Name: 골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 배우세요 마우스 골수 이식을 통한 대장염 완화 메커니즘 연구 방법을. 이 실험은 lyin 항균펩타이드의 면역 조절 역할과 조직 손상 평가 기법을 다룹니다.

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이 작품은 UCLA-치료 센터, Crohn의 및 미국 경력 개발 상 (# 2691)와 건강 NIDDK K01 국립 연구소 (DK084256) 혼 와이 쿤에 대한 자금의 대장염 재단의 파일럿 및 타당성 연구 기금의 지원을받는되었다. 골수 방사선 작업 버나드 레빈과 AIDS 연구 마우스 / 인간 키메라의 핵심 시설에 대한 UCLA 센터의 스콧 주방이 도움이되었습니다. 유동 세포 계측법 작업은 UCLA 벡터 핵심 시설의 지원을했습니다.

1. 전에 - 당신 - 시작 기술 고려 사항 <ol><li> 해당 CD 분자와 마우스가 주요 마우스 공급 업체에서 구입 할 수 있기 때문 우리는 실험을 위해 C57/BL6 야생 형 마우스 및 녹아웃 마우스를 모두 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 이 야생 타입 마우스와 골수 이식 후 기증자의 세포를 파생 녹아웃 마우스를 추적하기가 어렵습니다 때문에, 야생 형 생쥐를 표현하기 위해 CD45.1 마우스를 사용 할 필요가 있습니다. (CD45.1 C57/SJL WT 마우스 잭슨 연구소 주식 # 002014). </li><li> 대부분의 마우스 식민지가 CD45.2 있습니다. 우리 녹아웃 마우스는 CD45.2 유전자형 (: 잭슨 연구소 주식 # 000664 대안 CD45.2 WT 마우스 소스)에 속한다. CD45.1 또는 CD45.2 유전자형의 결정은이 프로토콜의 제 7에서 설명 드린 바와 같이 골수 및 말초 혈액의 유동 세포 계측법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li><li> 조사 후 마우스 면역을 훼손하고있다. 병원체 무료 시설의 생쥐세요. </li><li> irradiator의 운영 특수 보안 clearanc가 필요합니다전자 및 교육. 교육 및 승인 과정에서 시간을 절약하기 위해, 그것은 irradiator를 작동 할 수 있습니다 자격을 갖춘 기술자와 실험실과 협력하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 대부분의 기관은 경험이 풍부한 기술자와 유동 세포 계측법 실험실을 갖추고 있습니다. 유동 세포 계측법 운영 문제를 최소화하기 위해, 당신이 시작하기 전에 경험이 풍부한 기술자와 유동 세포 계측법 실험 계획을 논의하는 것이 더 나을 듯합니다. </li><li> 마우스가이 방식 (그룹 당 10 마우스)에 할당되었습니다 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 그룹 </td><td></td><td> 받는 사람에게 골수 기증 </td><td> 치료 </td></tr><tr><td> </td><td> BM 교환 </td><td> CD45.1 WT에 CD45.2 KO </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr><tr><td> C </td><td> BM 교환 </td><td> CD45.1 WT에 CD45.2 KO </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> 디 </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr><tr><td> E </td><td> 가짜 </td><td> CD45.1 WT에 CD45.1 WT </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> 에프 </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr><tr><td> 지 </td><td> 가짜 </td><td> CD45.2 KO로 CD45.2 KO </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr></tbody></table> 실험 프로토콜의 * 간단한 그림은 그림 1에 표시됩니다. 2. 받는 마우스의 조사 <ol><li> 마우스는 사육과 병원균이없는 시설에 보관됩니다. 필터 autoclaved 조사 파이의 장소는 마우스. 조사 파이의 각 슬롯에 하나의 마우스를 놓습니다. irradiator에 파이를 놓고 턴테이블 파이, 선회되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 공기 펌프를 켜십시오통풍을 위해. irradiator 문을 닫고 닫아. </li><li> 10 분 (방사선 소스와 반감기에 따라 다름) 주변 1,000 방사선 (10 GY 동일합니다)를 함께 쥐를 비추다. 이 시점에서 방사능 마우스 immuno-위험하고 감염에 대한 면역력 약한 있습니다. 조사 후, 파이를 꺼내와 동물 시설의 바이오 안전성 캐비넷 교통 멸균 용기에 넣습니다. 감염의 기회를 최소화하기 위해 외부 환경에 쥐를 노출하지 마십시오. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에서 autoclaved 침구 (. - 100 ML 물을 당 3.12 ML을 케이지 당 4 쥐가 sulfatrim 정지와 함께 새로운 멸균 물을 추가)를 autoclaved 마우스 케이지에 쥐를 전송합니다. </li><li> 항생제는 빛에 민감한만큼 알루미늄 호일로 물 병을 넣어. 케이지에로드하기 전에 잘 sulfatrim 솔루션 병을 섞어 흔들어. </li></ol> 3. 기증자 골수에서 DNA를 추출하는 <ol><li> 이산화탄소 또는 isoflur있는 마우스를 희생ance 및 1:200 소독약 솔루션에 다음 잠그다. 피부에 오줌와 오픈 뼈를 해부하는 70 %의 에탄올과 쥐를 스프레이. </li><li> 살균에 대한 70 %의 에탄올에 절개 악기를 적시 게. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에 절개를 수행합니다. 근육과 인대를 부착에서 무료로 상완골, 대퇴골, 경골과 비골 뼈를 노출 살균 분해 악기를 사용하십시오. </li><li> 붉은 골수을 보여 뼈의 양쪽 끝을 잘라 냈어. 집게로 뼈를 잡아. 페트리 접시 3 ML의 주사기와 바늘 25g까지로 차가운 PBS로 적색 골수를 플러시. 더 많은 골수 세포를 얻을 수 있도록 뼈의 양쪽 끝에서 플러시. </li><li> 반복 흡인과 배출에 의해 적색 골수 플러그를 깨고 6 ML 주사기와 18G1 / 2 바늘을 사용합니다. 50 ML 팔콘 튜브와 골수를 전송합니다. </li><li> 4에 5 분 ° C.에 1,800 RPM에서 골수를 스핀 다운 5-10 초에 vortexing하여 표면에 뜨는, resuspend 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 멸균 물 10X RBC의 용해 버퍼를 희석. 광고D 1X RBC 용해 버퍼 (기증자 마우스 당 5 ML), 5 초에 다시 한번 소용돌이, 룸 온도에서 정확히 3 분 유지. </li><li> 3 분 후, 용해 및 혼합을 중지 할 20 ML 차가운 PBS로 튜브를 채 웁니다. 직접 새로운 50 ML 팔콘 튜브에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 콘텐츠를 넣어. </li><li> PBS의 5 ML을 원래 튜브를 씻어뿐만 아니라 셀 스트레이너에 전송할 수 있습니다. PBS와 혼합있는 50 ML까지 가기. </li></ol> 4. 골수 기증자 셀을 계산 <ol><li> Eppendorf 튜브 및 Eppendorf 튜브와 혼합에 골수 정지 100 μl에 Trypan 파랑의 100 μl를 추가합니다. hemocytometer에 스테인드 세포 혼합물을 피펫. </li><li> 셀의 금액은 매 튜브의 총 생활 골수 세포 수 = 흠없는 전화 번호 16 제곱에서 x 2 (Trypan 푸른 희석으로 인해) × 10,000 X 50 ML에 의해 계산됩니다 </li><li> 4에 5 분 ° C.에 2,000 rpm에서 50 ML 팔콘 튜브에 골수 세포를 스핀 다운 </li><li> 표면에 뜨는을 제거합니다. 기초전체 셀 개수에 ML 당 1 개 10 8 셀에 PBS로 펠릿을 resuspend </li></ol> 5. 받는 마우스에 주입 <ol><li> 열 패드에와 지구 온난화 램프 아래에있는받는 사람 쥐를 따뜻하게. restrainer에받는 사람 쥐를 놔. intravenously 100-200 μl에 마우스 당 1 개 10 7 세포를 주입. </li><li> 기증 골수의 주입은 조사 후 4-24 시간 사이에 수행되어야합니다. </li><li> 케이지 당 4 개의 주입 마우스를 올려. 병원체 무료 동물 시설의 처음 4 주 동안 항생제 - 처리 된 물과 autoclaved 케이지의 주입받는 쥐를 유지하고 쥐가 면역을 회복 보자. 변경 케이지, 항생제 - 처리 물과 음식은 4 일마다 위생을 유지합니다. </li></ol> 6. 대장염의 대장염 및 평가의 유도 <ol><li> 사주 조사 및 골수 이식 후 자신의 정상을 회복하기 위해 항생제없이 일반 물로 전환, 2보다 주 동안 쥐를 유지microflora를 약탈. </li><li> 육주 골수 주입 후 초기 체중을 측정합니다. 일부 마우스는 대장염을 유발 물 광고 libitum를 마시는 5 % dextran 황산 제공됩니다. 일부 마우스는 일반 제어 그룹으로 정기적으로 식수를 제공하고 있습니다. </li><li> 오일 후, 말초 혈을 인출 헤파린 코팅 튜브 (Vacutainer)에 전송하고 얼음에 유의하시기 바랍니다. 1 관에 4 마우스에서 혈액을 수영장을 보유하고 있습니다. 세포 염색 버퍼 = 600 μl를 300 μl를 혈액 300 μl 조화를 이루고 있습니다. 100 μl 5 개 Eppendorf 튜브, 각각 피를 나눈다. </li><li> 이산화탄소 또는 isoflurane과 쥐를 희생. 매크로 손상 점수를 (세부 1 다른 주피터 비디오 간행물을 참조하시기 바랍니다) 평가합니다. 체중의 변화를 측정합니다. 디지털 캘리퍼스로 측정 장 길이와 두께. 대변​​ 텍스처 (하드, 소프트 또는 피) 관찰. Hemooccult과 배설물에 잠혈를 결정합니다. 결장 조직을 해부하고 H &amp; E의 착색을위한 포르말린에 고정시킨다. </li><li> 한 대퇴골 흔적을 해부NE 당 마우스 골수를 추출하고 25g까지 바늘 1 ML의 주사기를 통해 차가운​​ PBS로 골수를 플러시. 풀 네 골수 1 관에 플러그와 얼음에 유의하시기 바랍니다. </li><li> 더 골수 플러그가 존재하지 않습니다 때까지 페트리 접시, 전단 18G 바늘, 5 ML의 주사기를 여러 번와 골수 플러그에 골수 하거라. </li><li> 4 ° C.에 5 분에 1,500 RPM과 스핀 다운 표면에 뜨는, 600 μl 세포 염색 버퍼와 resuspend 제거합니다. 100 μl 5 개 Eppendorf 튜브, 각에 resuspended 골수를 나눌 수 있습니다. </li></ol> 7. 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 품질 검사 <ol><li> 혈액 또는 골수 # 1-5의 각 샘플 튜브를 레이블 : </li><li> 어둠 속에서 각각의 튜브에 대한 항체 혼합물을 준비합니다. </li></ol> # 1 없음 항체 # 2 30 μl FITC의 isotype 제어 + 30 μl PE isotype 제어 + 15 μl CD16/32 차단 # 3 30 μl FITC CD45.1 AB + 15 μl CD16/32 차단 # 4 30 μl PECD45.2 AB + 15 μl CD16/32 차단 # 5 30 μl FITC CD45.1 AB + 30 μl PE CD45.2 AB + 15 μl CD16/32 차단 <table border="1"><tbody><tr><td> 혈액 또는 골수 샘플 # 1 아무것도 추가하지 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 2 항체 혼합물 # 2의 5 μl를 추가합니다 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 3 항체 혼합물 # 3 3 μl를 추가합니다 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 4 항체 혼합물 # 4의 3 μl를 추가합니다 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 5 항체 혼합물 # 5의 5 μl를 추가합니다 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 30 분에 얼음 어둠 속에서 보관. </li><li> 각 튜브에 두 ML 1X RBC의 용해 버퍼를 추가합니다. 15 분에 얼음에 어두운에 유의하십시오. </li><li> 4에 5 분 ° C. 1,500 rpm으로 세포를 스핀 다운 (GH 3.8 회 1,500 RPM = 350 XG) 표면에 뜨는 제거합니다. 어두운 다음, 소용돌이 간략 500 μl 세포 염색 버퍼로 펠렛을 Resuspend. </리&gt; <li> 유동 세포 계측법에 의한 immunostained 혈액과 골수 샘플에 CD45.1 (WT을 대표)와 CD45.2을 (KO를 대표하는) 확인합니다. KO CD45.2을 표현하기 위해 WT CD45.1와 PE를 표현하기 위해 FITC를 선택합니다. </li><li> FlowJo 소프트웨어 유동 세포 계측법 결과를 분석합니다. PE 비율이나 PE : FITC의 비율을 계산 FITC 비율은 기증 유전자형 피가 골수에서 지배적 인 유전자형인지 여부를 확인합니다. </li></ol>

<ol><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).</li>
<li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li>
<li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice%3A+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li>
<li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li>
<li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+cells+in+murine+colitis%3A+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11(2011).</li>
<li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells%2Fendothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li>
<li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li>
<li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow-derived+monocytes%2Fmacrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and%2For+anticancer+drugs+in+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145(2010).</li>
<li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. </a> Gut. , (2012).</li>
<li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14%2B+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li>
<li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li>
<li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP%28%2B%29+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 골수 이식 접근 방식은 면역학의 대장염의 연구, 감염, 암, 비만 및 기타 질병에 적합합니다. 이 골수 이식 실험은 유전자 수준의 관심은 모두 파생 골수와 비 골수 파생 세포와 유전자 수준의 관심이 어느 인구의 세포에 의해 병을 중재 것으로 의심되는 표현 할 때 필요합니다. 예를 들어, 항균 펩타이드 cathelicidin은 급성 대장염을 조절하기 위해 표시됩니다. 그러나 그것은 상피 세포와 면역 세포 (예 : 대 식세포 등) 모두에 표시됩니다. 그럼 우리가 마우스의 급성 대장염을 변조 세포의 어떤 인구 정의 할 뼈 이식을 사용했습니다. 대장염의 심각성이 크게 골수 이식을 통해 골수 cathelicidin의 genotypes의 변화 이후에 변경되었습니다. 그럼 우리가 DSS에 대한 응답으로 변조 급성 대장염에서 중요한 역할을 담당하고 골수 유래 세포로 표현 그 cathelicidin을 체결 할 수 있습니다. 뼈 mArrow 파생 된 세포는 일반적으로 적혈구, 백혈구와 혈소...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 세포 염색 버퍼 </td><td> Biolegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X 적혈구 용해 버퍼 </td><td> Biolegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC 마우스 isotype 제어 </td><td> Biolegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE 마우스 isotype 제어 </td><td> Biolegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE 안티 - 마우스 CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC 안티 - 마우스 CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD16/32 차단 </td><td> Biolegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 μm 셀 스트레이너 </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><tD&gt; MP의 biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (어부) </td></tr><tr><td> 소독약 IC </td><td> Andwin 과학 </td><td> NC9745686 (어부) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> 마우스 restrainer </td><td> Braintree 과학 </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> JL 목자 사 </td><td> 제가 68A 표시 </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer 테스트 튜브 </td><td> 매 </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> 디지털 캘리퍼스 </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult ICT </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> G0328QW </td></tR&gt; </tbody></table>

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

대장염의 개발에 유전자의 역할을 이해하기 위해, 우리는 야생 타입 마우스 및 대장염에 대한 유전자 수준의 관심 결함 녹아웃 마우스의 반응을 비교했다. 유전자 수준의 관심은 골수 파생 세포와 호스트의 비 골수 유래 세포 모두에 표시되어있는 경우, 그러나, 골수 유래 세포 및 비 골수의 관심 유전자의 역할을 차별화 할 수 있습니다 골수 이식 기술에 의해 파생 된 세포. 마우스의 골수 유래 세포 유전자형을 변경하려면받는 마우스의 원래 골수는 방사선에 의해 파괴하고 다른 유전자형의 새로운 기증 골수로 대체되었습니다. 야생 형 쥐 기증 골수가 녹아웃 마우스에 이식되었을 때, 우리는 골수 유래 세포의 야생 형 유전자 발현과 녹아웃 마우스를 생성 수 있습니다. 또한,시 녹아웃 마우스 기증 골수는 유전자 수준의 관심을 표현하지 않고 야생 타입받는 마우스, 야생 형 생쥐에 이식 된골수에서 파생 된 세포가 생산되었다. 그러나, 골수 이식이 100 % 완료되지 않을 수 있습니다. 따라서, 우리는받는 마우스 및 골수 이식의 성공에 기증 골수 유래 세포의 비율을 추적하기 위해 기증자와받는 사람 세포의 마커로 차별화 (CD) 분자의 클러스터를 (CD45.1 및 CD45.2) 이용. CD45.2 유전자형과 CD45.1 유전자형과 녹아웃 쥐 야생 형 생쥐가 사용되었습니다. 받는 마우스 조사 후, 다른 genotypes의 기증 골수 세포가받는 마우스에 주입했다. 새로운 골수는 면역을 물려 생성하면, 생쥐는 대장염을 유발하는 화학 물질 에이전트 (dextran 나트륨 황산, DSS 5 %)에 의해 도전되었다. 여기 우리는 또한 마우스로 대장염을 유발하고 뼈 골수 유래 세포에서 표현의 관심 유전자의 역할을 평가하는 방법을 보여 주었다. 뼈 파생 된 세포에서 유전자 수준의 관심은 질병의 발전에 중요한 역할을 (예 : 대장균과 같은 재생되면살은), 골수 이식과 함께받는 생쥐의 표현형이 크게 변경 될 수 있습니다. 대장염 실험의 끝에서, 골수 혈액과 골수의 세포 CD45.1 및 CD45.2에 대한 항체와 라벨이 붙지 만, 존재의의 양적 비율은 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 성공 여부를 평가하는 데 사용할 수 파생. 성공적인 골수 이식받는 사람 마우스의 골수와 혈액 모두에서받는 사람 유전자형 이상 기증 유전자형 (CD 분자 마커의 기간에)의 대부분을 표시합니다.

유전자 수준의 관심이 대장염의 개발 기간 동안 면역 세포에서 중요한 역할을 담당하는 경우, 쥐가 골수 이식 (WT KO 또는 WT에 KO로)를 통해 서로 다른 유전자형의 골수를받는 것은 DSS 대장염에 변경된 응답이 있어야합니다. 대장염의 심각도를 결정하기위한 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 colonic 조직의 H &amp; E 염색입니다. Colonic 조직 구조 변화와 염증의 징후는 양적 H &amp; E 조직학 점수 시스템에 의해 평가를 할 수 있습니다. H &amp; DSS의 대장염 모델 E 조직학 점수에 대한 기준은 여기를 둘 발견 할 수 있습니다. 또한, 화학 유도 대장염은 trinitrobenzene 설 폰산 (TNBS)로 유도 할 수 있습니다. TNBS의 대장염 유도 및 H &amp; E 조직학 점수 기준의 방법은 이전 발행 3에서 찾을 수 있습니다. 그룹 간의 조직 학적 소견으로 점수 차이는 학생의 t-테스트에 의해 분석 할 수 있습니다. <p ...

골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

결장염의 발생 과정에서 특정 유전자의 역할을 이해하기 위해, 야생형 마우스와 해당 관심 유전자가 결핍된 녹아웃 마우스의 반응을 비교하였습니다...

이 영상에서 시연하는 실험의 전반적인 목적은 항균 펩타이드 lyin이 마우스의 덱스트란 황산염 유도 결장염 완화에 역할을 하는지 평가하는 것입니다. 이를 위해 방사선을 조사한 야생형 및 녹아웃 마우스에 야생형 마우스의 골수를 주입하고, 방사선을 조사한 야생형 마우스에 녹아웃 마우스의 골수를 주입합니다. 이식된 골수는 공여자의 유전자형에 따른 새로운 혈구 세포를 수혜자 체내에서 생성하게 됩니다.그 후 수용 쥐에게 덱스트란 황산염을 투여하여 4주 뒤에 결장염을 유도합니다. 이식 성공 여부는 유세포 분석법으로 검증하고, 결장 조직 손상 정도는 조직학적으로 평가합니다. 분석 결과, 결손 쥐에게 야생형 골수를 이식했을 때 결장염이 완화되는 것으로 나타났습니다.반대로, 결손 골수를 야생형 마우스에 이식하면 결장염이 악화됩니다. 이 방법은 염증 또는 감염 시 골수 유래 세포 또는 비골수 유래 세포의 유전자 발현을 결정하는 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 야생형 마우스와 결손 마우스를 추적할 수 있도록 이 실험에는 C 57, black six, 야생형 및 C 유도 결손 마우스가 권장됩니다.골수 이식 후의 공여자 세포. 야생형 마우스는 CD 45.1 마우스로, 녹아웃 마우스는 CD 45.2 마우스로 표기합니다. 여기에 제시된 도표는 실험 설계를 설명하며, 각 그룹당 5마리의 공여자 마우스와 10마리의 수혜자 마우스가 배정됩니다.그룹 A와 B의 경우, 야생형 마우스에서 결손 마우스로 골수를 이식합니다. 그룹 A에서는 결장염을 유도하고, 그룹 B에서는 유도하지 않습니다. 그룹 C와 D의 경우, 결손 마우스에서 야생형 마우스로 골수를 이식하며, 그룹 C에서만 결장염을 유도합니다. 그룹 E와 F의 경우, 야생형에서 야생형으로 이식하며, 그룹 G와 H의 경우, 결손 마우스에서 결손 마우스로 이식합니다. 조사된 마우스에 이식할 공여 골수를 준비하기 위해, 우선 생물안전 작업대 내에서 희생된 마우스의 뼈에서 골수를 추출합니다.멸균된 해부 도구를 사용하여 상완골, 대퇴골, 경골 및 비골을 부착된 근육과 인대로부터 분리하여 노출시킨 후, 이를 페트리 접시에 옮깁니다. 뼈의 양쪽 끝을 절단하여 적색 골수를 드러나게 합니다. 그런 다음 포셉으로 뼈 중 하나를 잡습니다.3 mL 주사기와 25G 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 적색 골수를 다른 페트리 접시로 씻어내십시오. 그다지 골수의 반대쪽 끝에서도 씻어내어 더 많은 골수 세포를 얻으십시오. 각 뼈에 대해 이 과정을 반복하십시오.야생형 및 녹아웃 마우스의 골수를 각각 따로 모읍니다. 18게이지 0.5인치 바늘이 장착된 6mL 주사기를 사용하여 적골수 플러그를 반복적으로 흡인 및 배출함으로써 분쇄합니다. 그 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 수집된 골수를 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다.모든 골수를 옮긴 후, 4°C에서 740 G로 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고 5~10초 동안 볼텍싱하여 펠릿을 재부유시킵니다. 펠릿에 공여 마우스 한 마리당 5 mL의 XRBC 용해 버퍼를 첨가하고 다시 5초 동안 볼텍싱한 후, 실온에서 정확히 3분 동안 배양합니다.3분 후, 각 튜브에 차가운 PBS 20 milliliters를 첨가하고 도치 혼합하여 용해를 중단시킵니다. 그런 다음 내용물을 40 micron 세포 스트레이너를 통해 새로운 50 milliliter 원추형 튜브에 붓습니다. 원래 튜브를 PBS 5 milliliters로 헹구고 해당 용액을 세포 스트레이너로 옮깁니다.원뿔형 튜브에 계속해서 유출액을 수집합니다. 그 다음 PBS를 사용하여 부피를 50 milliliters까지 맞추고 전도 혼합하여 섞어줍니다. 이어서 헤모사이토미터를 이용한 트라이판 블루 배제법으로 생존 세포 수를 측정합니다.세포 수를 결정한 후, 골수 세포를 4°C에서 913 ×g로 5분간 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 총 세포 수에 따라 상층액을 제거합니다. 펠렛을 1 × 10⁸ cells/mL의 농도로 PBS에 재현탁합니다.이제 골수 세포를 조사된 수용 마우스로 이식할 준비가 되었습니다. 본 실험을 위한 수용 야생형 및 녹아웃 마우스는 동봉된 문서에 기술된 대로 1000 rad의 방사선을 조사받았습니다. 마우스는 무균 시설에서 번식 및 사육되었으며, 조사 후 4~24시간 뒤에 공여 골수를 주입하기 위해 가온 램프 아래 가온 패드에서 수용 마우스를 가온합니다. 수용 마우스를 보정기에 넣고, 주사 부위를 소독하고 국소 혈관 확장을 촉진하여 주사를 용이하게 하기 위해 꼬리를 70% ethanol로 닦아냅니다.28.5게이지 바늘이 달린 인슐린 주사기를 사용하여, 1×10⁷개의 세포를 1~200 µL의 부피로 각 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 주입 후 처음 4주 동안은 주입된 마우스를 최대 3마리의 다른 주입된 마우스와 함께 케이지에 둡니다. 주입된 수용 마우스는 항생제 sulfa trim이 포함된 물이 제공되는 오토클레이브 케이지에서 사육합니다.이를 통해 동물이 면역력을 회복할 시간을 갖도록 하며, 위생 유지를 위해 4일마다 케이지를 교체하고 항생제가 처리된 물과 사료를 제공합니다. 방사선 조사 및 골수 이식 4주 후, 항생제가 없는 일반 물로 교체하고 2주 더 유지하여 정상적인 장내 미생물군을 회복시킵니다. 골수 주입 6주 후, 대장염을 유도하기 위해 초기 체중을 측정합니다.염증성 장질환(colitis) 실험군 쥐의 음용수에 5% dextran sulfate를 공급합니다. 5일 후, 4마리 쥐의 말초혈을 헤파린 코팅 vacutainer 튜브에 모아 얼음 위에 둡니다. 그다음 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 혈액 300 µL와 세포 염색 버퍼 300 µL를 혼합하고, 이를 1번부터 5번까지 표시된 5개의 유세포 분석용 시험관에 각각 100 µL씩 나누어 얼음 위에 둡니다.마우스를 희생시킨 후, 체중을 다시 측정하여 변화량을 계산합니다. 결장 조직을 적출하여 H&amp;E 염색을 위해 포르말린에 고정합니다. 그런 다음 이전과 동일한 방법으로 골수 세포를 얻습니다.재현탁된 골수를 1번부터 5번까지 표시된 5개의 마이크로 원심분리 튜브에 각각 100 milliliters씩 나누어 넣습니다. 유세포 분석을 위해, 동봉된 문서에 기술된 대로 각 튜브에 해당하는 항체 혼합물을 암실에서 준비합니다. 1번으로 표시된 혈액 및 골수 시료는 대조군으로 사용하며 염색하지 않습니다. 2번으로 표시된 혈액 및 골수 시료는 fitzy isotype control PE isotype control 및 CD 16/32 차단 용액으로 염색합니다.이러한 아이소타입 대조군은 1차 항체가 샘플에 특이적으로 결합하는지 확인하는 데 사용됩니다. 3번으로 표시된 라벨의 샘플은 FZ CD 45.1 및 CD 16/32로 염색됩니다. 4번으로 표시된 블로킹 솔루션 샘플은 CD 45.2 및 CD 16/32로 염색됩니다.블로킹 용액. 단일 색상 표지는 혈액 또는 골수 내 공여 세포나 수용 세포의 존재 여부를 확인할 수 있게 합니다. 5번으로 표시된 샘플은 CD 45.1, CD 45.2 및 CD 16/32에 대해 염색될 것입니다.여기서 이중 색상 표시는 혈액 또는 골수 내 공여자 세포와 수혜자 세포의 상대적 비율을 보여줍니다. 각 샘플 튜브에 항체 혼합물 2와 5를 5 µL씩 첨가하십시오. 그런 다음 각 샘플 튜브에 항체 혼합물 3과 4를 3 µL씩 첨가하십시오.모든 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 튜브에 XRBC lysis buffer 2 mL를 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 어두운 상태로 얼음 위에서 15분 더 배양합니다.세포를 350 ×g에서 4 °C로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 500 µL의 세포 염색 버퍼로 암실에서 재현탁합니다. 그 다음 짧게 볼텍싱합니다.다음으로, 면역 염색된 혈액 및 골수 샘플에 대해 유세포 분석을 수행합니다. 야생형 CD 45.1은 FZ로, 녹아웃 CD 45.2는 PE로 지정하십시오. Flo Joe 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다.혈액과 골수에서 공여체 유전형이 우성 유전형인지 결정하기 위해 fit E 대비 PE 비율 또는 PE 대비 fit e 비율을 계산합니다. 이 이미지는 정상 조직학적 소견을 보이는 결장과 DSS 결장염이 있는 결장의 h and e 샘플 이미지를 보여줍니다. 조직학 이미지는 점막 조직 손상 및 점막 및 점막하 조직으로의 호중구 침윤 정도를 기준으로 점수를 매깁니다.따라서, lyin이 대장염 예방에 역할을 하는지 테스트하기 위해 조직학적 점수가 높을수록 대장염이 더 심각함을 나타냅니다. 이 비디오에서 설명한 대로 야생형 및 knockout 마우스 간에 골수를 이식하였습니다. 그 후, 여기에서 보여주는 바와 같이 조직학적 평가 및 점수 산정을 수행하였습니다.방사선을 조사한 야생형 생쥐에 녹아웃 생쥐의 골수를 도입했을 때 조직학적 점수가 유의하게 증가했습니다. 반대로, 녹아웃 생쥐에 야생형 골수를 도입했을 때는 점수가 유의하게 감소했습니다. 이러한 데이터는 골수 유래 세포의 내인성 C가 항염증 효과를 가지며 대장염을 완화시킨다는 것을 나타내며, 이 생쥐들에서 이식이 성공적으로 이루어졌음을 입증합니다.이식 후 마우스의 골수와 혈액에 대해 유세포 분석도 수행하였습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 야생형 골수는 Fitz CD 45.1에는 강하게 염색되지만 PE CD 45.2에는 염색되지 않으며, 녹아웃 골수는 PE에는 강하게 염색되지만 Fitz에는 염색되지 않습니다. 그러나 이식 후, 녹아웃 골수를 이식받은 야생형 마우스의 골수와 혈액 모두 Fitz가 아닌 PE에 강하게 염색되었으며, 이는 염색된 세포의 주된 집단이 공여체 유래임을 나타냅니다.마찬가지로, 야생형 골수를 이식받은 knockout 마우스의 골수와 혈액에서는 fitzy에 대해 강한 염색 반응이 나타났으나 pe에는 나타나지 않았으며, 이는 염색된 주요 세포 집단이 공여자 유래임을 다시 한번 확인시켜 줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 골수 이식 실험을 수행할 수 있으며, 골수 유래 세포를 통해 대장염을 조절할 수 있게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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