 따라 문을 그려 SSC 축 (그림 5, bott의)도 톰 - 좌. (C)에서 선택한 인구 (B)에서 선택한 인구의 0.1-1 %이어야합니다. </li><li> (3.10)에 기준을 제공 수집 관에 200 세포를 정렬합니다. 필요에 따라 전용 masse 과정 또는 더 복잡한 인구를 요구하는 다른 프로젝트에 대한 더 많은 세포를 정렬합니다. </li><li> 소용돌이 수집 관은 매체와 정렬 셀을 포함합니다. </li><li> 판 genotyping에 대한 YPDA 접시에 세포의 일부 (예를 들어, 50 셀). </li><li> 2 일 30 ° C에서 판을 품다. </li><li> (1.8) - 단계 (1.5)에 따라 ~ 12 식민지의 lysate를 확인합니다. </li><li> 부드럽게 팁과 플레이트를 터치하여 G418 및 NAT를 포함하는 YPDA 플레이트에 입단에 사용되는 팁 (1.5)에 잔여 세포를 전송합니다. 선택한 haploids이 접시에 성장해서는 안됩니다. Diploids 더 GFP 사본이있을 수 있으므로 밝게 할 수 있습니다. 이 테스트는 haploid 선택의 효율성을 표시 할 수 있습니다. </li><li> genotyping를 들어, 10 μl PCR R을 사용하여 lysate의 1 μl를 분석순서 CCTGAGAAAGCAACCTGACC의 입문서와 짝을 각각 삭제 유전자의 상류 측면을 노릴 지역에 anneals하는 기대 입문서로 eaction. 멀티 플렉스 PCR 반응 가능하면 (조건은 단일 돌연변이의 lysates를 사용하여 결정 할 수 있습니다.) 또는 384도 형식 - PCR은 96에서 수행 할 수 있습니다. 후자의 형식은 최소 5와 μl의 반응 볼륨에 적합합니다. PCR 마스터의 Arraying은 프리 머 이러한 믹스에 세포 lysates의 추가는 멀티 채널 피펫 또는 액체 처리 로봇을 사용하여 수행 할 수에 차이가 조화를 이루고 있습니다. 다른 PCR 믹스에 동일한 lysate을 추가 할 때 팁 변경은 선택 사항입니다. </li><li> PCR 제품을 분석합니다. 젤 XL 울트라 V-2 전기 시스템 (Labnet)는 멀티 채널 피펫을 사용하여 샘​​플 로딩과 호환됩니다. </li><li> 의 정보 (3.16) 및 (3.18)에 따라 genotypes을 원하는 한 것 haploids를 확인합니다. </li><li> 신선한 플레이트 (YPDA, CAA-우라, 또는 SC-Ura-His/Leu)에 이러한 변종을 설정합니다. 또한,에서 그들을 동결-80에서 25 % 글리세롤 ° C. 이러한 삭제 유전자 및 펄스 - 필드 겔 전기 영동을위한 야생 형 시퀀스의 부재의 확인 등의 추가 시험이 권장됩니다. </li><li> 유용한 긴장과 성적 자전거 (2.1)를 반복합니다. </li></ol>

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<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li>
<li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962(2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리가 그린 몬스터 접근 방식을 개발로서, 우리는 게놈 다시 정리하기로 이어지는, 다른 GFP 교체 카세트 사이의 재조합의 가능성에 관심을했습니다. 이 가능성에 대한 완화하는 것은 성공적으로 결합하고 세포의 감수 분열의 여러 순찰을받은 세포에 대한 선택입니다. 재 배열 genomes을 간직한 세포는 동일한 다시 정리하기없이 셀에 결합 후 더 적합 할 것으로 예상됩니다. 사실, 우리는 GFP 카세트 11 사이의 재조합에 의한 게놈 불안정성을 관찰 없습니다. 그러나, 우리는 완전히이 가능성을 제외 할 수 없습니다, 그래서 그것은 사용자가 다시 정리하기 위해 생성 된 변종을 테스트하는 것이 좋습니다. 펄스 - 필드 겔 전기 영동은 총 이상을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 삭제 내에서 시퀀스에 소둔 프리 머와 PCR은 야생 형 시퀀스의 부재를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 설립 긴장, GF의 형광 수준에 따라P 강도는 채도가 한 16 삭제 11</...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 악기의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A1720 </td><td> (0.2-μm 필터) 물에 녹아 및 필터 - 소독. 주식 농도 : 200 밀리그램 / ML. 4 ° C.에 저장 </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> 워너 BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> (0.2-μm 필터) 물에 녹아 및 필터 - 소독. 주식 농도 : 100 밀리그램 / ML. 4 ° C.에 저장 </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D9891 </td><td> (0.2-μm 필터) 50 % 에탄올에 용해 여과 - 소독. 주식 농도 : 10 밀리그램 / ML. 4 주마다 신선한하십시오. 4에 알루미늄 호일 및 매장을 사용하여 빛의 방패 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco 효모 질소 기지 w / O 아미노산 </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> 권총 (튜브 용 회전하는 것) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro 젤 XL 전기 영동 장치 </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> 브랜슨 </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450에 대한 Microtip </td><td> 브랜슨 </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria 셀 정렬 </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo 셀 정렬 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX 또는 동급 로봇 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td></td><td> 선택 사항입니다. genotyping의 PCRs을 설정하십시오. </td></tr></tbody> &lt;/ TABLE&gt;

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

유전자 삭제에 대한 Phenotypes은 종종 변이가 특정 유전 배경이나 환경 조건 1,2에서 테스트하는 경우에만 공개됩니다. 많은 유전자 숨겨진 유전자의 기능에게 3,4 가면을 벗어 라하기 삭제해야 예제가 있습니다. 중요한 발견의 가능성에도 불구하고, 세 개 이상 유전자를 포함한 유전자 상호 작용은 크게 미개척 있습니다. 다중 돌연변이의 상호 작용 철저한 검색의 삭제 가능한 조합의 깎아 지른듯한 숫자로 인해 비실용적 것입니다. 그러나, 이러한 일반적인 기능을 공유 큰 사전 기회로 paralogs 세트 등 유전자,의 선택한 세트의 연구 정보를 것입니다. 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 유전자 녹아웃는 상동 재조합을 통해 선택 마커로 유전자를 대체하여 수행됩니다. 마커의 수가 제한되어 있기 때문에, 방법은 샘을 제거하고 재사용을 위해 개발 된<html> 전자 표시 5,6,7,8,9,10. 시간이 생성 될 삭제의 수와 비늘 선형 필요하기 때문에 그러나, 이러한 방법을 사용하여 순차적으로 엔지니어링 여러 변이은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 여기 정기적으로 효모 11 여러 삭제를 꾸민위한 그린 몬스터 방법을 설명합니다. 이 방법에서는, 삭제에 통합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자는 각 변형에 포함 된 삭제의 수 (그림 1)에 따라 양적 라벨 긴장하는 데 사용됩니다. 효모 결합 및 세포의 감수 분열을 통해 GFP-표시의 삭제 구색의 반복 라운드는 긴장의 삭제의 축적 (그림 2)로 연결이 삭제 더 많은을 가진 변종의 흐름 cytometric 강화와 결합. , 라운드 당 하나 이상의 삭제를 통합하는 각 과정, 병렬로 여러 프로세스를 수행하면 변형 건설에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. 내용이 &quot;&gt; 첫 번째 단계는 haploid 단일 돌연변이는 칭했다 준비하는 것입니다 &#39;ProMonsters&#39;를 GFP를 삭제 궤적에서 기자와 &#39;툴킷&#39;중 하나를 수행 각각의 loci을 하나 그린 몬스터 GMToolkit -이나 GMToolkit-α .. can1Δ 궤적 (그림 3) 효모 삭제 컬렉션 12 일부터 변종을 사용하여이 GFP-마크 삭제 편리하게 보편적 GFP을 통해 이러한 변종에 존재하는 일반적인 KanMX4 카세트 교체에 의해 생성 될 수있다 - URA3 조각을 각 GMToolkit에는 다음이 포함됩니다 중 - 또는 α-결합 형 특정 haploid 선택 마커 1과 정확히 두 GMToolkits이 존재 경우, 이하 diploids의 선택을 허용, 그런 두 마커 중 하나입니다. 두 번째 단계는 삭제 loci는 무작위 구색 및 / 또는 meiotic recomb하여 단일 세포 내에서 결합 할 수있는을 통해 성적 자전거를 수행하는 것입니다결합 및 sporulation의 각주기를 함께 ination.

네 GFP-마크 삭제합니다 (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) 수행 - haploid 변형은 네 삭제를 수행 α-haploid 변형으로 건너되었을 때 (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), 두 삭제와 (ycl033cΔ yer042wΔ)은 두 변종이 대표에서 공유 결과는 얻은 것입니다. 짝짓기 혼합물은 diploids을 선택 G418 및 NAT를 포함하는 YPDA 매체에 배양되었다. 그 결과 diploids는 sporulation 매체에 배양 하였다. 포자는 zymolyase 치료와 sonication에 의해 분산, 그리고 haploid 선택 미디어에서 germinated되었습니다. 세포는 다음 GFP를 표현하도록 유도했다. 흐름 cytometer로 문을 사용하여 셀의 인구는 쓰레기 또는 셀 집계 (그림 5)를 포함 할 가능성이 있다는 선정되었습니다. 이 인구 내에서 세포의 가장 밝은 1퍼...

그린 몬스터 방법은 리포터 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질로 표시된 여러 삭제의 급속한 조립이 가능합니다. 이 방법은 반복 삭제의 성적 구색의 사이클 등 삭제를 들고 세포의 형광 기반의 강화를 통해 효모 변종 운전에 기반을두고 있습니다.

유전자 결실에 따른 표현형은 특정 유전적 배경이나 환경 조건에서 돌연변이를 테스트했을 때만 드러나는 경우가 많습니다1,2. ...

이 절차의 전반적인 목적은 녹색 형광 단백질 리포터 유전자로 표시된 다중 결실을 보유한 효모 균주를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 '프로 몬스터(pro monster)'라고 불리는 반수체 단일 돌연변이체를 준비함으로써 달성되며, 각각의 돌연변이체는 표적 유전자 중 하나 대신 GFP 결실 카세트를 보유하고 있습니다. 두 번째 단계는 프로 몬스터 균주에도 존재하는 GM 툴킷 A 및 GM 툴킷 알파라고 불리는 두 세트의 이배체 및 반수체 선택 마커를 사용하여, 효모 균주의 교배와 포자 형성을 통해 결실을 분배하는 것입니다.다음으로, 두 개의 결실을 가진 균주를 농축하기 위해 유세포 분석법을 사용하여 감수분열 세포 집단에서 강한 형광을 띠는 세포를 선별합니다. 마지막 단계는 분별된 균주의 유전자형을 확인하는 것입니다. 최종적으로, 결과 균주부터 시작하여 교배와 유세포 분석 농축 과정을 반복함으로써 더 많은 수의 결실을 가진 균주를 생성할 수 있습니다.마커 재사용을 위한 G 방법이나 순차적 유전자 결실과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 한 사이클당 여러 개의 결실을 획득할 수 있어 다중 돌연변이체의 조립 속도가 더 빠르다는 점입니다. 이 비디오에 첨부된 서면 프로토콜에 설명된 대로 프로몬스터(pro monster)를 생성한 후, 1.6 mL 에펜도르프 튜브에 확립된 프로몬스터 GFP 결실 균주의 배양액을 준비하여 성 사이클링을 시작합니다. 히스티딘이 결핍된 합성 완전 배지(minus his 배지로 지칭) 100 µL에 교배형 A의 결실 균주를 준비합니다. 또한 공기 교환을 위해 1.6 mL 에펜도르프 튜브에 류신이 결핍된 합성 완전 배지(minus lu 배지) 100 µL로 교배형 alpha의 결실 균주를 준비합니다.70% ethanol로 처리한 푸시핀을 사용하여 튜브 캡에 구멍을 냅니다. 30 °C에서 튜브를 하룻밤 동안 수평으로 회전시킵니다. 이때 회전축은 튜브의 세로축과 평행해야 합니다.광학 밀도(optical density)를 통해 추정한 GFP 결실 균주의 haplo 세포 약 250,000개와 alpha haplo 세포 약 250,000개를 1.6 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 혼합합니다. 이 세포 수는 보통 각 하룻밤 배양액 7 µL를 넣고 볼텍싱(vortex)한 양에 해당합니다. 먼저 800 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 준비합니다.상청액을 제거한 후, 70% ethanol로 처리한 푸시 핀을 사용하여 뚜껑에 구멍을 뚫습니다. 공기 교환이 가능하도록 50 µL의 YPDA 배지를 첨가하고, 800 G에서 5분 동안 빠르게 볼텍스 원심분리를 수행합니다. 그런 다음, 빈 팁 박스, 작은 팁 스탠드, 젖은 종이 타월로 만든 습윤 박스에 튜브를 넣습니다.박스를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 교배 혼합물 10 µL를 G 4 1 8 및 nat 항생제가 포함된 agar 없는 500 µL GNA 배지가 담긴 5 mL 배양 튜브(뚜껑을 느슨하게 닫은 상태)로 옮깁니다. 이때 600 nm에서의 초기 광학 밀도는 대략 0.1입니다. 배양물을 30 °C에서 24시간 동안 회전 배양합니다.이는 이배체만을 선택할 수 있게 하는데, GM toolkit A의 can MX 4와 nat MX 4를 모두 보유한 이배체만이 G 418과 Nat이 포함된 GN 배지에서 성장할 수 있기 때문입니다. 1일 배양액 20 µL를 G 418과 Nat이 포함된 신선한 GN 배지 500 µL에 접종합니다. 600 nm에서의 시작 흡광도(OD₆₀₀)는 대략 0.2입니다.세포를 대수 성장기에 도달하게 하기 위해 튜브를 30 °C에서 5시간 동안 회전 배양합니다. 그 후, 이배체를 분리하고 포자를 단리합니다. 서면 프로토콜에 설명된 절차를 따르십시오.SPO 관련 세포 현탁액을 300 µL씩 두 부분으로 나누어 각각 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 튜브를 800 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 각 튜브의 뚜껑에 구멍을 냅니다.푸시 핀을 사용하여, 한 튜브의 펠릿에 minus his 배지 100 µL를 첨가합니다. 다른 튜브의 PT에서 alpha haplos를 선택하려면, minus loo 배지 100 µL를 첨가합니다.튜브를 30 °C에서 하룻밤 동안 회전 배양합니다. 600 nm에서의 최종 흡광도는 0.5 미만이어야 합니다. 600 nm에서의 흡광도가 너무 높게 나타나는 경향이 있다면 실온에서 배양하십시오.GFP를 유도하려면, 20 µg/mL의 doxycycline이 포함된 신선한 minus hiss 또는 minus LU 배지 100 µL를 각 균주에 첨가합니다. doxycycline의 최종 농도는 10 µg/mL가 됩니다. 튜브를 볼텍싱한 후 30 °C에서 2일 동안 배양합니다.유세포 분석을 시작하려면, 5 mL 폴리스티렌 튜브의 세포 스트레이너 캡으로 교체한 5 mL 폴리프로필렌 튜브에 미리 여과된 TE 버퍼 900 µL를 넣으십시오. 폴리프로필렌 튜브는 유세포 분석에 적합합니다. 스트레이너 캡은 큰 입자를 제거하기 위해 사용됩니다.완충액 75 µL를 셀 스트레이너 캡 위에 조심스럽게 분주합니다. 피펫 팁을 메쉬에 밀착시킨 상태에서, 유도된 세포 25 µL를 캡 위의 용액에 추가합니다. 혼합된 용액 전체를 스트레이너로 통과시켜 분주합니다.스트레이너 캡을 누른 후 튜브를 볼텍싱합니다. minus hiss 또는 minus lube 배지 200 µL가 채워진 1.6 mL fendor 튜브를 사용하여 수집 튜브를 준비합니다. 셀 소터를 작동시키고 제조사 매뉴얼에 따라 설정을 조정합니다.수집 튜브를 볼텍싱하여 벽면을 배지로 코팅합니다. 또한 세포가 들어 있는 튜브를 세포 분석기에 로딩하기 전에 볼텍싱합니다. 샘플의 유세포 분석 데이터를 획득합니다.GFP가 없는 균주를 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 높은 GFP 강도를 보일 수 있는 세포 응집체를 제외하기 위해 소팅 게이트를 설정하십시오. 펄스 폭과 펄스 높이 그래프 또는 FSC 면적과 FSC 높이 그래프를 사용하여, 전방 산란광(FSC)의 펄스 폭이나 면적이 비정상적으로 큰 이상치들을 제거하십시오.세포 응집체의 경우 FSC 값이 높게 나타나므로, FSC 하위 20%에 해당하는 세포만 선택하십시오. 세포 파편이 자주 발견되는 FSC 및 측방 산란광(SSC)의 최저값 영역은 피하십시오. SSC와 GFP 신호는 종종 양의 상관관계를 보입니다.SSC 값이 더 높은 세포들이 과도하게 농축되는 것을 방지하기 위해, GFP 강도와 SSC 플롯을 사용하여 세포 집단의 주변부를 따라 게이트를 설정함으로써 SSC 축의 각 지점에서 가장 밝은 세포들을 전체적으로 비슷한 비율로 추출하십시오. 이 단계 이전에 FSC 및 SSC 게이트를 통해 선택된 하위 집단의 0.1~1%를 소팅 대상으로 지정하고, 200개를 수집 튜브에 소팅하십시오. 수집 튜브를 볼텍싱하여 소팅된 세포들이 배지로 덮이게 한 후 플레이트에 분주하십시오.유전자형 분석을 위해 A-Y-P-D-A 플레이트의 세포 일부를 분리합니다. 배양 후 플레이트를 30 °C에서 이틀 동안 배양합니다. 약 12개의 콜로니에 대해 용해물을 제조합니다.유전자형 분석을 위해 작성된 프로토콜에 명시된 단계를 따릅니다. 정방향 프라이머를 사용하여 10 µL PCR 반응으로 희석된 용해물 1 µL를 분석합니다. 해당 10 µL는 각 결손 유전자의 상류 측면 영역에 결합하며, 모든 결손 유전자좌 내에 결합하는 공통 프라이머와 쌍을 이룹니다.PCR은 96-well 또는 384-well 포맷으로 수행할 수 있습니다. 증폭 후, 전기영동을 사용하여 PCR 생성물을 분석하십시오.원하는 유전자형을 가졌을 가능성이 높은 haplo를 식별하십시오. 이 균주들을 새로운 플레이트에 도말하여 배양하십시오. 또한 -80 °C에서 25% glycerol에 동결 보존하십시오.결손된 유전자의 야생형 서열 부재 확인 및 포스트 필드 겔 전기영동(post field gel electrophoresis)과 같은 추가 테스트를 권장합니다. 유용한 균주를 사용하여 성 주기(sexual cycling)를 반복하십시오. 두 균주의 교배로 얻은 반수체 자손이 GFP를 발현하도록 유도하였습니다.각 유전자 결손에는 GFP 카세트가 포함되었으며, 유세포 분석기를 사용하여 게이팅을 통해 생성된 세포 집단을 선택했습니다. 이 집단에는 세포 파편이나 세포 응집체가 포함되어 있을 가능성이 낮습니다. 전방 산란광 면적(forward scatter area)과 전방 산란광 높이(forward scatter height)를 기준으로 세포를 게이팅하여 가장 밝은 상위 1%의 세포를 분류하고 회수했습니다.전방 산란 영역이 불균형하게 크거나, 전방 산란 및 측방 산란을 기준으로 세포를 게이팅했을 때 전방 산란 하위 20%에 해당하는 세포들은 제외되는 경향이 있는 세포 응집체들은 배제되었습니다. 반면, 측방 산란과 GFP 신호를 기준으로 게이팅하여 전방 산란 및 측방 산란이 가장 낮은 데브리스(debris)를 제외한 세포들은 수용되었습니다. 특정 측방 산란 범위 내에서 더 강한 형광을 띠는 세포들을 선택하여, 감수분열 혼합물과 GFP를 발현하지 않는 음성 대조군 샘플을 비교할 수 있도록 하였습니다. P three 집단을 선택하는 데 사용된 것과 동일한 GA가 도표에 표시되어 있습니다. 별도의 haplos에서 유사하게 선택된 음성 대조군 세포들은 GFP를 발현하도록 유도한 후 형광을 기반으로 분류하여 PCR로 분석하였습니다. 무작위 분리로 인해 분류되지 않은 세포에서 예상되는 결실 수는 7.5였습니다.본 실험에서 분리된 세포들의 평균 결실 수는 8.8 ± 0.3이었으며, 여기에는 결실이 10곳에 발생한 세포 5개가 포함되었습니다. DO 유전자형. 분리된 균주에 대한 PCL은 역방향 프라이머를 사용하여 수행되었습니다.그 프라이머는 정방향 프라이머와 쌍을 이루어 하류 플랭킹 영역에 어닐링합니다. 그리고 다른 프라이머는 카세트의 끝부분에 어닐링합니다. 밴드가 나타나면 GFP 카세트가 존재함을 나타냅니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 green Monster Method를 사용하여 효모의 결실을 엔지니어링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

우리는 유전자 결실 효율 향상을 위한 Yarrowia lipolytica Po1g 균주의 분자 유전자 조작에 대한 방법을 보고합니다. 그 결과 엔지니어링된 Y. lipolytica 균주는 바이오 연료 및 생화학 생산에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

상 동성 재조합을 통해 생성 된 유전자 결실 돌연변이는 유전자 기능 연구의 황금 표준이다. 결실 구조물의 신속한 생성을위한 OSCAR (Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids의 One Step Construction) 방법이 기술되어있다. 아그로 박테 리움 매개 곰팡이 형질 전환이 이어진다. 마지막으로, 곰팡이 형질 전환 체에서 PCR을 이용한 유전자 결실 확인 방법을 제시한다.

경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산<em&gt; 아그로 박테 리움</em&gt; OSCAR 삭제 구성 요소의 중재 변환

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템은 여러 로시에서 동시에 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 가능하게 합니다. 이것은 이후에 효모 픽셀 예술을 만드는 데 사용되는 효모 균주를 생산하는 카로티노이드를 구성하여 입증됩니다.

CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

배우세요 Green Monster 방법을 이용하여 GFP 마커로 표시된 다중 유전자 삭제를 운반하는 효모 균주를 생성하는 기술입니다. 유성 교배와 유세포 분석을 통해 효율적으로 다중 돌연변이체를 조립할 수 있습니다.

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

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