Name: 선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 액체 처리 로봇을 활용한 His-태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화 방법을 E. coli에서 단백질을 과발현시키고 자기성 니켈 비즈로 결합시켜 정제하는 이 기술은 재현성을 높이고 인간 오류를 최소화하여 다양한 생화학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 ROJW에 웰컴 프로젝트 기금 (078043/Z/05/Z)에 의해 지원되었다

제 A : 박테리아 문화의 높은 처리량 성장. 1. 24 잘 접시를 사용 Autoinduction 매체 2 ML에서 숙박 박테리아 성장 <ol><li> microwaving하여 24 잘 접시를 Sterilise. </li><li> 갓 성장 박테리아 식민지 또는 냉동 글리세롤 주식과 autoinduction 매체 (숙박 익스프레스 매체)의 1.5 ML의 예방. 우리는 일반적으로 세 개인 복제 식민지와 돌연변이 당 3 우물의 예방. 긍정적이고 부정적인 컨트롤에 대한 예약은 여섯 우물. 긍정적 인 컨트롤을 위해 세 wildtype의 클론을 성장하고 부정적인 컨트롤 우리는 비 표현 플라스미드로 변환 된 두 클론을 성장. 매체 전용 제어를위한 잘 공백을 남겨 판의 충분한 살균이 있는지 확인합니다. </li><li> 37 18 시간 동안 세포를 성장 ° C 및 250 rpm으로 흔들어. 우리는 LAC-inducible BL21 (DE3) 로제 두 셀을 사용합니다. Autoinduction 매체 포도당과 유당의 혼합물을 포함하고 있습니다. 처음에 박테리아또한 재조합 단백질의 표현을 유도 유당을 사용하기 시작 한 후 포도당을 먹이로합니다. </li><li> 뚜껑을 제거하고 로봇 플랫폼에서 판을 놓습니다. </li></ol> 부품 B : 재조합 단백질의 로봇 정화. 2. 로봇 플랫폼을 준비 <ol><li> 20 MM 이미 다졸으로 구성된 세탁 버퍼를 구성, 0.1 % Triton은 X-100, 0.5 M NaCl, 20 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 7.9, 10 MM MgOAc 2, 0.7 MM ZnOAc 2, 10 % 글리세롤, 그리고 용출 버퍼로 구성 0.5 M 이미 다졸의, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 M NaCl, 20 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 7.9, 10 MM MgOAc 2, 0.7 MM ZnOAc 2, 10 % 글리세롤. 이 버퍼는 태그가 단백질이 그들에게 구속 된 후 구슬을 씻으하거나 각각 구슬에서 단백질을 elute하는 데 사용됩니다. </li><li> 세균 희석제 (15 μl antifoam 시약 100 ML 증류수)를 구성합니다. 이 솔루션은 사용됩니다광학 밀도 (A600) 측정을위한 세균 밤 문화의 dilutions을 확인합니다. 희석제의 antifoam의 존재는 플레이트 리더 측정을 방해 하는것 기포의 형성을 방지한다. </li><li> 10X FastBreak 시약, 샘플 당 2 μl lysonase 15 MM MgOAc이 구성된 용해 솔루션을 확인하십시오. FastBreak은 세균 세포 벽을 해제하고 세포 단백질의 출시를 촉진 세제와 소금의 조화가 포함되어 있습니다. Lysonase은 라이소자임 및 nuclease의 독점적 인 혼합이다. 라이소자임은 세포벽을 방해에 지원하고 nuclease가 출시 박테리아 핵산을 소화. </li><li> 선택 사항 : 6 M 구아니딘 히드로 클로라이드 솔루션을 확인하십시오. 일부 재조합 단백질은 테플론 코팅 pipetting 바늘에 충실하는 경향이 있습니다. 구아니딘 히드로 클로라이드 솔루션 denatures 단백질과 정기적으로 각 성 후 빨 로봇 pipetting 팁을 씻어하는 데 사용됩니다 물을보다 더 효율적를 씻어EP. </li><li> 혼합 bicinchoninic 산성 용액 (시약)과 구리 황산염 솔루션 (시약 B)에 의해 BCA (bicinchoninic 산) 단백질 quantitation 시약을 준비 : 펩타이드 채권은 + BCA 시약에있는 CuSO 4 구성 요소에서 잘라 내기 1 잘라 내기 2를 줄일 +된다 잘라 내기 1의 금액 + 솔루션에 존재하는 펩타이드 결합의 수에 비례합니다. 두 번째 단계에서는 bicinchoninic 산 킬레이트 구리 한 두 분자가 + 보라색 색상의 결과, 562 nm의에 흡광도 변화의 결과. 색 반응은 시간 의존하고 일반적으로 확신 할 수 몇 시간이 필요합니다. 그 후 색상은 몇 시간 동안 안정적이다. </li><li> 오른쪽 크기의 골짜기 또는 접시를 입력하고 로봇 플랫폼에서의 사전 할당 된 위치에 배치합니다. </li><li> 구아니딘 히드로 클로라이드의 폐기물 놓으 24 잘 접시, OD 600 흡광도 측정 한 블루 96도 일에 대한 판을위한 두 명확 96 - 웰 플레이트전자 플랫폼에 자신의 위치에서 단백질을 정제. 자기 스탠드에서 한 96 deepwell 판을 놓습니다. </li><li> MagneHis을 희석 니켈 입자 형성하여 단백질을 구속 증류수 5 배와 구슬 - 저어 장치에 그들을 채우기의 그 .. 태그 chelates. 정지에 구슬을 유지하기에 교반기를 전환합니다. </li><li> 로봇 플랫폼에 전환하고 그렇지 않으면 pipetting 정확도에 영향을 것이다 기포를 제거하는 데 몇 분 동안 pipetting 바늘을 플러시. 재사용 가능한 pipetting 바늘은 개별 pipetting 단계 사이에 플러시됩니다. 또한, 일회용 팁을 사용할 수 있습니다. 이후의 모든 단계 robotically 수행하고 있습니다. 로봇 프로토콜 요청하실 수 있습니다. </li></ol> 3. 세포의 성장은 OD600를 측정하여 검사 <ol><li> 밤 문화의 10 μl는 희석제 솔루션의 9​​0 μl에 희석되어 있습니다. </li><li> 박테리아가 비슷한 밀도로 성장했는지 확인하기 위해 OD 600 측정(그림 1). </li></ol> 4. 세포는 단백질을 해제하고 허용하도록 깨진 비드 바인딩 <ol><li> 자기 니켈 구슬 정지의 100 μl는 두 번째 24 잘 플레이트의 각도에 배포됩니다. </li><li> 각 소규모 박테리아 문화를 900 μl은 구슬이 들어있는 24 잘 플레이트로 전송됩니다. 10X FastBreak / lysonase 믹스 100 μl를 추가합니다. </li><li> 24 잘 플레이트는 실온에서 30 분을위한 빠른 진동 (800 RPM)의 흔들림 플랫폼에 전송됩니다. 세균 세포 벽이 기계적 힘과 화학 작업 및 recombinantly 생산 단백질이 솔루션으로 릴리스의 조합에 의해 중단됩니다. 자신의 친 화성 태그 그들은 즉시 상자성체의 킬레이트 화 니켈 구슬을 바인딩합니다. </li></ol> 5. 비즈 씻겨 아르 <ol><li> resuspended 자기 구슬을 포함하는 세포 lysates는 m과 독립에 위치 96 deepwell 판으로 전송됩니다agnetic 막대 그 우물 사이에 슬라이드. 96 - 웰 플레이트는 표면에 뜨는을 쉽게 제거 할 수있는 사각형 콘 모양의 바닥을 얻었습니다. 우물 2.1 ML까지의 볼륨을 수용 할 수 그렇지만 아주 작은 볼륨으로 가득합니다. 이것은 우리가 splashing에 의해 샘플 교차 오염없이 힘차게 흔들어 단계를 수행 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁은 6 M 구아니딘-HCL 개별 pipetting 단계 사이를 세척합니다. 이 단계는 교차 오염을 방지하기 위해 TFIIB 및 기타 &quot;끈적&quot;단백질의 정화에 매우 중요합니다. 다른 단백질과의 pipetting 단계 사이에 물을 광범위하게 주사 바늘을 씻어하기에 충분 수 있습니다. </li><li> 자기 스탠드의 자기로드는 상자성의 구슬을 유치 우물의 중심에서 멀리 당겨하고 pipetting 바늘에게 표면에 뜨는에 무료로 액세스 할 수 있습니다. 표면에 뜨는는 삭제됩니다. </li><li> 세탁 버퍼 500 μl 먼저 24 잘 판에 추가 된 이후 전자에 96 - 웰 플레이트에 전달된다비즈의 전체 전송 nsure. 24 잘 플레이트는 셰이커에서 제거됩니다. </li><li> 세탁 버퍼의 또 다른 500 μl가 96 - 웰 플레이트에 직접 추가, 플레이트 흔드는로 전송하고 힘차게 1 분에 흔들리고 있습니다. 플레이트는 자기 스탠드로 다시 이동하여 세척 버퍼가 삭제됩니다. </li><li> 이 단계를 두 번 반복되고 세척 절차는 접시에서 모든 버퍼 잔해를 제거하여 완료합니다. </li></ol> 6. 용출 버퍼에있는 단백질을 Elute <ol><li> 용출 버퍼 100 μl가 구슬에 추가되고, 플레이트가 흔드는로 옮겨 적극적으로 실온에서 30 분에 흔들리고 있습니다. </li><li> 플레이트는 정화 재조합 단백질을 포함 흔드는 및 eluate로 이동, 새 접시로 전송됩니다. </li></ol> 7. 정화 단백질의 농도를 측정 <ol><li> BCA 시약 믹스의 190 μl은 분명 96 - 웰 플레이트로 옮겨와 프로의 10 μl 수 있습니다tein 솔루션이 추가되었습니다. </li><li> 부화 (일반적으로 5-6 또는 야간)의 몇 시간 후, 흡광도를 측정하고 정화 단백질 준비 (그림 2)의 각각의 농도를 결정하기 위해 BSA 표준에 비교합니다. </li><li> 정화 단백질은 이제 적절한 농도 (그림 3)에서 하류 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 정화 프로토콜은 두 품질 관리 단계, 표시되는의 예제를 제공합니다. 우리는 정화 단백질의 수율 (그림 2) 평가시 세균 성장 단계 (그림 1)에서와 나중에 잠재적 인 문제를 파악하고 문서화 할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 단백질을 정화하고 세중의에서 그들을 테스트합니다. 이것은 두 개의 품질 관리 단계와 함께, 우리가 우리의 기능 assays에서 관찰 된 변화는 돌연변이 phenotyp로 인해 있다는 자신감을 제공합니다전자 (그림 3)이 아닌이 실험 유사 또는 실패 purifications에 의해 발생했습니다. 수율은 50-200 μg에서 일반적으로 범위를 획득하고 다양한 기능 assays에 대한 충분한보다 더 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> 1 그림. 밤 문화가있는 24 잘 접시의 OD 측정 히스토그램.뿐만 아니라 wildtype TFIIB의 등 여섯 TFIIB 돌연변이 변종의 세 가지 클론이 성장하고 있습니다. 매체가 아닌 표현 플라스미드와 잘 들고 두 클론은 부정적인 제어 역할을합니다. OD 측정은 개별 문화 사이의 성장 속도의 작은 변화가 있다는 것을 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> 그림 2. BCA 분석에 의해 결정되며 SDS 페이지로 확인 이러한 문화에서 얻은 단백질 수율이. 변종 중 하나는 높은 수준에서 표현되지 않습니다. co.kr 사이트의그림 1과 bination, 우리는이 차동 세포의 성장으로 인해 아니 였지만 인해 단백질의 발현에 제대로 유도되지 않는 것이 결론 할 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> 그림 3. 전사 검정 대표 결과. 우리는 RNAP의 작은 불완전 성적 증명서의 생산에 TFIIB 변종의 자극 활동을 측정. 여기 TFIIB 잔류 K87의 단일 아미노산 대체의 전체 라이브러리의 자극 효과가 표시됩니다. 재현성의 높은 수준은 작은 오류 속도에 의해 확인된다. wildtype (중량), 음성 제어 (NC) 및 용출 버퍼에 비해 3 개 돌연변이의 성능을 보여주는 샘플 젤은 제어가 아래에 그려져 있습니다.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

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여기에 설명 된 자동 재조합 단백질 정제 방법은 최소한의 인간의 개입과 매우 재현 조건 하에서 소규모 형식의 돌연변이 단백질의 많은 수의 생산 및 정화 할 수 있습니다. 그림 1과 체계적인 품질 관리와의 예제 2 쇼 결과는 단백질을 정제. 그림 3 공연이 예에서 사용되는 정제 된 전사 인자는 기능 assays의 높은 재현 방식으로 수행. 프로 시저가 archaeal TFIIB의 정화하기 위해 개발되었습니다하더라도, 그것은 친화 태그 단백질의 정화에 널리 적용됩니다. 이러한 자동 정화 프로토콜의 사용은 따라서 크게 재조합 단백질의 생화학 분석을 용이하게하고 따라서 수동으로 달성하기 어려운 규모의 단백질 단백질 상호 작용에 대한 우리의 이해를 촉진합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 숙박 익스프레스 인스턴트 TB 매체 </td><td> 머크 화학 (주) </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> FastBreak </td><td> Promega (주) </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase의 Bioprocessing의 시약 / 1 ML </td><td> 머크 화학 (주) </td><td> 71,230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> 시그마 - 알드리치 회사 (주) </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis 니켈 입자 </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> 이미 다졸 </td><td> 시그마 - 알드리치 회사 (주) </td><td> 56,750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma베이스 </td><td> 시그마 - 알드리치 보정어떤 회사 </td><td> 93,362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninic 산성 단백질 결정 </td><td> 시그마 - 알드리치 회사 (주) </td><td> BCA1 - 1KT </td><td></td></tr><tr><td> 깊은 우물을 판 2.2 ML 광장 웰스 PP pk10 </td><td> Anachem (주) </td><td> 1810-00 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate MicroWell 96도 평면 바닥 폴리스티렌은 5 판 명확 0.4 ML 잘 볼륨 128mm의 12 소매 X 86mm 열 과학 Nunc을 치료하지 </td><td> 피셔 과학 (주) </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplate 블루 </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 블​​록 RB (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19,583 </td><td></td></tr><tr><td> 구아니딘 히드로 클로라이드 </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> TheOnyx에 빨 바늘 </td><td> 공문서 송달 GmbH의 </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> 자기 비즈를위한 시약 랙 </td><td> 공문서 송달 GmbH의 </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> 플레이트 리더 시너지 HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> 로봇 플랫폼 TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> 공문서 송달 GmbH의 </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate 쉐이커 Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 자석 타입 </td><td> Qiagen </td><td> 36,915 </td><td></td></tr></tbody></table>

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-선 결정학은 단백질의 구조에 대한 자세한보기를 얻기위한 선택의 방법입니다. 이러한 연구는 구조 / 기능 관계에 대한 상세한 통찰력을 얻기 위해 더 생화학 분석에 의해 보완해야합니다. oligonucleotide와 유전자 합성 기술의 발전은 모두 다른 19 명의 아미노산의 대상 잔류의 대체 등의 증가 가능한 대규모 mutagenesis 전략을합니다. 이득 또는 손실 기능 phenotypes 그런 다음 촉매 활동, 단백질의 안정성 및 / 또는 단백질 단백질 상호 작용 특이성에 특정 잔류의 노​​력으로 체계적인 결론을 도출 할 수 있습니다. 돌연변이의 성격에 다른 phenotypes을 속성에 위해 -보다는 변동 실험 조건 - 이건 제어와 재현 방식으로 단백질을 정화하고 분석하는 매우 중요합니다. 높은 처리량 전략 및 수동 프로토콜의 자동화에로봇 액체 처리 플랫폼은 거의 인간의 개입과 최소한의 오류 속도 1-5과 같은 복잡한 분자 생물 절차를 수행 할 수있는 기회를 마련했습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 방식으로 그의 태그 재조합 단백질의 정화를위한 일반적인 방법을 제시한다. 최근 연구에서, 우리는 TFIIB에 대한 자세한 구조 기능을 조사, 기저 전사 기계의 구성 요소에이 방법을 적용했습니다. TFIIB는 체외에서 발기인 - 이동 스크립트에 불가결하고 preinitiation 복합 6-8로 RNA의 효소의 채용을 위해 필수적입니다. TFIIB는 RNA 중합 효소의 9-11의 분열 활성 사이트를 침투 유연한 링커 도메인이 포함되어 있습니다. 이 링커 도메인 TFIIB, 즉은 (i) 스크립트 개시의 &#39;불완전&#39;단계에서 촉매 활동의 자극에 두 생화학 수량화 활동을 수여하고,에 (II) 추가 기부4,5,12 단지 preinitiation에 RNA 중합 효소의 특정 모집. 우리는 TFIIB 링커에서 싱글, 더블, 트리플 변환과 삭제 변이를 생성하고 이후 RNA의 효소 (4)의 촉매 활동에의 자극 효과에 대한 기능 assays에서 그들을 분석하는 높은 처리량 정화 방법을 악용. 개의 우리가 생성 정화되고 381 돌연변이 분석 - 수동으로 수행 할 시간이 오래 걸릴 힘드는했을거야 작업을. 우리는 생산 우리가 어떤 실험 유사 콘텐츠를 감사 할 수 있으며 우리의 결과의 재현성에 대한 명확한 아이디어를 준 multiplicates에 단백질 as​​sayed. 이 방법은 그의 태그 단백질의 정화에 대한 포괄적 인 프로토콜로 제공되며, 성공적으로 다른 재조합 단백질을 정화하는 데 사용되었습니다. 그것은 현재 24 단백질의 정화에 최적화되어 있지만 최대 96 단백질 정화하도록 구성 할 수 있습니다.

우리는 액체 처리 로봇을 사용하여 재조합 단백질의 친 화성 태그 정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 일반적으로 높은 처리량 형식에 용해 그의 태그 단백질의 작은 규모의 정화에 적용됩니다.

X선 결정학은 단백질 구조의 세부적인 모습을 얻기 위해 선택되는 최적의 방법입니다. 이러한 연구는 다음과 같은 추가적인 ... 연구를 통해 보완될 필요가 있습니다.

본 실험 과정의 목적은 로봇 플랫폼의 자동화 프로토콜을 사용하여 재조합 His-태그 단백질을 고처리량 방식으로 정제하는 것입니다. 이는 먼저 소량 배양을 통해 e coli에서 단백질을 과발현시킴으로써 수행됩니다. 그다음, 세포를 화학적으로 용해하여 단백질을 방출시키고, 방출된 단백질이 자성 니켈 비드에 결합하도록 합니다.그 후, 오염된 단백질을 제거하고 원하는 단백질의 순도를 높이기 위해 비드를 세척합니다. 마지막으로, 자성 비드로부터 단백질을 정제합니다. 최종적으로 BCA 분석과 SDS page를 통해 단백질의 농도와 순도를 확인하고, 추가적인 기능 분석을 통해 단백질의 활성을 측정하여 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 최소한의 개입으로 동일한 조건 하에서 다수의 단백질을 정제할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 높은 재현성을 얻을 수 있으며 인적 오류 또한 최소화할 수 있습니다. 특히 이 방법은 특정 단백질의 수많은 점 돌연변이체를 연구하는 데 매우 유용한데, 이는 단백질 활성의 변동성이 샘플 준비 과정의 차이가 아니라 실제로 돌연변이에 의한 것임을 보장해주기 때문입니다.하룻밤 동안 배양할 박테리아 배양액을 준비하기 위해, 먼저 24-웰 플레이트에 물을 채우고 전자레인지로 2분간 가열하여 멸균합니다. 물을 버리고 플레이트를 다시 2분 동안 전자레인지로 가열합니다. 새로 배양한 유도 불능 BL 21 Rosetta 2 박테리아 콜로니 또는 냉동 글리세롤 스톡을 사용하여, 글루코스와 락토스 혼합물이 포함된 1.5 mL의 자동 유도 배지에 접종합니다. 양성 대조군과 음성 대조군을 위해 각각 3개의 웰을 확보하고, 배지만 포함된 웰 하나를 대조군으로 설정합니다.세포를 37°C에서 18시간 동안 250 RPM으로 배양합니다. 뚜껑을 제거하고 플레이트를 로봇 플랫폼 위에 놓습니다. 플랫폼에는 물체를 한 위치에서 다른 위치로 이동시키는 그리퍼 암(gripper arm), 피펫팅 암, 그리고 쉐이킹 플랫폼, 마그네틱 비드 교반기, 마그네틱 플랫폼을 포함하여 플레이트와 트러프를 위한 다양한 위치가 포함되어 있습니다.96-웰 플레이트의 경우, 증류수 100 milliliters와 소포제 15 microliters를 사용하여 작성된 프로토콜에 따라 정제 과정에 필요한 세척 및 희석 버퍼를 준비합니다. 광학 밀도 측정을 위해 하룻밤 배양한 배양물을 희석할 용액을 준비합니다. Fast break reagent lyase와 아세트산 마그네슘을 포함하는 용해 용액을 만들고, BCA 단백질 분석 용액을 준비합니다.TF two B는 피펫팅 니들에 달라붙는 경향이 있으므로, 니들을 세척하기 위한 6 M 구아니딘 염산염 용액을 준비하십시오. 적절한 버퍼를 담기 위해 적당한 크기의 트로프 또는 플레이트를 채우고, 로봇 플랫폼의 지정된 위치에 배치하십시오. 구아니딘 염산염 폐액용 24웰 플레이트 1개, OD 600 및 흡광도 측정용 투명 96웰 플레이트 2개, 그리고 정제된 단백질용 청색 96웰 플레이트 1개를 배치하십시오.96 딥웰 플레이트 1개를 마그네틱 스탠드 위에 놓습니다. 물을 사용하여 magna hair 니켈 입자를 희석한 후 비드 교반 장치에 추가합니다. 교반기를 켜서 비드가 현탁 상태를 유지하도록 합니다.로봇 플랫폼의 전원을 켜고 피펫팅 니들을 수 분 동안 플러싱합니다. 기포를 제거하기 위해 플레이트를 쉐이킹 플랫폼에 올려두고 밤새 배양한 세포 배양액의 성장을 확인합니다. 각 첨가 단계 사이에 피펫을 세척하면서, 10 µL의 배양액을 90 µL의 희석액에 희석합니다.그 다음, 배양액들이 비슷한 밀도에 도달했을 때 OD 600에서 밀도를 측정합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 자성 니켈 비드 현탁액 100 µL를 옮기고, 단계별로 피펫을 세척하며 각 배양액 900 µL를 웰에 옮깁니다. 그런 다음 fast break Lyase mix 100 µL를 첨가합니다.세포를 용해하고 His-tagged 단백질이 비드에 결합하여 비드를 세척할 수 있도록, 플레이트를 800 RPM의 진동 플랫폼 위에 올려놓고 상온에서 30분 동안 반응시킵니다. 비드를 웰 중심부에서 분리할 수 있는 자석 봉이 달린 스탠드 위의 96-웰 플레이트로 비드를 옮기고, 상층액을 제거한 후 six mo iGuide hydrochloride를 사용하여 피펫 팁을 세척합니다. 다음으로, 24-웰 플레이트의 각 웰에 500 µL의 세척 버퍼를 첨가합니다.웰 플레이트를 준비하고 샘플을 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 상층액을 제거하십시오. 96 웰 플레이트에 500 µL의 세척 버퍼를 추가합니다.웰 플레이트. 플레이트를 쉐이커로 옮겨 1분 동안 강하게 흔들어 줍니다. 그 다음 플레이트를 다시 마그네틱 스탠드로 옮기고, 세척 버퍼를 제거합니다.마지막 세척 후, 비드에 100 µL의 용출 버퍼를 넣고 상온에서 30분 동안 격렬하게 흔들어 줍니다. 그런 다음 용출액을 새 플레이트로 옮깁니다. 단백질 샘플을 정량하기 위해, 투명한 96 웰 플레이트의 각 웰에 190 µL의 BCA 시약을 넣고 10 µL의 단백질 샘플을 각 웰에 추가합니다.시료를 최소 5시간 동안 배양하고, BSA 표준물질 세트를 사용하여 흡광도를 측정합니다. 그 후 단백질을 -80°C에서 보관합니다. 이 정제 프로토콜은 두 단계의 품질 관리 과정을 제공합니다.먼저 세균 성장 단계에서, 이후에는 단백질 수율을 평가할 때 수행합니다. 단백질을 세 번 반복하여 정제함으로써, 기능 분석에서 나타나는 모든 변이가 실험적 오차나 정제 실패가 아니라 돌연변이 표현형으로 인한 것임을 확인할 수 있습니다. 수율은 보통 50에서 200 micrograms 범위이며, 이는 기능 분석을 수행하기에 충분한 양입니다. 기술에 숙달되면 약 3시간 정도 소요되며, 플랫폼 설정, 배양 설정 및 정제된 단백질 수집 외에는 추가로 수행할 작업이 없습니다.이 절차를 마친 후, 기능적 분석을 수행할 수 있습니다. 본 연구의 경우, TF two B의 돌연변이가 ar polymerase의 촉매 활성에 미치는 영향이 어떻게 변화하는지 조사하기 위해 다양한 전사 분석을 진행하였습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

출처: Becker, B. 외 효모에서 리신 독소 A 사슬(RTA) 수송에 필요한 세포 구성 요소를 규명하기 위한 간단한 형광 기반 리포터 검사법. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 니켈 기반 친화성 크로마토그래피를 이용해 폴리히스티딘 표지된 재조합 단백질을 정제하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 초음파 검사를 통한 박테리아 용해, 용해액의 정화 및 여과, 그리고 이미다졸을 이용한 표적 단백질의 선택적 결합 및 용출 등 주요 단계를 설명합니다.

 재조합 박테리아 단백질 정제를 위한 친화 크로마토그래피 기법

이 비디오에서는 클로스트리듐 디피실리 박테리아에서 히스티딘 태그가 지정된 피로포스포키나제 효소를 정제하는 니켈 친화성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하면 크롬노그래피 컬럼을 병렬 친화성 또는 이온 교환 정제를 위한 다중 웰 컬렉션 플레이트와 인터페이스하여 경제적인 높은 처리량 단백질 정제 방법을 제공합니다. 그것은 중력 또는 진공 산출 밀리 그램 양의 단백질을 통해 저렴 한 계측을 통해 사용할 수 있습니다.

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

배우세요 액체 처리 로봇을 활용한 His-태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화 방법을 E. coli에서 단백질을 과발현시키고 자기성 니켈 비즈로 결합시켜 정제하는 이 기술은 재현성을 높이고 인간 오류를 최소화하여 다양한 생화학 연구에 활용할 수 있습니다.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

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