선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

이 절차의 목적은 로봇 플랫폼에서 자동화된 프로토콜을 사용하여 높은 처리량 방식으로 재조합 his 태그가 지정된 단백질을 정제하는 것입니다. 이것은 먼저 소량 배양을 사용하여 대장균의 단백질을 과도하게 발현함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포는 자성 니켈 비드에 결합하는 단백질을 방출하기 위해 화학적으로 거짓말을 합니다.

그런 다음 비드를 세척하여 오염 단백질을 제거하고 원하는 단백질의 순도를 향상시킵니다. 마지막으로, 단백질은 자성 구슬에서 정제됩니다. 궁극적으로 BCA 분석 및 SDS 페이지 및 단백질의 활성을 결정하기 위한 추가 기능 분석을 통해 단백질의 농도와 순도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 이제 최소한의 개입으로 동일한 조건에서 많은 수의 단백질을 정제할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 높은 수준의 재현성을 얻을 수 있으며 인적 오류도 최소화할 수 있습니다. 이제 이 방법은 단백질 활성의 가변성이 실제로 샘플 준비의 차이가 아니라 돌연변이에 기인한다는 것을 보장하기 때문에 특정 단백질의 많은 수의 점 돌연변이를 연구하는 데 특히 유용합니다.

하룻밤 동안 박테리아 배양을 준비하려면 먼저 24개의 웰 플레이트에 물을 채우고 전자레인지에 2분 동안 돌려 나중에 살균합니다. 물을 버리고 갓 자란 부족 유도성, BL 21 Rosetta two, 박테리아 식민지 또는 냉동 글리세롤 스톡을 사용하여 2 분 동안 플레이트를 다시 전자 레인지에 돌리고 포도당과 유당 예비량의 혼합물을 포함하는 자동 유도 배지 1.5 밀리리터를 접종합니다. 양성 및 음성 대조군을 위한 각각 3개의 웰과 매체에서만 하나의 웰. 제어.

섭씨 37도에서 18시간 동안 250RPM으로 세포를 성장시킵니다. 뚜껑을 제거하고 플레이트를 로봇 플랫폼에 놓습니다. 플랫폼에는 물체를 한 위치에서 다른 위치로 이동시키기 위한 그리퍼 암, 피펫팅 암 및 쉐이킹 플랫폼, 마그네틱 비드 교반 및 마그네틱 플랫폼을 포함한 플레이트와 트로프를 위한 다양한 위치가 포함되어 있습니다.

96웰 플레이트의 경우 100ml의 증류수와 15마이크로리터의 거품 방지 시약을 사용하여 서면 프로토콜에 따라 정제 절차를 위한 세척 및 희석 버퍼를 준비합니다. 광학 밀도 측정을 위해 야간 배양을 희석하기 위한 용액을 준비합니다. fast break 시약 lyase와 마그네슘 아세테이트를 함유 한 lysis 용액을 만들고 BCA 단백질 분석 용액을 준비합니다.

TF two B는 피펫팅 바늘에 달라붙는 경향이 있으므로 세척을 위해 six Molo Guine hydrochloride 용액을 준비합니다. 적절한 버퍼에 적합한 크기의 트러프 또는 플레이트를 채우고 로봇 플랫폼의 사전 할당된 위치, 플랫폼의 해당 위치에 배치합니다. 구아닌 염산염 폐기물을 위한 1개의 24웰 플레이트, OD 600 및 흡광도 측정을 위한 2개의 투명 96웰 플레이트, 정제된 단백질을 위한 1개의 파란색 96웰 플레이트를 배치합니다.

마그네틱 스탠드에 1 96 딥 웰 플레이트를 놓습니다. 물을 사용하여 마그나 헤어 니켈 입자를 희석하고 비드 응시 장치에 추가합니다. 비드를 현탁 상태로 유지하기 위해 교반을 켭니다.

로봇 플랫폼을 켜고 몇 분 동안 피펫팅 바늘을 세척합니다. 기포를 제거하려면 플레이트를 흔들리는 플랫폼에 올려 놓고 밤새 세포 배양의 성장을 확인합니다. 10마이크로리터의 배양액을 90마이크로리터의 희석액에 희석하면서 첨가물 사이에 피펫을 세척합니다.

그런 다음 배양물이 유사한 밀도에 도달했을 때 OD 600에서 밀도를 측정합니다. 100마이크로리터의 마그네틱 니켈 비드 현탁액을 24웰 플레이트의 웰로 옮기고, 각 배양액 900마이크로리터를 웰로 옮기고, 단계 사이에 피펫을 세척합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 빠른 브레이크 Lyase 믹스를 추가합니다.

실온에서 800분 동안 800RPM으로 진탕 플랫폼에 플레이트를 놓아 세포가 용해되고 태그가 지정된 단백질이 비드에 결합하여 비드를 세척할 수 있도록 합니다. 비드를 웰 중앙에서 멀어지게 하는 마그네틱 로드가 있는 스탠드의 96웰 플레이트로 옮기고, supinate를 버리고 6mo iGuide 염산염을 사용하여 피펫 팁을 세척합니다. 다음으로, 500 마이크로 리터의 세척 버퍼를 24의 우물에 추가합니다.

웰 플레이트를 만들고 샘플을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 supinate를 제거하십시오. 500마이크로리터의 세척 버퍼를 96에 추가합니다.

웰 플레이트. 접시를 셰이커에 옮기고 1분 동안 접시를 세게 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 마그네틱 스탠드로 다시 옮기고 세탁 버퍼를 제거합니다.

최종 세척 후 비드에 100마이크로리터의 용리 완충액을 넣고 실온에서 30분 동안 세게 흔듭니다. 그런 다음 용리액을 새 플레이트로 옮깁니다. 단백질 샘플을 정량화하려면 투명한 96 웰 플레이트의 웰에 190 마이크로리터의 BCA 시약을 추가하고 10 마이크로리터의 단백질 샘플을 웰에 추가합니다.

샘플을 최소 5시간 동안 배양하고 일련의 BSA 표준물질로 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 단백질은 섭씨 영하 80도에서 보관됩니다. 정제 프로토콜은 두 가지 품질 관리 단계를 제공합니다.

처음에는 박테리아 성장 단계에서, 나중에는 단백질 수율을 평가할 때. 단백질을 3회에 걸쳐 정제함으로써, 기능적 분석의 모든 변화는 돌연변이 표현형에 기인하며 실험적 변이 또는 정제 실패에 의한 것이 아님을 확인할 수 있습니다.수율은 일반적으로 50 - 200마이크로그램 범위이며 기능 분석에 충분합니다. 한 번 마스터하면 이 기술은 약 3시간 밖에 걸리지 않으며 플랫폼을 설정하고 배양을 설정한 다음 정제된 단백질을 수집하는 것 외에는 다른 작업을 수행해야 하는 것이 없습니다.

이 절차에 따라 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 우리의 경우, TF two B의 돌연변이가 ar 중합효소의 촉매 활성에 미치는 영향을 어떻게 변경하는지 조사하기 위한 다양한 전사 분석이 될 것입니다.