장 조작의 표준화 된 모델의 분석 : 쥐의 장 운동성 및 내장 벽의 염증의 기능 평가

다음 실험들의 전반적인 목표는 설치류 모델에서 수술 후 장폐색의 발생과 해소를 연구하기 위해 장 조작을 수행하는 것이며, 이는 두 개의 젖은 면봉 사이에서 소장을 표준화된 방식으로 조작함으로써 달성됩니다. 다음으로, 수술 후 운동성을 측정하기 위해 위장관 및 결장 통과 시간을 분석합니다. 그 후, 염증 수준을 조사하기 위해 소장의 근층(muscularis externa)에 대한 조직화학적 분석 및 기관 배양을 수행합니다.

호중구 과립구의 강력한 침윤과 배양물 내 산화질소의 과잉 생산이 나타나며, 그 결과 위장관 및 결장 통과 시간이 지연되는 결과가 얻어집니다. 이 방법은 수술 후 장폐색의 발생 및 해결과 관련된 핵심 질문에 답하고, 잠재적인 예방 또는 치료법을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 기술자인 Mario Lewison이 진행하겠습니다. 수컷 마우스에 산소와 함께 0.8~1%의 isoflurane을 투여한 후, 동물을 앙와위로 눕히고 접착 테이프를 사용하여 사지를 고정합니다.

약한 통증 자극을 주어 깊은 진정 상태인지 확인합니다. 그 다음, 2cm 길이의 정중 laparotomy를 수행합니다. 이어서, 복부를 개방 상태로 유지하기 위해 두 개의 멸균 견인기를 삽입하고, 소장을 조심스럽게 왼쪽으로 밀어내어 젖은 면 거즈 위에 놓습니다.

두 개의 젖은 면봉을 사용하여, 공장부터 맹장까지 면봉을 동시에 굴려 소장 전체의 내강 내용을 제거합니다. 허혈이나 기계적 폐쇄를 방지하기 위해 장이 꼬이지 않도록 하여 복강 내로 다시 넣고, 두 층의 연속 5.0 polyamide 비흡수성 봉합사로 고정합니다. 복부 절개 부위를 봉합합니다.

동물을 가열 램프 아래에 두고 마취에서 회복될 때까지 관찰하십시오. 그 후 마우스를 케이지에 다시 넣고 먹이와 물을 제공하십시오. 다음 날.

마우스를 완전히 마취시킨 후, 머리를 조심스럽게 과신전시키고 뭉툭한 포셉을 사용하여 혀를 잡아당깁니다. 1 mL 주사기에 100 µL 이상의 플루오레세인 표지 덱스트란을 채웁니다. 이를 동맥 카테터에 연결하고, 카테터를 위관으로 사용하여 위장 속으로 조심스럽게 삽입합니다. 100 µL의 FITC 덱스트란을 빠르게 주입한 후 카테터를 제거합니다.

동물이 의식을 회복하도록 하고 90분 동안 기다립니다. 90분이 지난 후, 마우스를 안락사시키고 위에서 직장까지의 전체 위장관을 제거합니다. 장을 폴리스티렌 패드 위에 올리고 잡아늘리지 않도록 주의합니다.

다음으로, 소장과 결장의 전체 길이를 측정합니다. 캐뉼라를 사용하여 장을 폴리스티렌 패드에 고정합니다. 소장은 10개의 동일한 구간으로, 결장은 3개의 동일한 구간으로 나눕니다.

지정된 위치에서 장을 절단한 후, 각 절편을 1 mL의 Krebs-Henseleit bicarbonate buffer(KHB)로 한 번 세척합니다. 절편들을 순차적으로 라벨링된 2 mL 튜브로 옮기고 강하게 볼텍싱한 후 원심 분리합니다. 그 다음, 상층액을 깨끗하고 번호가 매겨진 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

분석 전까지 4°C의 암소에 보관하십시오. 다음으로 피펫을 사용하여, 각 상층액 100 µL씩 두 번을 검은색 96-웰 플레이트에 분주합니다. 매주 동물을 마취시킨 후, 형광 리더기를 사용하여 플레이트를 측정함으로써 대장 통과 시간을 확인합니다.

피스툴라를 삽입하여 결장의 개통성을 주의 깊게 확인합니다. 프로브를 사용하여 항문을 통해 결장 내부로 탐침합니다. 2 mm 유리구슬을 결장 내 3 cm 지점에 삽입하고 프로브를 제거합니다.

즉시 타이머를 시작하십시오. 마우스를 투명 케이지에 넣고 펠릿이 배설될 때까지 걸리는 시간을 측정하십시오. 이는 중간 총 샘플의 조직화학적 분석을 위한 것입니다.

장(bowel)에서 조직 세그먼트를 절단하여 실리콘으로 채워진 디쉬 내의 차가운 KHB에 담근 후, 곤충 핀을 사용하여 장간막(mesentery)을 디쉬에 고정합니다. 장간막 경계를 따라 세그먼트를 절개하고 조직을 길이와 너비의 120%까지 늘립니다. 장간막부터 시작하여 핀으로 조직을 기계적으로 고정합니다.

근육층(muscularis externa) 또는 근층(me)을 점막층(tunica mucosa)에서 분리합니다. 배양을 위해 본 프로토콜의 서면 부분에 따라 샘플을 고정하고 염색합니다. 근층(me).

장 조작 절차 후 24시간이 지나면 소장 전체를 절제하여 페니실린 G와 스트렙토마이신이 포함된 차가운 KHB에 넣습니다. 장을 3cm 길이로 자르고, 미세 가위를 사용하여 각 분절을 실리콘 코팅 유리 접시 위에 고정합니다. 장간막을 제거하고 날카로운 포셉을 사용하여 장을 노딩 니들(nodding needle)에 끼웁니다.

습윤 면봉을 사용하여 조심스럽게 중간층(me)을 절개합니다. 점막하층에서 이를 박리하여 차가운 KHB plus Ps에 넣습니다. 다음으로, 중간층 조각을 2~4mm 길이로 자르고 얼음처럼 차가운 KHB plus PS에서 30분 동안 배양합니다. 시료를 여러 번 세척합니다.

그 다음, 약 50~60 mg의 조직을 500 µL의 DMEM이 담긴 멸균된 24웰 플레이트로 옮깁니다. 조직을 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 상층액을 수집하고 1000 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다.

그 후, 사이토카인 또는 일산화질소 측정을 위해 액체 질소로 급속 냉동합니다. 마지막으로, 깨끗한 페이퍼 티슈로 블롯하여 근육 조직을 30초 동안 건조시킨 후 무게를 잽니다. 수술 후 장마비의 심각성을 평가하는 데 있어 가장 중요한 파라미터는 체내 위장관 통과 시간(GIT)을 검사하는 것입니다.

이 그림은 수술 24시간 후, 처치를 하지 않은 대조군과 장 조작을 가한 마우스의 위장관을 따라 나타나는 FITC dextran의 전형적인 분포를 보여줍니다. 여기에서 보는 바와 같이, 가짜 수술(sham operated) 동물은 계산된 기하학적 중심이 맹장에 위치하는 정상적인 위장관(GIT) 상태를 보였습니다. Im은 근위 공장에서 위장관 통과 시간을 유의하게 지연시킨 반면, 유리 구슬을 이용한 결장 운동성 분석에서는 가짜 수술 마우스가 48~200초 이내에 구슬을 배출한 반면, Im은 염증 정도를 측정했을 때 배출 시간이 470~775초로 연장되었습니다.

ME 내의 백혈구 수치는 여기에서 보이는 바와 같이 조직 화학 또는 면역 조직 화학을 사용하여 분석되었습니다. 대조군 마우스에서는 다형핵 호중구가 거의 관찰되지 않았으나, 소장염은 이들의 강한 침윤을 유도했습니다. 세포에서 방출된 많은 염증 매개체들은 조직 내에서 검출하기 어렵습니다.

용해된 장기 배양물은 배양액 내 염증 마커의 검출을 가능하게 합니다. 상층액에서, POI의 대표적인 매개체는 nitric oxide 또는 주요 억제성 신경전달물질인 no로, 이는 위장관의 주요 억제성 신경전달물질입니다. 이 그림은 me에서 nno가 검출되지 않았음을 보여줍니다.

대조군 장기 배양액, 가짜 수술을 받은 마우스의 상층액에서는 기초 nno 수치가 관찰되었습니다. 하지만, 장 조작을 거친 마우스의 배양액은 24시간 배양 후 유의미하게 더 많은 nno를 생성했습니다. 숙련된 경우, 이러한 장 조작 기술은 적절히 수행된다면 15분 이내에 완료될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 수술 후 장폐색을 유도하는 방법과 그 중증도를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.