사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작

본 절차의 목적은 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 사용하여 생쥐의 대뇌 피질과 해마에 있는 수상돌기 및 가시를 시각화하고 유전적으로 조작하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 플라스미드 DNA 용액을 자궁 내 배아의 측뇌실에 주입함으로써 수행됩니다. 그 다음으로, Palo 전극의 위치를 다르게 하여 전기천공을 진행합니다.

DNA 주입에 따라 대뇌 피질 또는 해마에 전기천공법을 시행한 후, 원하는 생후 또는 성체 단계까지 배양합니다. 마우스를 관류시키고 뇌를 수집합니다. 마지막으로, 진동 절편기를 사용하여 뇌를 절편화합니다.

최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 수지상 돌기와 가시를 시각화할 수 있습니다. 단일 전천공법(unitary electroporation) 기술은 수지상 돌기와 가시를 연구하는 다른 방법들에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 실제로 이 기술을 통해 이러한 양상을 생체 내(in vivo)에서 직접 연구할 수 있습니다.

또한, 유전자 넉아웃 마우스 제작과 비교했을 때 전기천공법은 유전자 억제 또는 유전자 발현의 효과를 연구할 수 있는 신속한 접근법이며, 특정 세포 구조뿐만 아니라 발달의 특정 시점에서 수지상 돌기 및 가시를 연구할 수 있게 해줍니다. 전기천공법에서 유도성 시스템을 사용하는 것 또한 수지상 돌기 및 가시 발달에 관여하는 유전자들 사이의 기능적 상호작용을 확인하는 유용한 도구입니다. 실제로, 예를 들어 바이러스의 경우와는 대조적으로, 동일한 세포 집단 내에 여러 개의 RNA 또는 여러 개의 유전자를 결합시키는 것이 어렵습니다. 우선 DNA를 증류수에 희석하여 원하는 농도로 맞춘 후, 파스트 그린 염료를 최종 농도 0.05%가 되도록 첨가하십시오. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 주사용 유리 바늘을 제작하십시오.

임신한 마우스를 isof fluorine을 이용한 마취 유도 챔버에 넣고 산소 유량을 분당 2L로 조절합니다. 동물의 righting reflex가 소실되면 수술 전 마스크로 옮깁니다. 각 눈에 IGEL을 한 방울씩 떨어뜨리고 전기 면도기를 사용하여 복부의 털을 제거합니다.

클로르헥시딘으로 제모 부위를 한 번 닦아내어 흩날리는 털을 제거합니다. 동물을 수술 구역 내의 두 번째 마스크로 옮기고, 등 부분이 가열 패드 위에 오도록 놓습니다. 발가락 반사(petal reflex)가 소실되면 수술을 시작합니다.

마스크와 멸균 장갑을 착용하고 동물을 멸균 드레이프로 덮습니다. 제모된 부위를 클로르헥시딘으로 최소 3회 세척합니다. 메스를 사용하여 피부의 중앙선을 따라 수직으로 절개합니다.

가위를 사용합니다. 선형 팔꿈치를 따라 복부 근육에 유사한 절개를 가합니다. 가장 접근하기 쉬운 배아들을 선택합니다.

링 포셉을 두 배아 사이에 배치하고 복강에서 배아 체인을 조심스럽게 끌어냅니다. 이 시점부터는 멸균된 예열 PBS를 사용하여 배아가 건조해지지 않도록 유지하십시오. 링 포셉을 사용하여.

양막낭 내부에서 배아의 위치를 조심스럽게 조정하고 링 사이에 머리를 고정합니다. 살짝 눌러 배아를 자궁벽 쪽으로 더 밀어 올립니다. 다른 한 손으로는 모세관 홀더를 잡고, 측뇌실을 겨냥하여 반구의 중앙에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다.

자궁벽 표면에서 바늘의 움직임을 최소화하고 혈관을 찌르지 않도록 주의하며, 페달을 눌러 약 0.5 µL의 녹색 DNA 용액을 주입합니다. 피질 전기천공법의 경우 양극 페달을 주입된 뇌실과 같은 쪽에, 해마 전기천공법의 경우 주입된 뇌실의 반대쪽에 배아 머리 양옆으로 전극을 배치합니다. 그런 다음 1초 간격으로 50 ms 지속 시간의 30 V 전기 펄스를 5회 가합니다.

태반을 통해 전류가 흐르지 않도록 주의하십시오. 이는 배아의 사망을 초래할 수 있습니다. 생존율을 높이기 위해, 모든 배아의 주입 및 전기 자극 작업을 30분 이내에 완료하십시오. 작업이 끝나면 PBS로 세척하고 복강 내에 위치시킨 후, 링 포셉을 사용하여 자궁각을 원래 위치로 되돌려 놓습니다. Vicryl 흡수성 봉합사를 사용하여 복벽과 피부를 봉합합니다. 동물이 깨어날 때까지 회복실에 둡니다.

그 후, 수술 24시간 및 48시간 뒤에 가열 패드가 설치된 케이지로 옮깁니다. 마우스의 행동을 관찰하여 통증, 고통 또는 괴로움을 평가하고, 뇌 분석을 위해 동물의 체중을 측정합니다. 출생 후 단계에서는 진동 절편기를 사용하여 이전에 관류 및 사후 고정된 뇌를 절편화하고, 수지상 돌기와 가시를 이미징하기 위해 절편을 aqua poly mount에 마운팅합니다.

이 그림은 E 14.5 단계에서 전기천공법을 시행한 마우스의 대뇌 피질, 해마의 CA1 및 치상회에서 전기천공된 세포의 예를 보여주며, GFP 제작물 및 뇌 조직은 생후 14일에 수집되었습니다. 소량의 DNA 용액을 주입함으로써 소수의 세포만 표지되었으며, 이를 통해 단일 GFP 양성 세포의 수지상 돌기 분지뿐만 아니라 고배율에서의 가시 돌기(spine)를 시각화할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 소수의 세포만을 표적으로 삼아 가시 돌기나 전기천공된 뉴런을 시각화하고 정량화할 수 있도록 DNA를 소량 주입하는 것이 중요합니다.