미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

이 영상의 목적은 마우스 심장에서 분리한 미토콘드리아의 미토콘드리아 투과성 전이 공극(mitochondrial permeability transition pore)의 특성을 분석하는 절차를 설명하는 것입니다. 먼저, 마우스 심장에서 미토콘드리아를 분리합니다.

차등 원심분리법을 사용하여 분리한 미토콘드리아의 품질은 컴퓨터에 연결된 산소 전극을 사용하여 호흡 조절 비율을 측정하고 미토콘드리아 막의 무결성을 평가함으로써 분석합니다. 이후 분광 형광 측정 장비를 사용하여 칼슘 처리, 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 부피를 동시에 측정하여 투과성 전이 공극의 개방 여부를 결정합니다.

결과 데이터는 칼슘 유지 능력과 미토콘드리아 투과성 전이의 차이를 보여주었습니다. 분리된 미토콘드리아의 낮은 민감도, 미토콘드리아 투과성 전이 공극의 개방은 미토콘드리아 생리학 및 해부학의 여러 수준에서 변화를 수반하는 복잡한 현상입니다.

이 기술이 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 여러 파라미터를 동시에 측정함으로써 칼슘, 이동 또는 팽창과 같은 개별 파라미터만을 측정했을 때보다 현상에 대해 더 종합적인 정보를 제공한다는 점입니다. 절차를 시작하기 전, 미토콘드리아 분리 완충액을 해동하고 pH가 7.4인지 확인하십시오. 그 후 사용할 모든 완충액, 디쉬 및 튜브를 얼음 위에 놓으십시오. 미토콘드리아 분리 프로토콜의 모든 단계는 반드시 얼음 위에서 수행되어야 함에 유의하십시오.

안락사시킨 마우스의 심장을 페트리 접시에 놓고 차가운 mitochondria isolation buffer로 혈액을 씻어냅니다. 다음으로, 칼날을 사용하여 심장을 새 페트리 접시로 옮긴 후 지방과 심방을 제거하고, 균질한 상태가 될 때까지 심장을 잘게 다집니다.

다진 심장을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 0.1 milligram per milliliter trypsin이 포함된 미토콘드리아 분리 완충액 10 milliliters를 첨가하고, 시료를 얼음 위에서 10분 동안 소화시킵니다. trypsin을 사용하면 분리된 미토콘드리아의 수득률이 증가하며, 미토콘드리아 준비 과정 전반에 걸쳐 이를 일정하게 유지해야 함에 유의하십시오.

하지만, 효소가 이온에 영향을 주지 않는지 확인하기 위해 트립신 없이 얻은 표본으로 분리된 미토콘드리아의 기능을 테스트하는 것을 권장합니다. 배양 후, 0.1% 지방산 제거 BS, a 및 5 mg의 트립신 억제제가 포함된 미토콘드리아 분리 버퍼 10 mL를 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다. 트립신을 중화시키기 위해, 4 °C에서 1분 동안 저속 또는 중속 원심분리로 소화된 조직을 회수합니다.

원심분리 후 침전물을 0.1% 지방산 제거 BSA가 포함된 미토콘드리아 분리 완충액 8 mL에 현탁하고, 샘플을 얼음 위에 유지합니다. 테플론 페스틀이 장착된 전동식 Dounce 균질기를 사용하여 1,200~1,400 RPM에서 4~6회 통과시켜 샘플을 균질화합니다. 균질액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4 °C에서 800 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

핵과 조직 파편을 펠릿화하기 위해서입니다. 원심분리 후, 미토콘드리아가 포함된 상층액을 마이크로 원심분리 튜브에 회수하고 4 °C에서 8,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 펠릿 상단에 흰색 층이 형성됩니다.

진공 시스템을 사용하여 미토콘드리아 펠릿 위의 흰색 층을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 미토콘드리아가 포함된 나머지 어두운 색의 펠릿을 1 mL의 미토콘드리아 분리 완충액에 다시 현탁합니다.

다음으로 미토콘드리아를 4°C에서 8,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액은 제거하고 미토콘드리아 펠렛을 150 µL의 미토콘드리아 분리 완충액에 재현탁한 후, 미토콘드리아를 얼음 위에 보관하십시오.

분리된 미토콘드리아의 호흡은 컴퓨터에 연결되고 oxy. The plus 소프트웨어로 제어되는 oxy thermal 산소 전극을 사용하여 측정합니다. 산소 전극은 실험 당일에 보정해야 합니다. 최종 농도가 1 µM인 rotenone이 포함된 미토콘드리아 호흡 완충액 2 mL를 oxy 챔버에 넣고, 챔버를 밀봉한 뒤 산소 신호 기록을 시작합니다.

시스템에 의해 기록되어 컴퓨터 화면에 표시되는 신호는 oxy therm 챔버 내의 산소 농도에 비례합니다. 산소 신호가 안정되면, 250 µg의 미토콘드리아를 첨가하고 1분 동안 기저 호흡을 기록합니다. 이 시점의 호흡은 미토콘드리아가 내인성 기질로 호흡하고 있기 때문에 매우 낮아야 합니다.

이것은 상태 1 호흡입니다. 복합체 II에서 미토콘드리아 호흡을 개시하기 위해 succinate를 최종 농도 5 mM이 되도록 첨가하고 1분 동안 신호를 기록하십시오. 상태 2 호흡 동안 산소 소비량이 증가해야 합니다.

상태 호흡을 유도하려면 DP를 최종 농도 150 micromolar가 되도록 첨가하십시오. 이 시점에서 산화적 인산화를 통한 TP 합성으로 인해 산소 소비량이 증가해야 합니다. DP 소비 및 상태 4 호흡 기록으로의 전환을 나타내는 호흡 속도 저하가 관찰될 때까지 신호를 기록하십시오.

네 번째 단계로, 최소 1분 동안 호흡을 측정합니다. 최종 농도가 1 µM이 되도록 CCCP를 첨가하고 1분 동안 신호를 기록합니다. 이 시점에서 비결합 호흡(uncoupled respiration)은 최대치가 되어야 합니다.

상태 3 호흡 동안의 산소 소비율을 상태 4 호흡 동안의 산소 소비율로 나누어 호흡 조절 지수(RCR)를 계산하십시오. 목표 RCR은 4보다 커야 합니다. 다음으로, 미토콘드리아 막의 무결성을 평가하기 위해, 새로운 미토콘드리아 시료에 DP를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하여 상태 3 호흡을 유도하십시오.

그 다음 1분 동안 산소 소비량을 기록하고, 10 µM cytochrome C를 첨가한 후 2~3분 동안 산소 소비량을 기록합니다. 상태가 좋은 미토콘드리아 표본의 경우, 온전한 미토콘드리아 막은 cytochrome C를 투과시키지 않으므로 호흡량이 증가하지 않거나 매우 적게 증가합니다. 호흡량이 증가한다는 것은 미토콘드리아 막이 파손되었거나 손상되었음을 나타냅니다.

미토콘드리아 투과성 전이 공(mitochondrial permeability transition pore) 개방의 다중 파라미터 측정을 위한 기기 구성은 Felix GX 프로그램으로 제어되는 컴퓨터 기반의 quantum master dual emission spectro fluorimeter로 이루어집니다. Felix GX 프로그램을 사용하여 다중 검출 획득 프로토콜을 생성하고, ratiometric 염료인 Forer와 JC-1을 이용한 칼슘, 미토콘드리아 막 전위 및 팽창 측정 파라미터를 입력하십시오. Forer ratio와 JC-1 ratio에 대한 유도 트레이스를 생성하십시오. 일회용 4면 meth ACRL vete에 최종 농도가 1 µM rotenone, 5 mM succinate 및 800 nM인 미토콘드리아 분석 버퍼 1 mL를 혼합하십시오. FF의 경우, 미토콘드리아 250 µg을 첨가하고 샘플을 spectro fluorimeter의 샘플 챔버에 넣으십시오.

1분 후에 형광 신호 기록을 시작하고, 획득을 일시 중지한 뒤 500 nanomolar JC-1을 첨가하고 다시 획득을 시작하십시오. JC-1 비율 신호가 증가하는 것은 활성 미토콘드리아에 의한 염료 섭취를 나타냅니다. JC-1 신호가 평탄기에 도달할 때까지 기록을 계속하십시오.

보통 5분 이내에 calcium chloride를 최종 농도 20 micromolar가 되도록 첨가합니다. 그러면 assay buffer 내의 칼슘 농도 증가를 나타내는 Fluor FF ratio 신호의 즉각적인 증가가 관찰되어야 하며, 이후 미토콘드리아의 칼슘 흡수로 인해 점진적으로 감소합니다. JC one ratio 신호는 미토콘드리아 막 전위의 약간의 탈분극을 나타내는 짧고 일시적인 감소를 보여야 합니다.

추가로 20 µM의 염화칼슘을 처리한 후, 일반적으로 1~1.5분 이내에 ER FF ratio 신호가 기저 수준으로 돌아오면, 미토콘드리아가 칼슘을 더 이상 축적하지 못하고 분석 버퍼로 칼슘을 방출하기 시작할 때까지 일정한 간격으로 펄스 처리를 계속합니다. 미토콘드리아 투과성 전이공의 개방은 칼슘 방출로 인한 URA FF ratio 신호의 동시 증가로 시각화됩니다. C56BL/6J 마우스에서 분리한 미토콘드리아의 막 전위 붕괴로 인한 JC-1 신호 비율의 감소와 미토콘드리아 팽창으로 인한 빛 산란의 감소가 관찰됩니다.

본 영상에서 보여주는 바와 같이, succinate와 ADP가 존재하는 상태 3 호흡(state three respiration) 동안의 산소 소비량을 측정하고, 이어서 ADP 소비 후의 상태 4 호흡(state four respiration) 동안의 산소 소비량을 측정합니다. 여기서 보는 것처럼, ADP 첨가는 산화적 인산화로 인해 산소 소비량을 증가시키며 이후 산소 소비 속도는 느려집니다. 모든 ADP가 소비되면, CCCP 첨가를 통해 분리된 미토콘드리아의 언커플링(uncoupling) 반응을 측정합니다. 분리된 미토콘드리아의 막 무결성을 평가하기 위해, CCCP 존재 하에서의 산소 소비 속도가 상태 3 호흡 때보다 더 높게 나타나는지 확인합니다.

산소 소비량은 succinate와 a DP가 존재하는 상태에서 측정하였으며, 이후 cytochrome C를 추가하여 측정하였습니다. 여기서 볼 수 있듯이, cytochrome C의 추가는 a DP 및 succinate 상태와 비교하여 산소 소비량을 유의하게 증가시키지 않았으며, 이는 손상되지 않은 미토콘드리아 막이 cytochrome C에 대해 투과성이 없음을 나타냅니다. 미토콘드리아 투과성 전이를 평가하기 위해, 분리된 심장 미토콘드리아의 poor opening을 미토콘드리아 칼슘 보유 용량의 지표로 사용하였습니다. 미토콘드리아 투과성 전이. Poor opening은 20 micromolar를 순차적으로 추가하여 유도하였습니다.

염화 칼슘, 미토콘드리아 외 칼슘 및 막 전위는 비율 측정 지표로 측정되었습니다. 녹색 추적으로 표시된 URA FF와 적색 추적으로 표시된 JC-1을 사용하였으며, 미토콘드리아의 팽창은 525 nm에서 광산란을 기록하여 측정하였고 이는 흑색 추적으로 나타나 있습니다. JC-1 및 팽창 신호의 특이성은 1 µM의 CCCP와 5 µg/mL의 미생물 독소 ethin으로 테스트하였으며, 여기서 볼 수 있듯이 미토콘드리아의 칼슘 흡수는 미토콘드리아 막의 약간의 탈분극을 동반합니다.

4회의 칼슘 펄스 이후, 미토콘드리아 투과성 전이공(mitochondrial permeability transition pore)의 개방은 칼슘 방출을 나타내는 URA FF의 증가로 확인됩니다. 또한, 막 전위 붕괴를 나타내는 JC-1의 감소와 미토콘드리아 기질 부피의 증가가 관찰되며, 이는 팽윤의 표지자인 빛 산란의 감소로 나타나 미토콘드리아 투과성 전이공 개방의 특이성을 검증합니다. 동일한 측정이 미토콘드리아 투과성 전이공 구성 성분인 cyclophilin D에 결합하는 cyclosporine A 존재 하에 수행되었습니다. 이 그림에서 보듯이, 1 µM의 cyclosporine A가 존재할 때 대조군 샘플과 비교하여 미토콘드리아 투과성 전이공을 개방하는 데 필요한 calcium chloride 펄스의 수가 증가합니다.

이 영상을 시청하신 후, 분리된 심장 미토콘드리아에서 미토콘드리아 투과성 전이 공극의 개방을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 고품질의 분리된 미토콘드리아를 얻는 것입니다. 따라서 미토콘드리아를 추가 실험에 사용하기 전에 품질 관리 측정을 수행하는 것이 중요합니다.