절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

이 절차의 전반적인 목표는 건강하고 손상되지 않은 근육을 분리하여 체외 수축 기능을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 마우스에서 온전한 신근 digitorum digitus 또는 EDL과 가자미근 또는 발바닥 근육을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 EDL과 발바닥 근육의 인대와 힘줄을 수술용 봉합사로 묶는 것입니다.

다음으로, 고립된 근육을 힘 변환기와 수축 챔버에 장착합니다. 마지막 단계는 자기장 전기 펄스로 근육을 자극하여 수축을 유도하는 것입니다. 궁극적으로, 결과적인 힘은 힘 변환기로 전달되고 기록되며, 근육 수축성에 미치는 영향을 비교하기 위해 다양한 생리학적 및 약리학적 조작을 수행할 수 있습니다.

현장 수축성 측정, 남성 성능 치료 등과 같은 근육 기능을 평가하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 골격 근육에서 뉴런과 혈관 구성 요소를 제거하여 수축 근육의 고유한 특성을 직접 평가할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 온전한 흡입 근육을 해부하기 때문에 손재주와 인내심을 퍼뜨리는 것이 필요하기 때문에 바퀴가 고군분투합니다. 이 절차는 제 연구실의 기술자와 Dr.Jma 연구실의 박사후 연구원인 열쇠 구멍 공원이 될 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 근육 절개 및 수축 챔버에 장착하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 따라서 이 비디오는 근육의 해부학적 구조를 이해하고 고립된 근육을 장착하는 데 필요한 규모를 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 절차에서는 야생형 C형 57 블랙 식스 마우스 또는 경추 탈구에 의한 질병 마우스 모델을 희생하고 측면 위치에 배치합니다.

EDL을 절개하려면 표재성 피부를 절개합니다. 전방 경골과 후방 근육 그룹 사이의 근막을 잘라냅니다. 인대가 경골의 외측 과두와 전방 비골 표면의 3/4인 상과에 연결된 근위 원점을 찾습니다.

다음으로, 섬세한 안과 가위로 인대를 가능한 한 근육에서 멀리 잘라 EDL 근육의 근위 기원을 풀어줍니다. 그런 다음 뭉툭한 집게로 인대를 잡고 천천히 당겨 EDL을 풀어줍니다. EDL을 둘러싼 파라메시움의 일부와 EDL 주변의 다른 근육을 절단해야 할 수도 있습니다.

EDL 근육의 손상을 방지하기 위해 이 단계를 세심하게 수행해야 합니다. 그런 다음 4개의 원위 힘줄이 2-5개의 손가락의 중간 및 원위 지골에 삽입되는 삽입 부위에서 힘줄을 근육에서 최대한 멀리 자릅니다. 분리된 EDL 근육을 칼슘이 없는 등장성 티로 용액이 들어 있는 해부 접시로 옮깁니다.

EDL 근육은 옅은 분홍색의 흰색을 띠는 빠른 해당작용 근육으로, 길이는 약 10-13mm, 무게는 8-11mg입니다. 다음으로, 가능한 한 근육에서 원위부에 있고 인대 또는 힘줄의 세로로 중간 지점보다 약간 위에 있는 6개의 핫 사이즈 봉합사로 고립된 EDL 근육의 양쪽 끝에서 수술 매듭을 단단히 묶습니다. 그런 다음 EDL 근육을 산소 포화 조직 수조 챔버로 이동합니다.

힘 변환기의 샘플 홈과 배스 챔버 바닥의 고정 고리에 근육을 장착합니다. 다른 쪽 다리의 EDL 근육에 대한 분리 및 장착 과정을 반복하여 다리의 뒤쪽 측면에서 발바닥을 절개합니다. 일반적으로 그것을 덮고 있는 위근육을 옆으로 밀어냅니다.

밑창은 짙은 붉은색을 띤 느린 산화 근육으로 EDL보다 약 1mm 짧지만 EDL보다 약간 더 무겁습니다. 근위 원점에서. 발바닥 선을 따라 후방 경골의 근위 절반과 후방 비골의 근위 3분의 1에 연결되는 인대를 절단합니다.

다음으로 원위 삽입부에서 후방 종골에 삽입되는 종골 힘줄을 자릅니다. 그 후에 조심스럽게 영혼을 해방시키십시오. 목욕탕에 발바닥 근육을 올바르게 장착하십시오.

근육이 개별 조직 배스 챔버에 장착되면 데이터 기록을 시작합니다. 힘 센서의 기준선을 0으로 설정하는 것을 잊지 마십시오. 이를 통해 기준선 변화를 쉽게 관찰할 수 있고 다양한 실험 조건에서 근육 수축을 쉽게 비교할 수 있습니다.

그런 다음 구형파 펄스로 고립된 근육을 자극합니다. 60에서 300밀리암페어 범위의 전류, 0.3에서 1밀리초 사이의 개별 구형파 펄스 지속 시간 및 350, 500 또는 1000밀리초의 자극 열차 지속 시간을 사용합니다. 다음 단계는 고립된 근육이 실온에서 최적의 길이로 늘어날 때 최대한의 타이타닉 힘을 생성할 수 있는 자극 주파수를 선택하는 것입니다.

이 주파수는 일반적으로 EDL의 경우 약 100Hz, 60Hz입니다. 영혼을 위해 근육을 천천히 스트레칭하고 30초 동안 기다린 다음 100헤르츠 또는 60헤르츠로 근육을 자극합니다. 그런 다음 다시 늘리십시오.

30초 더 기다렸다가 스트레칭 후 다시 자극한다. 힘이 더 이상 증가하지 않으면 일반적으로 최대 힘이 달성되었음을 의미합니다. 한편, 스트레칭과 자극의 반복적인 주기에서 힘 감소는 근육이 과도하게 늘어났음을 암시합니다 이 상황에서 근육을 이전 스트레칭 수준으로 풀고 최대 힘이 관찰될 때까지 근육을 다시 자극합니다.

이제 힘 대 주파수 관계를 구합니다. 1에서 140 헤르츠까지의 주파수로 5-10 헤르츠씩 30-60 초의 주기로 근육을 자극합니다. 섭씨 25도에서 실험을 수행할 때 섭씨 37도에서 실험을 수행할 때 FF를 횡격막근의 경우 최대 300헤르츠, 영혼의 경우 180-200헤르츠, EDL의 경우 220-250헤르츠의 더 높은 주파수로 확장합니다.

다음으로, 각 자극 주파수에 의해 생성되는 힘의 양을 비교하여 최대 타이타닉 포스와 약 절반의 최대 타이타닉 포스를 생성하는 주파수를 식별합니다. Tmax는 수축 기계 변조에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 반면 절반 Tmax는 칼슘 조절 및 ECC 프로세스와 더 관련된 정보를 제공합니다.

그런 다음 근육을 30분 동안 1분 간격으로 tmax 주파수로 자극하는데, 이 과정을 평형이라고 부르며 근형성 망상의 기여를 연구합니다. 평형 후 근육 수축에 대한 칼슘 방출은 5분 동안 2초 간격으로 1/2 Tmax 자극을 전달하여 근육을 피로하게 합니다. 우리는 여기에서 500 밀리 초의 기차 지속 시간을 사용했기 때문에 듀티 사이클은 25 %입니다.그런 다음 1 분 간격으로 1/2 Tmax에서 근육을 복구합니다.

30분 동안 또는 힘이 안정될 때까지 추가 피로 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 이제 Tmax에서 tmax 피티구잉을 사용하면 수축 기계의 상태를 정확하게 테스트할 수 있는 것으로 여겨집니다. 그런 다음 서로 다른 균주, 질병 모델 또는 약물 치료 간의 표현형 차이를 관찰할 수 있도록 FF를 얻기 위한 절차를 반복합니다.

피로 전후의 FF를 분석하여 근육 수축에 대한 세포 외 칼슘 유입의 기여도를 조사함으로써 목욕 용액을 칼슘은 없지만 0.1 밀리몰 EGTA를 포함하는 용액으로 변경할 수 있습니다. 또는 매장에서 운영하는 채널의 다른 차단제를 입욕 용액에 적용할 수 있습니다. 실험이 끝나면 근육의 실험 길이를 측정 한 다음 분석 저울로 개별적으로 무게를 측정하고 근육을 플래시 한 다음 액체 질소로 근육을 동결하고 생화학 분석을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

이제 힘 센서를 보정합니다. 보정 결과에 따라 기록된 근력(밀리볼트)을 그램 힘으로 변환합니다. 그런 다음 생리학적 단면적으로 정규화합니다.

이 그림은 5 헤르츠, 20 헤르츠에 의해 유도되는 수축력을 보여주며, 여기서 최대 타이타닉 힘은 수축력, 손상된 근육의 힘의 흔적을 보여줍니다. 다음은 EDL에서 힘 대 주파수 관계의 개별 수축과 ff로 인한 플롯 곡선을 보여주는 대표적인 예입니다. 이것은 EDL 근육의 전형적인 빠른 감소 피로 프로필과 바닥 근육의 느린 감소 피로 프로필입니다.

피곤한 자극은 기계적 대체품의 출현으로 이어집니다 속임수에서, 칼슘 처리 특성이 방해받은 녹아웃 근육 일단 숙달되면 이 기술은 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 적절하게 수행되면 전체 실험이 더 오래 지속되며 수행된 중재 횟수에 따라 달라집니다. 이 절차를 시도하는 동안 낮은 산소 체외 환경은 각 근육의 속도에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있으므로 가능한 한 빨리 DL 근육을 분리하고 장착하는 것이 매우 중요합니다.

이 절차에 따라 유전자 분석, 웨스턴 블로팅 면역조직화학 및 구조 연구를 동일한 실험 근육에 대해 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 수축성 또는 칼슘 신호를 조절하는 근육 단백질의 구성 요소 또는 특정 단백질의 발현 수준 및 국소화, 발달 후 특정 조건으로 인한 근육의 형태학적 또는 초구조적 변화. 이 기술은 근육 생리학 분야의 연구자들이 생쥐, 쥐, 햄스터를 포함한 다양한 모델에서 골격 근육 기능에 영향을 미치는 유전적 결함을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.