미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정
September 7th, 2012
미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을 포함 2 + 처리, mitochondrial 막 잠재력과 mitochondrial 볼륨입니다. 미토콘드리아 높은 품질과 기능 마음을 얻기위한 절차도 설명되어 있습니다.
이 비디오의 목적은 미토콘드리아 투과성 전이를 특성화하는 절차를 설명하는 것입니다. 미토콘드리아의 개방 불량, 쥐의 심장과 분리됨. 첫째, 미토콘드리아는 쥐의 심장에서 분리되어 있습니다.
차등 원심분리 방법을 사용하여 컴퓨터에 연결된 산소 열 산소 전극을 사용하여 분리된 미토콘드리아의 품질을 평가하여 호흡 조절 비율을 측정하고 미토콘드리아 막의 무결성을 평가합니다. 그런 다음 스펙트럼 형광 측정 기기를 사용하여 칼슘 처리, 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 부피를 동시에 측정하여 투과성 전이를 결정합니다. 오프닝이 좋지 않습니다.
결과 데이터는 칼슘 보유 능력과 미토콘드리아 투과성 전이의 차이를 보여주었습니다. 고립된 미토콘드리아의 민감도 저하, 미토콘드리아 투과성 전이의 개방. 모공은 미토콘드리아 생리학 및 해부학의 여러 수준에서 변화를 포함하는 복잡한 현상입니다.
기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 여러 매개변수를 동시에 측정하면 칼슘, 동원 또는 팽창과 같은 개별 매개변수만 측정하는 것보다 현상에 대한 보다 포괄적인 그림을 제공한다는 것입니다.절차를 시작하기 전에 미토콘드리아 분리 완충액을 해동하고 pH(7.4)를 확인합니다. 그런 다음 얼음에 사용할 모든 버퍼, 접시 및 튜브를 놓습니다. 미토콘드리아 분리 프로토콜의 모든 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
안락사된 쥐의 심장을 페트리 접시에 놓고 차가운 미토콘드리아로 피를 헹굽니다. 격리 버퍼. 다음으로, 칼날을 사용하여 심장을 새 페트리 접시로 옮기고 지방과 심방을 제거한 다음 균일한 제품을 얻을 때까지 심장을 다집니다.
다진 심장을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 10ml의 미토콘드리아 분리 완충액과 0.1mg/밀리리터 트립신을 추가하고 샘플이 얼음 위에서 10분 동안 소화되도록 합니다. 트립신을 사용하면 분리된 미토콘드리아의 수율이 증가하며 미토콘드리아 제제 사이에 일정하게 유지되어야 합니다.
그러나 효소가 이온을 방해하지 않는지 확인하기 위해 트립신이 없는 상태에서 얻은 제제에서 분리된 미토콘드리아의 기능을 테스트하는 것이 좋습니다. 배양 후 0.1% 무지방산, BS, a, 5밀리그램의 트립신 억제제가 함유된 미토콘드리아 분리 완충액 10ml를 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하여 트립신을 중화시키고 소화된 조직을 저속에서 중속으로 회복합니다. 섭씨 4도의 1분 동안 원심분리.
스핀 Resus 후 0.1% 지방산이 없는 BSA가 있는 8ml의 미토콘드리아 분리 완충액에 조직을 현탁시켜 샘플을 얼음 위에 유지합니다. 테프론 유봉이 있는 전동 댄스 균질화기를 사용하여 1, 200에서 1, 400RPM으로 4-6개의 패스로 샘플을 균질화합니다. 균질산염을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 800배 G로 원심분리합니다.
핵과 조직 파편을 펠릿으로 만들기 위해. 스핀 후 미토콘드리아를 포함하는 supinate를 마이크로 원심 분리기 튜브로 회수하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 8, 000 회 G로 원심 분리합니다. 스핀 후 펠릿 위에는 흰색 층이 있습니다.
진공 시스템을 사용하여 미토콘드리아 펠릿 상단의 흰색 층을 조심스럽게 흡인하고 제거합니다. 그런 다음 1밀리리터의 미토콘드리아에 미토콘드리아를 포함하는 나머지 더 어두운 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 격리 버퍼.
다음으로 미토콘드리아를 8, 000 번 G에서 섭씨 4도의 10 분 동안 원심 분리하십시오. supinate를 버리고 미토콘드리아 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 150마이크로리터의 미토콘드리아에서 분리 완충액은 미토콘드리아를 얼음 위에 유지합니다.
분리된 미토콘드리아의 호흡은 컴퓨터에 연결된 산소 열 산소 전극으로 측정하고 산소로 제어합니다. 플러스 소프트웨어, 산소 전극은 실험 당일에 보정해야 합니다. 1마이크로몰 로테논의 최종 농도를 포함하는 2밀리리터 미토콘드리아 호흡 완충액을 산소 챔버에 추가하고 챔버를 밀봉하고 산소 신호 기록을 시작합니다.
시스템에 의해 기록되고 컴퓨터 화면에 표시되는 신호는 산소 챔버의 산소 농도에 비례합니다. 산소 신호가 안정되면 250마이크로그램의 미토콘드리아를 추가하고 1분 동안 기저 호흡을 기록합니다. 이 시점의 호흡은 미토콘드리아가 내인성 기질에서 흡인하기 때문에 매우 낮아야 합니다.
이것은 상태 1 호흡입니다. 최종 농도인 5밀리몰에 석시네이트를 첨가하여 복합체 2에서 미토콘드리아 호흡을 시작하고 1분 동안 신호를 기록합니다. 산소 소비량은 2차 호흡 동안 증가해야 합니다.
상태 호흡을 유도하려면 최종 농도인 150마이크로몰에 DP를 추가합니다. 이 시점에서 산화적 인산화를 통한 TP 합성으로 인해 산소 소비가 증가해야 합니다. 호흡이 느려질 때까지 신호를 기록하여 DP 소모를 나타내고 상태 4 호흡 기록으로 전환합니다.
상태 4, 최소 1분 동안 호흡합니다. CCCP를 1마이크로몰의 최종 농도에 추가하고 1분 동안 신호를 기록합니다. 이 시점에서는 비결합 호흡이 최대가 되어야 합니다.
상태 3 동안의 산소 소비율을 나누어 호흡 조절 비율을 계산합니다. 상태 4 동안의 산소 소비율에 의한 호흡, 호흡 목표 RCR은 4보다 커야 합니다. 다음으로, 미토콘드리아 막의 무결성을 평가하기 위해 최종 농도인 1밀리몰에 DP를 추가하여 새로운 미토콘드리아 샘플에서 3회 호흡 상태를 유도합니다.
그런 다음 1분 동안 산소 소비량을 기록하고 10마이크로몰 시토크롬 C를 첨가한 다음 2-3분 동안 산소 소비량을 기록합니다. 사이토크롬 C는 좋은 미토콘드리아 제제에서 온전한 미토콘드리아 막을 투과할 수 없기 때문에 호흡이 증가하거나 매우 미미하게 증가하지 않습니다. 호흡이 증가하면 미토콘드리아 막이 파손되거나 손상되었음을 나타냅니다.
미토콘드리아 투과성 전이 포트 개구부의 다중 매개변수 측정을 위한 기기는 Felix GX 프로그램에 의해 제어되는 양자 마스터 이중 방출 분광 형광계 컴퓨터로 구성됩니다. Felix GX 프로그램을 사용하여 멀티디 수집 프로토콜을 생성하고 비율 메트릭 염료에 대한 칼슘 미토콘드리아 막 전위 및 팽창 측정을 위한 매개변수를 입력하고, Forer 및 JC one은 일회용 4면 메스에서 비율 및 JC 1 비율에 대한 파생된 미량을 생성하고, ACRL vete mix는 1 밀리리터 미토콘드리아 분석 버퍼와 1 마이크로몰 로테논의 최종 농도를 혼합하고, 5 밀리 몰 숙시 네이트 및 800 나노 몰. FF의 경우 250마이크로그램의 미토콘드리아를 추가하고 샘플을 분광 형광계의 샘플 격실에 넣습니다.
1분 후에 형광 신호 기록을 시작하고, 획득을 일시 중지하고, 500나노몰 JC 1을 추가한 다음 수집을 다시 시작합니다. JC 1 비율 신호는 활성 미토콘드리아에 의한 다이 흡수를 나타내는 증가해야 합니다. JC one 신호가 고원에 도달할 때까지 계속 녹음합니다.
보통 5분 이내에 염화칼슘을 최종 농도인 20마이크로몰까지 첨가합니다. Fluor FF 비율 신호의 순간적인 증가는 분석 완충액에 칼슘의 존재가 증가한 후 미토콘드리아 칼슘 흡수로 인한 점진적인 감소를 나타내는 것으로 보여야 합니다. JC 1 비율 신호는 약간의 미토콘드리아 막 탈분극을 나타내는 짧은 일시적인 감소를 나타내야 합니다.
ER FF 비율 신호가 일반적으로 20마이크로몰의 다른 염화칼슘에서 1분에서 1.5분 이내에 기저 수준으로 돌아오면 미토콘드리아가 칼슘을 축적할 수 없고 칼슘을 분석 완충액으로 방출하기 시작할 때까지 고정된 간격으로 펄스를 계속합니다. 미토콘드리아 투과성 전이 포트 개방은 칼슘 방출로 인한 URA FF 비율 신호의 동시 증가에 의해 시각화됩니다. C 56 black six J 마우스에서 분리된 동안 막 전위 붕괴로 인한 JC one 신호 비율의 감소 및 미토콘드리아 팽창 미토콘드리아로 인한 광 산란의 감소.
이 비디오에서 볼 수 있듯이, 산소 소비량은 숙시네이트와 DP가 있는 상태에서 상태 3 호흡 동안과 DP 소비 후 상태 4 호흡 동안 측정되었으며, 여기에 표시된 바와 같이 DP 첨가는 산화적 인산화로 인해 산소 소비량을 증가시키고 산소 소비는 느려집니다. 모든 DP가 소모되면 분리에 대한 분리된 미토콘드리아의 반응은 CCCP가 있는 상태에서 CCCP를 추가하여 측정합니다. 산소 소비율은 고립된 미토콘드리아의 막 무결성을 평가하기 위해 상태 3 호흡 동안보다 높습니다.
산소 소비량은 석시네이트 및 DP의 존재 하에서 측정되었으며, 여기에서 볼 수 있는 시토크롬 C.As 의 첨가 후, 시토크롬 C의 첨가는 DP와 관련하여 산소 소비량을 크게 증가시키지 않으며, 온전한 미토콘드리아 막이 시토크롬 C에 투과되지 않음을 나타내는 석시네이트는 미토콘드리아 투과성 전이를 평가하기 위해 미토콘드리아 투과성 전이, 미토콘드리아 칼슘 보유 능력의 지표로서 고립된 심장 미토콘드리아의 개방 불량을 나타냅니다. 미토콘드리아 투과성 전이. 불량한 개방은 20 마이크로몰의 순차적 첨가에 의해 유발되었습니다.
염화칼슘, 여분의 미토콘드리아 칼슘 및 막 전위는 비율 메트릭 지표로 측정되었습니다. 녹색 흔적으로 표시된 URA FF와 미토콘드리아의 팽창을 빨간색으로 표시된 JC는 검은색 흔적으로 표시된 525나노미터에서 광 산란을 기록하여 측정했습니다. JC 1 및 팽창 신호의 특이성은 여기에서 볼 수 있듯이 1개의 마이크로몰, CCCP 및 밀리리터당 5마이크로그램의 미생물 독소 에틴으로 테스트되었으며, 미토콘드리아에 의한 칼슘 흡수는 미토콘드리아 막의 약간의 탈분극을 동반합니다.
4번의 칼슘 펄스 후 미토콘드리아 투과성 전이 풀 개방은 칼슘 방출을 나타내는 URA FF의 증가로 간주됩니다. JC one의 감소는 막 전위 붕괴 및 미토콘드리아 기질 부피의 증가를 나타내며, 이는 미토콘드리아 투과성 전이 포트 개방의 특이성을 확인하기 위한 팽창의 마커로서 광 산란의 감소로 간주됩니다. 이 그림에 표시된 D.As 미토콘드리아 투과성 전이 PO 성분인 cyclo fillin 에 결합하는 cyclosporine A의 존재 하에서 동일한 측정이 수행되었으며, 1개의 마이크로몰 시추공 A의 존재는 대조군 샘플에 비해 미토콘드리아 투과성 전이 PO를 여는 데 필요한 염화칼슘 펄스의 수를 증가시킵니다.
이 비디오를 시청한 후에는 고립된 심장 미토콘드리아에서 미토콘드리아 투과성 전이 포트의 개방을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 양질의 분리된 미토콘드리아를 얻는 것입니다. 따라서 추가 실험을 위해 미토콘드리아를 사용하기 전에 품질 관리 측정을 수행하는 것이 중요합니다.
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개요
이 기사는 분리된 마우스 심장 미토콘드리아에서 미토콘드리아 투과성 전이 공의 개방을 측정하기 위한 분광형광 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법을 통해 미토콘드리아 Ca2+ 처리, 미토콘드리아 막 전위, 및 미토콘드리아 부피를 동시에 측정할 수 있습니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 미토콘드리아 생리학
배경
- 미토콘드리아 투과성 전이는 세포 생존에 중요합니다.
- 미토콘드리아 기능을 이해하면 다양한 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
- 마우스 심장에서 분리된 미토콘드리아는 이러한 과정을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다.
- 미토콘드리아 무결성을 평가하는 것은 정확한 실험 결과를 위해 필수적입니다.
연구 목적
- 분리된 마우스 심장 미토콘드리아에서 미토콘드리아 투과성 전이를 특성화합니다.
- 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발합니다.
- 미토콘드리아 건강에 대한 칼슘 처리의 영향을 평가합니다.
사용된 방법
- 차등 원심분리를 사용한 미토콘드리아 분리.
- 산소 열 산소 전극을 사용한 미토콘드리아 품질 평가.
- 막 무결성을 평가하기 위한 호흡 조절 비율 측정.
- 칼슘 처리, 막 전위 및 부피의 동시 분광형광 측정.
주요 결과
- 마우스 심장에서 기능성 미토콘드리아의 성공적인 분리.
- 미토콘드리아 투과성 전이를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법의 확립.
- 칼슘 처리와 미토콘드리아 기능 사이의 관계 시연.
- 미토콘드리아 건강 및 질병의 기반이 되는 메커니즘에 대한 통찰력.
결론
- 개발된 프로토콜은 미토콘드리아 투과성 전이를 연구하는 데 효과적입니다.
- 이러한 메커니즘을 이해하면 치료 전략 개발에 도움이 될 수 있습니다.
- 이 방법은 미토콘드리아 생물학에 대한 추가 연구에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) opening provides mechanistic insight into mitochondrial dysfunction linked to neurodegenerative, metabolic, and cardiovascular diseases. Simultaneous multi-parameter measurement of calcium handling, membrane potential, and volume enables predictive de-risking of target engagement in early discovery by clarifying pathophysiological pathways. This assay supports target validation and assay development by delivering quantitative, reproducible readouts that inform go/no-go decisions in preclinical portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking calcium-induced mtPTP opening to mitochondrial depolarization and swelling, clarifying mechanisms of cell death pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through dose-response analysis of modulators like cyclosporine A, which shifts calcium retention capacity thresholds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated mitochondrial systems for compound screening by confirming integrity via respiratory control ratio and cytochrome C impermeability.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs—Ca2+ flux (Fura FF ratio), membrane potential (JC-1 ratio), and volume (light scattering)—enabling reproducible assay performance across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking mtPTP dysregulation to bioenergetic failure and redox signaling in cardiac and neuronal contexts.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from isolated mitochondria to tissue-level functional assessments through conserved permeability transition mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanistic de-risking data after target identification and before lead optimization, particularly for compounds modulating mitochondrial homeostasis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving whether test compounds inhibit or exacerbate calcium-induced mtPTP opening through concurrent parameter tracking.
- Screening: Enables assay readiness by requiring isolated mitochondria with RCR >4 and intact membranes, ensuring reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates ratiometric and light-scattering readouts that allow direct comparison of mitochondrial states under varying calcium loads and pharmacological interventions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling permeability transition mechanisms relevant to ischemia-reperfusion injury and excitotoxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mitochondrial liability across therapeutic areas, reducing redundant isolation and qualification efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target modulation through multiparametric confirmation of mtPTP inhibition or induction.
- Operational Value: Standardization via isolated mitochondria preparation, dye calibration, and sequential calcium pulse protocol.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by identifying mitochondrial liabilities early, reducing late-stage attrition due to off-target organelle toxicity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effect on calcium retention capacity and pore sensitization thresholds.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation, spectrophotometry, and ratiometric dye handling.
- Spectrofluorimeter with dual-emission capacity and temperature control for simultaneous Ca2+, JC-1, and light scattering measurements.
- Standardization of mitochondrial isolation buffer, trypsin use, and calcium pulse timing across laboratories.
- Adaptation considerations for non-cardiac mitochondria due to tissue-specific differences in pore component expression.
- Practical limitation: assay sensitivity depends on mitochondrial coupling integrity, requiring rigorous QC via respiratory control and membrane impermeability tests.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:31
Isolation of Mitochondria from Mouse Heart
4:40
Quality Control: Measurement of Respiratory Control Ratio (RCR)
6:51
Quality Control: Assessment of Mitochondrial Membrane Integrity (Cytochrome c Test)
7:34
Measurement of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening
10:03
Representative Assay Results
13:08
Conclusion
![과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
