Name: 장 조작의 표준화 된 모델의 분석 : 쥐의 장 운동성 및 내장 벽의 염증의 기능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 쥐의 장 조작 모델을 통해 수술 후 장마비의 장 운동성 및 근육층 염증을 평가하는 방법을 학습하세요. 이 프로토콜은 위장관 이행과 조직 배양 분석을 포함합니다.

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이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2)와 BONFOR (O-112.0040)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 동물 25g의 평균 무게 남자 C57Bl6 / J 쥐들이 할란 Winkelmann (Borchen, 독일)에서 얻은되었습니다. 모든 실험 동물의 보호에 관한 연방 법에 따라 수행되었다. 실험실 동물 보호의 원칙은 다음 하였다. 동물은 12 시간 조명 / 어두운주기에 유지되고 상업적으로 이용 가능한 쥐 수유와 수돗물 광고 libitum와 함께 제공되었습니다. 동물 최소 7 일 전에 실험 동물 시설에 도착 후 보관해야합니다. 모든 실험은 쉽게 쥐 또는 다른 종에 적응 및 대형 동물 모델에 약간 수정 될 수 있습니다. 2. 수술 절차 <ol><li> 마취는 산소의 (애보트, 비스 바덴 (Wiesbaden), 독일) isoflurane과 유도 및 유지 관리됩니다. 접착제 테이프 위로 향한 위치와 수정 사지 (Leukosilk, 바이어스 도르프, 함부르크, 독일)의 마취 장소 동물의 발병 후. </li&gt; <li> 복부 벽의 면도 및 수술 소독 후 중간 개복술는 2cm의 길이에 수행됩니다. Linea 알바를 따라 절개를 통해 복강을 입력합니다. 장소는 두 살균 견인기 복부가 열려 유지합니다. 조심스럽게 왼쪽에있는 작은 장을 eventerate하고 젖은면 거즈에 배치. </li><li> 동시에이게 맹장에 pylorus에서 작은 주걱을 압연하여 두 촉촉하고 멸균면 applicators (다쳤다는, Neunkirchen, 독일)로 전체 작은 창자 luminal 내용을 대피하십시오. 주의 : 작은 창자 벽이나 내장 혈관의 병변의 출혈을 피하십시오. 국소 빈혈 또는 기계적 폐쇄를 방지하고 지속적인 두 층 5 / 0 polyamid 비 흡수성 봉합을 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용하여 복부 절개를 닫 비틀없이 복막 동굴에 내장 다시 놔. </li></ol> 3. 수술 후 관리 <ol><li> 절차는 가열 램프, observi에서 동물을 배치 한 후NG 그것은이 마취에서 회복 될 때까지. 그 케이지에 다시 마우스를 넣고 물과 음식에 액세스 할 수 있습니다. 연동에 영향을 opioids의 속성으로 인해, 우리는 마시는 물에 엔 사이드에도 그렇구요 (예 metamizol 용)과 perioperative 진통제를 수행합니다. </li></ol> 4. IM 후 기능 연구 24 시간 <ol class="lalpha"><li> 위장 교통 (GIT) <ol><li> IM 후 산소 22.5 시간에서 isoflurane과 약간 쥐를 마취시키다. 조심스럽게 마우스의 머리를 hyperextend하고 무딘 집게로 혀를 빼낸다. 로 1 ML의 주사기를 기입 최소 100 μl fluorescein-라벨 dextran (FITC - dextran, 70,000 MW, 시그마 알드리치, Taufkirchen, 독일), 동맥 카테터 (Vygon, Ecouen, 프랑스)에 연결하고 조심스럽게로 카테터를 삽입 위에 위 관. </li><li> 간단히 100 μl FITC-dextran을 삽입하고 카테터를 꺼내. 깨어있는 동물을하자, 90 분 기다립니다. 이 시간 동안 마우스는 음식이나 물에 액세스 할 수 있습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 십오 2 ML 회전 튜브를 준비하고 연속적으로 레이블을 붙입니다. </li><li> 마우스에게 gavage 후 90 분을 안락사시켜야하고 배에서 항문까지 전체 위장관을 제거합니다. 폴리스티렌 패드에 장을 놓고 스트레칭하지 마십시오. 케이브 : 그것은 인근의 세그먼트로 액체 FITC-dextrane의 변화 방지하기 위해 부드럽게 내장을 제거 할 중요합니다. 처음 들어는 처음에 각 세그먼트의 끝 부분에 클립을 사용하여 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 작은 창자 및 결장의 전체 길이의 전체 길이를 측정합니다. cannulas과 폴리스티렌 패드에 내려 달아로 10 동일 크기의 세그먼트로 작은 창자를 나눌 수 있습니다. 3 세그먼트에 콜론을 나눈다. 당신은 15 세그먼트 (위 # 1), 열 동일 크기의 작은 창자 세그먼트 (# 2-11),이게 맹장 (# 12) 세 3 균등하게 크기의 colonic 세그먼트 (# 13-15)를 준비했습니다. </li><li> 표시된 위치에 소장을 가로로 쪼개다, 집게로 잡아 이전에 준비 KHB containi에 1.0 ML KHB로 한 번에 플러시NG 2.0 ML 튜브 20 초 동안 힘차게 소용돌이. 위와이게 맹장 직접 배치하고 준비된 튜브에서 절단됩니다. 이에 튜브에 가위에서 luminal 내용의 흔적을 린스, 1.0 ML KHB과 함께 튜브를 입력합니다. </li><li> 테이블 탑 원심 분리기에 상온에서 5 분에 12000 rcf에서 프로브를 원심 분리기. 원심 분리하는 동안 다른 15 연속적으로 번호가 1.5 ML 튜브가 준비합니다. </li><li> 4에 새로운 1.5 ML 튜브와 어둠 속에서 매장 ° 분석까지 C (다음 단계)으로 명확 supernatants을 전송합니다. 프로브는 FITC 신호의 상당한 손실없이 4에 며칠 ° C에 저장할 수 있습니다. 더 이상 스토리지는 &lt;-18에서 0.09 % 나트륨 - azide 또는 저장소를 추가 들어 ° C. </li><li> 블랙 96 - 웰 플레이트 (Greiner 바이오 하나 Frickenhausen, 독일)의 supernatants의 피펫 100 μl duplets. 빈과 같은 KHB의 피펫이 100 μl 샘플. </li><li> 형광 리더 (Safire, Tecan, Crailsheim, 독일)의 판을 읽고 fluorescenc을 수량화494 나노 미터 (흡수) / 521 NM (방출) 파장으로 전자. 샘플에서 빈 값을 뺍니다. </li><li> 다음 수식에 의해 실제로 마커의 배포 중력의 중심입니다 FITC-dextran 분포의 기하학적 센터 (GC)를, 계산 : G​​C는 = Σ (세그먼트 당 총 형광 신호의 % * 세그먼트 번호) / 100 </li></ol> 참고 : 해당 세그먼트 번호와 함께 세그먼트의 형광에 대한 비율을 곱한함으로써 소장에서 마커의 배포 가중 평균이 평가된다. 이 점은 마커에 의해 여행 유통 및 거리 모두에 의해 영향을 없지만, 특정 기본 분포를 가정 더 있습니다. 7 계산 GC 값이 종종 위장관 (그림 1A)를 통해 FITC dextran의 분포를 보여주는 그래프와 함께 제공됩니다. </li><li> Colonic 교통 <ol><li> 마우스 isoflur와 약하게 anaesthetized해야합니다산소의 ane 2%. 주의 : 확인 동물은 40 초 내에 깨어 할 것입니다. </li><li> 조심스럽게 항문을 통해 대장에 누 프로브 (금속 막대, 2 밀리미터 직경)를 삽입하여 colonic 명백을 확인합니다. </li><li> 누 프로브는 콜론으로 앞으로 2mm 유리 볼 3cm을 눌러 즉시 프로브를 뽑아 사용합니다. 투명 새장에 마우스를 놓고 누 프로브는 콜론으로 철수 한 이후의 시간을 측정을 시작합니다. 마우스에 눈을 유지하고 유리 볼이 배출 된 후 바로 시간을 중지합니다. </li></ol></li></ol> 5. 절연 ME의 표본의 Histochemical 분석 <ol><li> Midjejunal 세그먼트는 장에서 잘라 Sylgard이 가득한 요리의 추운 KHB에 몰두하고 있습니다. </li><li> 장간막은 0.2 mm 곤충 바늘 (고급 과학 도구, 하이델베르크, 독일)와 요리에 고정되어 있습니다. </li><li> 그 창 자간 막 경계 세그먼트를 열고 그 길이와 폭 ~ 120 % 스트레칭 자른다. 곤충과 고정을 완료장간막의 반대 사이트에 핀. 따라서 모든 luminal 내용을 플러싱, 신선한 얼음처럼 차가워의 KHB을주의 깊게 sylgard 요리를 씻어. ME는 이제 기계적으로 장간막부터 혈관의 점막에서 분리 할 수​​ 있습니다. 준비하는 동안 신선한 차가운 KHB 여러 번 교체하십시오. </li><li> 분리 된 혈관의 점막이 충격을 더 분석을 위해 액체 질소에 냉동 또는 폐기 할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 분을위한 100 % 에탄올로 분리 ME 전체 마운트를 해결했습니다. 차가운 KHB를 사용하여 전체 마운트를 세 번 씻으십시오. 참고 : 다른 fixatives가 (즉, 4 %의 포름 알데히드, 아세트산, aceton)도 이후의 분석과의 호환성을 테스트 한 후 사용하실 수 있습니다. </li><li> ME 전체 마운트가 더 histochemical 또는 immunhistochemical 착색을위한 준비 : </li></ol><ol class="lalpha"><li> Histochemistry : myeloperoxidase (MPO) 착색 침투 PMNs은 다음 MPO의 얼룩 프로토콜을 면밀히 검토 할 수 있습니다. <ol><li> 10 MG H를 해결앙커 예이츠의 10 ML의 KHB의 시약 (Polyscience 유럽, Eppelheim, 독일)와 3 % H 2 O 2의 100 μl를 추가합니다. 사용하고 재사용하지 않는 신선하게 바로 앞에 솔루션을 준비합니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 전체 마운트를 품다. </li><li> 10 분에 추위 KHB 및 배양에 광범위하게 표본을 씻어. </li><li> 가벼운 현미경에서 2 시간 분석 슬라이드에 건조 후 수성 장착 매체에서 표본 (Aquatek, 머크, 다름슈타트, 독일) 탑재합니다. </li><li> 5 무작위로 선택한 분야에서 세포의 숫자를 계산하고 MPO 긍정적 인 세포 / mm 2로 계산합니다. </li></ol></li><li> Immunohistochemical 착색 : 따라서 histochemical MPO의 착색에, 전체 마운트의 immunohistochemical stainings을 수행 할 수 있습니다. 주로, 세포 문화 나 조직 슬라이스의 기존 immunohistochemical 얼룩 프로토콜은 쉽게 전체 마운트 착색에 적용 할 수 있습니다. 그러나 특정 백신에 대한 절차를 최적화시체는 것이 좋습니다 있습니다. <ol><li> 5 × 5 밀리미터 조각으로 표본을 잘라 ~ 150 μl에 2.0 ML 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 얼룩 수행 - 200 μl 항체 솔루션입니다. </li><li> 고정 및 절차를 차단 (실온에서 1 시간을위한 PBS의 예를 들면 3 % BSA)은 &quot;sylgard 요리&quot;에 수행 할 수 있습니다. </li><li> PBS 또는 다른 버퍼의 세척 단계는 12 잘 접시에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 착색 튜브와 식기 플레이트 사이에 날카로운 집게로 조심스럽게. 표본을 전송합니다. </li><li> 표지 용지와 안티 - 변색 장착 중간의 마지막 세척 절차 탑재 표본 한 후에 형광 현미경으로 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 6. ME의 조직 문화 <ol><li> 전체 작은 창자는 IM 후 24 시간을 resected 200 U / ML 페니실린 G 및 100 μg / ML 스트렙토 마이신 (KHB + P / S)를 포함 추운 KHB에 배치되어 있습니다. </li><li> 3cm 길이로 용기를 내서 잘라 gl​​a를 포함하는 Sylgard에 각 세그먼트를 다운 핀SS 요리. </li><li> 고급 가위로 장간막를 제거하고 뜨개질 바늘에 장을 나오십시오. </li><li> 부드럽게 날카로운 집게로 ME를 절개하고 젖은면 작은 주걱을 사용하여 submucosa에서를 제거. 혈관의 점막은 뜨개질 바늘에 남아 추가 조사를 냉동 스냅 할 수 있습니다. ME는 추위 KHB에 수집 + P / S. </li><li> 2 작은 조각으로 ME 절연 스트립 잘라 내기 - 4 밀리미터 길이를하고 + P / S 반 시간 동안 얼음 차가운 KHB에 배양 및 표본 여러 번 씻어. </li><li> 500 μl Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM)을 포함하는 살균 24 잘 플레이트에서 약 50-60 MG ME (한 작은 창자의 절반 ME 이상) 전송합니다. </li><li> 37 품다 ° C, 5 %의 추가 24 시간에 대한 CO 2. </li><li> 현미경으로 세균이나 곰팡이 오염에 대한 세포 문화를 검사합니다. </li><li> 표면에 뜨는 수집, 액체 질소 1,000 rcf 및 스냅 동결에서 5 분을 위해 스핀 다운. 한편 musc 건조 얼룩30 초와 무게에 대한 깨끗한 조직에 르 조직. </li><li> Supernatants는 지시를 생산에 따라 엘리사 또는 표면에 뜨는 다른 metabolites (예 : 아질산)에 의해 발표 크린 시토 킨의 후속 분석 (IL-6)에 사용할 수 있습니다. </li><li> ME 조직의 무게 당 측정 된 농도를 정상화. </li></ol> 7. 대표 결과 <ol><li> 기능성 연구 POI의 심각도를 평가하는 가장 중요한 매개 변수는 생체 내 GIT의 시험입니다. 그림 1A는 치료 컨트롤의 위장관 따라 FITC dextran의 전형적인 분포를 보여주고 intestinally 수술 후 마우스 24 시간을 조작. IM은 근위 공장에서 GIT의 상당한 지연 (그림 1B)로 이끌어 동안 동물이게 맹장에서 계산 기하학적 센터 (GC)와 일반 GIT을 보여 주었다 &quot;위장가 운영하는&quot; Colonic 운동성은 별도로 볼 배설 시간이 O의 측정에 의해 집중되었다FA 2mm 유리 볼. IM은 470 사이의 연장 배설 시간이 주도하면서 200 초 - - 위장 쥐 48의 배설 시간을 보여 운영 775 초 (그림 1C)을. </li><li> 형태학 연구 염증을 설명하는 것은 백혈구의 ME 여러 phenotypes 내에서 연장이 histochemistry 또는 immunohistochemistry를 사용하여 분석 할 수있다. 그림 2A + B의 PMNs의 낮은 존재 동물 (39 ± 7 세포 / mm 2) 관찰 할 수 있었다 &quot;사기가 운영하는&quot;. 작은 창자의 IM은 가짜 운영 마우스에 비해 강력한 PMN의 침투 (660 ± 86 셀 / mm 2)으로 이어 </li><li> ME 조직 문화 세포에서 해방 많은 염증성 중재자는 조직 lysates에 감지 할 수 어렵습니다. 조직 문화는 문화 표면에 뜨는에서 석방 된 중재자의 확인을 할 수 있습니다. POI의 대표 중재자는 위장관의 주요 억제 신경 전달 물질로입니다, 없다 5. NO는 ME 오르간 막에 감지되지 수 없습니다unoperated 제어 동물의 진짜야의 supernatants (5 ± 6 μM / 24 시간 / MG 조직). 허위 조작 (개복술) 쥐 기초는 53 NO 수준의 ± 36 μM / 24 시간 / MG 조직은 관찰되지 않았습니다. intestinally (수술 후 24 시간을 수확) 조작 쥐 ME 문화는 (그림 3) 24 시간 ME 오르간 문화 중 (2,254 ± 853 μM / 24 시간 / MG 조직) 더 NO 크게 생산하지 않습니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig1.jpg" /> 그림 1. GIT (A + B)과 colonic 운송에 IM의 효과가 (C) GIT 15 위장 세그먼트 - 위 (스토), 소장 (SI 1-9로 비 흡수성 fluorescein-라벨 dextran의 비율로 측정되었다 ),이게 맹장 (CEC) 및 콜론 (CO) 경구 섭취 후 -90 분. Colonic 교통은 2mm 유리 구슬의 배설 될 때까지 누 프로브를 뽑아에서 시간을 측정 하였다. fluorescein isothiocyanate - 덱스의 (A) 위장 배포허위 조작이나 IM 후 트란. 허위 조작 동물에서 마커의 대부분은 조작 동물의 근위 jejunal 위치와 비교하여이게 맹장 또는 근위 대장에 자리 잡고 있습니다. 점선은 GC 계산 나타냅니다. (B) GC의 계산은 IM 후 연장 위장 소요 시간을 보여 주었다. (C) Colonic 소요 시간은 사기 운항 동물에 비해 IM 마우스에 상당한 지연을 보여 주었다. 15 장 세그먼트에 대한 GC는 (N = 5) 의미로 표시됩니다. Colonic 교통 시간은 모든 개별 값 (N = 6)와 의미 표시했다. *** = P &lt;0.001, 학생의 t-테스트합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig2.jpg" /> 그림 2. 작은 창자 ME 내 MPO 긍정적 인 세포의 감지. (A) ME 전체 마운트가 MPO 긍정적 인 개복술 후 PMN 24 시간 (사기) 또는 IM 절차의 검출을위한 열망 예이츠 시약 물들했다. 마우스 당 5 무작위로 선택한 분야에서 MPO 긍정적 인 세포의 (B) 정량화. N = 6그룹 당 nimals. *** = P &lt;0.001, 학생의 t-테스트합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig3.jpg" /> 그림 3. ME의 문화 supernatants에서 NO 생산. unoperated 컨트롤의 근육 표본은 사기가 운영하는 IM 마우스는 postoperatively 24 시간을 촬영, 24 시간에 배양 하였다. 치료 마우스는 NO 만 매우 낮은 기저 생산을 보여 주었다. 개복술 후 어떠한 해방은 통제 그룹과 가짜 운영 마우스 사이의 차이를 측정하지 않고 증가하지 않습니다. IM NO 생산 후 24 시간이 급격히 치료 또는 가짜 운영 마우스와 비교 증가된다. 그룹 당 n은 = 5 동물. *** = P &lt;0.001, 1 방법 ANOVA.

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<li>Kalff, J. C., Schwarz, N. T., Walgenbach, K. J., Schraut, W. H., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocytes+of+the+intestinal+muscularis%3A+their+phenotype+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Leukocytes of the intestinal muscularis: their phenotype and isolation.</a> J. Leukoc. Biol. 63, 683-691 (1998).</li>
<li>Kehlet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus.</a> Gut. 47, Suppl 4. iv85-iv86 (2000).</li>
<li>Wehner, S., Schwarz, N. T., Hundsdoerfer, R., Hierholzer, C., Tweardy, D. J., Billiar, T. R., Bauer, A. J., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IL-6+within+the+rodent+intestinal+muscularis+after+intestinal+surgical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Induction of IL-6 within the rodent intestinal muscularis after intestinal surgical stress.</a> Surgery. 137, 436-446 (2005).</li>
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</ol>

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IM (10 분 대 부드럽게이게 맹장에 작은 창자 내용의 피난과 IM 2 대면 applicators를 사용하여 작은 창자의 검사를위한 작은 창자 eventration)의 다른 수준을 분석 비교 연구는 수술 조작 및 POI의 범위 사이의 상관 관계를 발표했다. IM은 장기와 심한 POI의 결과 ME (PNMs, 대 식세포 및 마스트 세포)에 백혈구의 최고 금액을 보여 주었다. 8 다른 그룹과 비교했다. IM의 모델을 확립 할 때, 장 조작의 표준화 작업과 힘은 중요한 단계입니다. 이 절차를 수행하는 동안 장간막을 터치하면 엄격히 출혈을 방지하기 위해 피해야합니다. IM 동안 부족 강도가 작은 대장 팽만이 부족하게됩니다. IM 기술과 힘은 다른 의사 사이에 다릅니다 관심 장소 발생의 상당 변화의 결과 수 있습니다. 같은 연산자를 한 실험에서 모든 동물을 조작해야합니다. 생체 내 분석 GIT과 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Ethilon 5 / 0 </td><td> Ethicon </td><td> 1666H </td></tr><tr><td> 면 applicators </td><td> 다쳤다 </td><td> 71,010 </td></tr><tr><td> 동맥 카테터 </td><td> Vygon </td><td> 115-798 </td></tr><tr><td> 96 잘 플레이트 (블랙) </td><td> Greiner 바이오 하나 </td><td> 655096 </td></tr><tr><td> 유리 볼 (2 밀리미터 직경) </td><td> 워프 </td><td> 요청시 이용 가능 </td></tr><tr><td> 곤충 핀 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26000-25 </td></tr><tr><td> 열망 예이츠의 시약 </td><td> Polyscience </td><td> 560694 </td></tr><tr><td> Aquatek </td><td> 머크 </td><td> HC109850 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-604 F </td></tr><tr><td> FITC-dextran (MW 70,000) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 46945-500MG-F </td></tr></tbody></table>

장 조작의 표준화 된 모델의 분석 : 쥐의 장 운동성 및 내장 벽의 염증의 기능 평가

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

위장관의 염증은 인간의 질병의 다양한 일반적인 이유입니다. 동물 연구 모델은 장 병리학의 휴대 복잡하고 분자를 조사에 중요합니다. 혈관의 점막이 muscularis 바깥이 (ME)도 주민 immunocytes의 조밀 한 네트워크를 비호하는 것이 매우 면역 적격 기관입니다 종종 많은 염증성 질환, 시연 최근 작품에 대한 관심의 기관이지만. 1,2는이 작품은 표준화 내에서 수행 된 주로 ME로 제한 대장 벽의 염증에 이르게 장 조작의 모델 (IM). 염증은 이러한 IL-6 4 또는 IL-1β 또는 억제 신경 전달 물질과 같은 염증성 중재자의 해방을 특징으로하는 임상이 염증은 복부 수술 후 자주와 피할 수없는 합병증이 수술 후 장폐색 (POI)로 알려진 연장 장 dysmotility. 3 연결 nitri 같은C 산화가 (NO) 5. 그 후, immunocytes의 엄청난 숫자가 polymorphonuclear 호중구 (PMN)과 단핵 세포에 의해 지배, ME에 extravasate 그리고 마지막으로 POI를 유지하고 있습니다. 일 동안 지속이,이 장 마비는 흡인의 위험이 증가, 세균 translocation로 연결 및 패혈증 및 다중 장기 실패까지 합병증 전염성하고 높은 경제적 부담을 초래합니다. 6 이 원고에서 우리는 IM과 위장 교통 (GIT)과 colonic 교통의 생체 평가의 표준화 된 모델을 보여줍니다. 또한 이러한 높은 immunoactive 장 벽 구획 모두에서 염증 반응을 구별 할 중요 면역 분석, 다음에 혈관의 점막에서 ME의 분리하는 방법을 보여줍니다. 모든 분석은 위장 기능에 영향을 미치는 쉽게 다른 연구 모델에 양도합니다.

수술 후 장폐색 (POI)가 증가 병적 상태와 장시간 입원으로 이어지는 복부 수술의 합병증입니다. 예방 또는 치료 전략이 심화 연구를 부족하기 때문에하는 것은 필요합니다. 따라서 우리는 POI의 pathophysiology를 조사하고 잠재적 인 치료 옵션을 연구하기위한 표준화하고 실현 가능한 마우스 모델을 만들었습니다.

위장관의 염증은 다양한 인간 질병의 일반적인 원인입니다. 동물 연구 모델은 ...을 조사하는 데 있어 매우 중요합니다.

다음 실험들의 전반적인 목표는 설치류 모델에서 수술 후 장폐색의 발생과 해소를 연구하기 위해 장 조작을 수행하는 것이며, 이는 두 개의 젖은 면봉 사이에서 소장을 표준화된 방식으로 조작함으로써 달성됩니다. 다음으로, 수술 후 운동성을 측정하기 위해 위장관 및 결장 통과 시간을 분석합니다. 그 후, 염증 수준을 조사하기 위해 소장의 근층(muscularis externa)에 대한 조직화학적 분석 및 기관 배양을 수행합니다.호중구 과립구의 강력한 침윤과 배양물 내 산화질소의 과잉 생산이 나타나며, 그 결과 위장관 및 결장 통과 시간이 지연되는 결과가 얻어집니다. 이 방법은 수술 후 장폐색의 발생 및 해결과 관련된 핵심 질문에 답하고, 잠재적인 예방 또는 치료법을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 기술자인 Mario Lewison이 진행하겠습니다. 수컷 마우스에 산소와 함께 0.8~1%의 isoflurane을 투여한 후, 동물을 앙와위로 눕히고 접착 테이프를 사용하여 사지를 고정합니다.약한 통증 자극을 주어 깊은 진정 상태인지 확인합니다. 그 다음, 2cm 길이의 정중 laparotomy를 수행합니다. 이어서, 복부를 개방 상태로 유지하기 위해 두 개의 멸균 견인기를 삽입하고, 소장을 조심스럽게 왼쪽으로 밀어내어 젖은 면 거즈 위에 놓습니다.두 개의 젖은 면봉을 사용하여, 공장부터 맹장까지 면봉을 동시에 굴려 소장 전체의 내강 내용을 제거합니다. 허혈이나 기계적 폐쇄를 방지하기 위해 장이 꼬이지 않도록 하여 복강 내로 다시 넣고, 두 층의 연속 5.0 polyamide 비흡수성 봉합사로 고정합니다. 복부 절개 부위를 봉합합니다.동물을 가열 램프 아래에 두고 마취에서 회복될 때까지 관찰하십시오. 그 후 마우스를 케이지에 다시 넣고 먹이와 물을 제공하십시오. 다음 날.마우스를 완전히 마취시킨 후, 머리를 조심스럽게 과신전시키고 뭉툭한 포셉을 사용하여 혀를 잡아당깁니다. 1 mL 주사기에 100 µL 이상의 플루오레세인 표지 덱스트란을 채웁니다. 이를 동맥 카테터에 연결하고, 카테터를 위관으로 사용하여 위장 속으로 조심스럽게 삽입합니다. 100 µL의 FITC 덱스트란을 빠르게 주입한 후 카테터를 제거합니다.동물이 의식을 회복하도록 하고 90분 동안 기다립니다. 90분이 지난 후, 마우스를 안락사시키고 위에서 직장까지의 전체 위장관을 제거합니다. 장을 폴리스티렌 패드 위에 올리고 잡아늘리지 않도록 주의합니다.다음으로, 소장과 결장의 전체 길이를 측정합니다. 캐뉼라를 사용하여 장을 폴리스티렌 패드에 고정합니다. 소장은 10개의 동일한 구간으로, 결장은 3개의 동일한 구간으로 나눕니다.지정된 위치에서 장을 절단한 후, 각 절편을 1 mL의 Krebs-Henseleit bicarbonate buffer(KHB)로 한 번 세척합니다. 절편들을 순차적으로 라벨링된 2 mL 튜브로 옮기고 강하게 볼텍싱한 후 원심 분리합니다. 그 다음, 상층액을 깨끗하고 번호가 매겨진 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.분석 전까지 4°C의 암소에 보관하십시오. 다음으로 피펫을 사용하여, 각 상층액 100 µL씩 두 번을 검은색 96-웰 플레이트에 분주합니다. 매주 동물을 마취시킨 후, 형광 리더기를 사용하여 플레이트를 측정함으로써 대장 통과 시간을 확인합니다.피스툴라를 삽입하여 결장의 개통성을 주의 깊게 확인합니다. 프로브를 사용하여 항문을 통해 결장 내부로 탐침합니다. 2 mm 유리구슬을 결장 내 3 cm 지점에 삽입하고 프로브를 제거합니다.즉시 타이머를 시작하십시오. 마우스를 투명 케이지에 넣고 펠릿이 배설될 때까지 걸리는 시간을 측정하십시오. 이는 중간 총 샘플의 조직화학적 분석을 위한 것입니다.장(bowel)에서 조직 세그먼트를 절단하여 실리콘으로 채워진 디쉬 내의 차가운 KHB에 담근 후, 곤충 핀을 사용하여 장간막(mesentery)을 디쉬에 고정합니다. 장간막 경계를 따라 세그먼트를 절개하고 조직을 길이와 너비의 120%까지 늘립니다. 장간막부터 시작하여 핀으로 조직을 기계적으로 고정합니다.근육층(muscularis externa) 또는 근층(me)을 점막층(tunica mucosa)에서 분리합니다. 배양을 위해 본 프로토콜의 서면 부분에 따라 샘플을 고정하고 염색합니다. 근층(me).장 조작 절차 후 24시간이 지나면 소장 전체를 절제하여 페니실린 G와 스트렙토마이신이 포함된 차가운 KHB에 넣습니다. 장을 3cm 길이로 자르고, 미세 가위를 사용하여 각 분절을 실리콘 코팅 유리 접시 위에 고정합니다. 장간막을 제거하고 날카로운 포셉을 사용하여 장을 노딩 니들(nodding needle)에 끼웁니다.습윤 면봉을 사용하여 조심스럽게 중간층(me)을 절개합니다. 점막하층에서 이를 박리하여 차가운 KHB plus Ps에 넣습니다. 다음으로, 중간층 조각을 2~4mm 길이로 자르고 얼음처럼 차가운 KHB plus PS에서 30분 동안 배양합니다. 시료를 여러 번 세척합니다.그 다음, 약 50~60 mg의 조직을 500 µL의 DMEM이 담긴 멸균된 24웰 플레이트로 옮깁니다. 조직을 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 상층액을 수집하고 1000 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다.그 후, 사이토카인 또는 일산화질소 측정을 위해 액체 질소로 급속 냉동합니다. 마지막으로, 깨끗한 페이퍼 티슈로 블롯하여 근육 조직을 30초 동안 건조시킨 후 무게를 잽니다. 수술 후 장마비의 심각성을 평가하는 데 있어 가장 중요한 파라미터는 체내 위장관 통과 시간(GIT)을 검사하는 것입니다.이 그림은 수술 24시간 후, 처치를 하지 않은 대조군과 장 조작을 가한 마우스의 위장관을 따라 나타나는 FITC dextran의 전형적인 분포를 보여줍니다. 여기에서 보는 바와 같이, 가짜 수술(sham operated) 동물은 계산된 기하학적 중심이 맹장에 위치하는 정상적인 위장관(GIT) 상태를 보였습니다. Im은 근위 공장에서 위장관 통과 시간을 유의하게 지연시킨 반면, 유리 구슬을 이용한 결장 운동성 분석에서는 가짜 수술 마우스가 48~200초 이내에 구슬을 배출한 반면, Im은 염증 정도를 측정했을 때 배출 시간이 470~775초로 연장되었습니다.ME 내의 백혈구 수치는 여기에서 보이는 바와 같이 조직 화학 또는 면역 조직 화학을 사용하여 분석되었습니다. 대조군 마우스에서는 다형핵 호중구가 거의 관찰되지 않았으나, 소장염은 이들의 강한 침윤을 유도했습니다. 세포에서 방출된 많은 염증 매개체들은 조직 내에서 검출하기 어렵습니다.용해된 장기 배양물은 배양액 내 염증 마커의 검출을 가능하게 합니다. 상층액에서, POI의 대표적인 매개체는 nitric oxide 또는 주요 억제성 신경전달물질인 no로, 이는 위장관의 주요 억제성 신경전달물질입니다. 이 그림은 me에서 nno가 검출되지 않았음을 보여줍니다.대조군 장기 배양액, 가짜 수술을 받은 마우스의 상층액에서는 기초 nno 수치가 관찰되었습니다. 하지만, 장 조작을 거친 마우스의 배양액은 24시간 배양 후 유의미하게 더 많은 nno를 생성했습니다. 숙련된 경우, 이러한 장 조작 기술은 적절히 수행된다면 15분 이내에 완료될 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 수술 후 장폐색을 유도하는 방법과 그 중증도를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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