골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

이 비디오에서 입증된 실험의 전반적인 목표는 항균 펩타이드 lyin이 마우스에서 dextran sulfate 유발 대장염 개선에 어떤 역할을 하는지 여부를 평가하는 것입니다. 이는 야생형 마우스의 골수를 방사선 조사된 licit 및 knockout 마우스에 주입하고 knockout 마우스의 골수를 방사선 조사된 야생형 마우스에 주입함으로써 달성됩니다. 이식된 골수는 기증자 유전자형 수혜자에서 새로운 혈액 세포를 생성합니다.

그런 다음 수용 마우스는 4주 후에 대장염을 유발하기 위해 덱스트란 설페이트에 노출됩니다. 성공적인 이식은 유세포 분석으로 검증되며 결장 조직 손상은 조직학으로 평가합니다. 야생형 골수를 녹아웃 마우스에 이식할 때 대장염이 개선된다는 결과가 얻어졌습니다.

반대로, 대장염은 녹아웃 골수를 야생형 마우스에 이식할 때 악화됩니다. 이 방법은 염증 또는 감염에서 골수 유래 세포 또는 골수 유래가 아닌 세포의 유전자 발현을 결정하는 데 있어 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. C 57, 블랙 식스, 야생형 및 C 유도 녹아웃 마우스는 야생형 마우스와 녹아웃 마우스를 추적할 수 있도록 이 실험에 권장됩니다.

골수 이식 후 기증자 세포. CD 45.1 마우스를 사용하여 야생형 마우스를 나타내고 CD 45.2를 사용하여 녹아웃 마우스를 나타냅니다. 여기에 표시된 차트는 각 그룹에 대해 5개의 기증자 마우스와 10개의 수혜자 마우스가 할당된 실험 설정을 설명합니다.

그룹 A와 B의 경우, 야생형 마우스에서 녹아웃 마우스로 골수를 이식합니다. 대장염은 그룹 A에서 유도되지만 그룹 B에서는 유발되지 않습니다.그룹 C와 D의 경우 골수를 녹아웃 마우스에서 야생형으로 이식하고 대장염은 E와 F에 대해서만 그룹 C에서 유발됩니다. 이식은 야생형에서 야생형으로, 그룹 G와 H의 경우 이식은 녹아웃에서 녹아웃으로 진행됩니다. 방사선 조사된 마우스로 이식하기 위해 기증자 골수를 준비하려면 먼저 생물 안전 캐비닛에서 희생된 마우스의 뼈에서 골수를 추출합니다.

멸균 해부 기구를 사용하여 근육과 인대가 부착되지 않은 상완골, 대퇴골, 경골 및 비골 뼈를 노출시키고 페트리 접시로 옮깁니다. 뼈의 양쪽 끝을 잘라 붉은 골수를 보여줍니다. 그런 다음 집게로 뼈 중 하나를 잡습니다.

3밀리리터 주사기와 25게이지 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 붉은 골수를 다른 페트리 접시에 씻어냅니다. 그런 다음 다른 쪽 끝에서 뼈를 씻어내면 더 많은 골수 세포가 생성됩니다. 각 뼈에 대해 이 과정을 반복합니다.

야생형의 골수를 모아 쥐를 따로 쓰러뜨립니다. 18 게이지 1/2 인치 바늘이 달린 6 밀리리터 주사기를 사용하여 반복적인 흡인과 배출로 붉은 골수 마개를 부러뜨립니다. 그런 다음 혈청학 피펫을 사용하여 수집된 골수를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

골수가 모두 옮겨지면 골수를 740G에서 섭씨 4도에서 5분간 회전시킵니다. 스핀 후, 상등액을 버리고 5-10초 동안 볼텍싱하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 펠릿에 공여체 마우스 와류당 XRBC 용해 완충액 1개 5ml를 다시 5초 동안 첨가하고 실온에서 정확히 3분 동안 배양합니다.

3분 후, 각 튜브에 20ml의 차가운 PBS를 넣고 반전으로 혼합하여 용해를 중지합니다. 그런 다음 40미크론 셀 스트레이너를 통해 내용물을 새로운 50ml 원뿔형 튜브에 붓습니다. 원래 튜브를 5ml의 PBS로 헹구고 용액을 세포 여과기로 옮깁니다.

원뿔형 튜브에서 흐름을 계속 수집합니다. 그런 다음 PBS로 볼륨을 최대 50ml까지 가져오고 반전으로 혼합합니다. 다음으로, 혈구 분석기를 사용하여 trian blue exclusion에 의해 생존 가능한 세포 수를 결정합니다.

세포 수가 결정되면 골수 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 913배 G로 회전시킵니다. 스핀 후 총 세포 수에 따라 상등액을 제거합니다. Resus는 PBS에서 펠릿을 1 회 10에서 밀리리터 당 8 번째 세포로 현탁시킵니다.

이제 골수 세포는 방사선 조사를 받은 수용 마우스로 이식할 준비가 되었습니다. 이 실험을 위한 수용형 야생형 및 녹아웃 마우스는 첨부 문서에 설명된 대로 1000 rad를 조사했으며, 마우스는 방사선 조사 후 4시간에서 24시간 후에 병원체가 없는 시설에서 사육 및 수용됩니다. 수혜자 마우스를 구속기에 넣고 꼬리를 70% 에탄올로 닦아 주사 부위를 살균하고 국소 혈관 확장을 촉진하여 쉽게 주사할 수 있습니다.

28 및 반 게이지 바늘이 있는 인슐린 주사기를 사용하여 주사 후 각 마우스의 꼬리 정맥에 1-200마이크로리터의 7번째 세포에 10배를 1회 주입합니다. 주입 후 처음 4주 동안 최대 3마리의 다른 주입된 마우스와 함께 마우스를 케이지에 넣습니다. 주입된 수혜 마우스를 항생제 설파 트림이 포함된 물과 함께 오토클레이브 케이지에 유지합니다.

이를 통해 동물들이 면역력을 회복하고, 4일마다 우리, 항생제 처리된 물과 음식을 교체하여 위생을 유지할 수 있습니다. 방사선 조사와 골수 이식 4주 후, 항생제가 없는 일반 물로 바꾸고 쥐가 정상적인 장내 미생물을 회복할 수 있도록 2주 더 유지합니다. 골수 주사 6주 후 대장염을 유발하기 위해 초기 체중을 측정합니다.

대장염 실험 그룹의 마우스에게 음용수에 5%dextran sulfate를 제공합니다. 5일 후, 4마리의 쥐에서 채취한 말초 혈액을 액포 헤파린 코팅 튜브에 모아 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 300 마이크로 리터의 혈액과 300 마이크로 리터의 세포 염색을 결합하고 혈액을 완충 및 분취하여 얼음 위에 100 마이크로 리터로 각각 1-5 개의 라벨을 붙인 5 개의 유세포 분석 테스트 튜브로 만듭니다.

마우스를 희생 한 후 체중을 다시 측정하고 변화를 계산하십시오. 결장 조직을 절개하고 h 및 d 염색을 위해 포르말린을 투여합니다. 그런 다음 이전과 같이 골수 세포를 얻습니다.

재현탁된 골수를 각각 100ml라고 표시된 1-5개의 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다. 유세포 분석에 의한 분석을 준비하기 위해 첨부 문서에 설명된 대로 어두운 곳에서 각 튜브에 대한 항체 혼합물을 준비하며, 1번으로 표시된 혈액 및 골수 샘플은 대조군 역할을 하며 염색된 혈액 및 골수 샘플이 아닙니다. 2 번으로 표시된 것은 fitzy isotype control PE isotype control 및 CD 16 slash 32 blocking solution으로 염색됩니다.

이러한 isotype control은 1차 항체 결합 샘플의 특이성을 확인하는 데 사용됩니다. 3번으로 표시된 숫자는 FZ CD 45.1 및 CD 16 슬래시 32로 염색됩니다. 번호 4로 표시된 차단 용액 샘플은 CD 45.2 및 CD 16 슬래시 32로 염색됩니다.

차단 솔루션. 단색 라벨링은 혈액 또는 골수에 있는 기증자 또는 수혜자 세포의 존재를 드러낼 수 있습니다. 분명히 5 번으로 표시된 샘플은 CD 45.1, CD 45.2 및 CD 16 슬래시 32로 염색됩니다.

여기서 이중 색상 라벨링을 차단하면 혈액 또는 골수에서 기증자와 수혜자 세포의 상대적인 비율을 보여줍니다. 5마이크로리터의 항체 혼합물 2와 5를 각각의 샘플 튜브에 추가합니다. 그런 다음 3마이크로리터의 항체 혼합물 3과 4를 각각의 샘플 튜브에 추가합니다.

모든 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 각 튜브에 2ml, 하나의 XRBC 용해 완충액을 추가합니다. 그런 다음 어둠 속에서 얼음 위에서 15분 더 샘플을 배양합니다.

섭씨 4도에서 5분, 350배 G에서 셀을 스핀다운합니다. 스핀 후 상층액을 제거하고 펠릿을 500마이크로리터의 세포 염색 완충액으로 어둠 속에서 재현탁탁합니다. 그런 다음 잠시 소용돌이.

다음으로, 면역 염색 혈액 및 골수 샘플에 대해 유세포 분석을 수행합니다. 와일드 타입 CD 45.1을 나타내려면 FZ를 선택하고 녹아웃 CD 45.2를 나타내려면 PE를 선택합니다. Flo Joe의 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다.

fit E 대 PE 비율 또는 PE 대 fit e 비율의 비율을 계산하여 공여자 유전자형이 혈액 및 골수에서 우성 유전자형인지 여부를 결정합니다. 이 이미지는 정상 조직학 및 DSS 대장염이 있는 결장의 샘플 h 및 e 이미지를 보여줍니다. 조직학 이미지는 점막 조직 손상과 점막 및 점막하 조직으로의 호중구 침투를 기반으로 점수가 매겨집니다.

따라서 조직학 점수가 높을수록 대장염이 더 심하다는 것을 나타내며 lyin이 대장염 예방에 중요한 역할을 하는지 여부를 테스트합니다. 골수는 이 비디오에 설명된 대로 야생형 마우스와 녹아웃 마우스 간에 교환되었습니다. 그런 다음 조직학을 평가하고 여기에 표시된 대로 점수를 매겼습니다.

조직학 점수는 녹아웃 마우스 골수를 방사선 조사된 야생형 마우스에 도입했을 때 크게 증가했습니다. 반대로, 야생형 골수가 녹아웃 마우스에 도입되었을 때 점수가 크게 감소했습니다. 이러한 데이터는 골수 유래 세포의 내인성 C가 항염증 효과가 있고 대장염을 개선하여 이러한 마우스에서 이식이 성공적이었음을 입증한다는 것을 나타냅니다.

또한 이식 후 마우스의 골수와 혈액에 대해 유세포 분석을 수행했습니다. 와일드형 골수는 Fitz CD 45.1에 대해 강하게 염색되지만 pe, CD 45.2에 대해서는 강하게 염색되며, 여기에 표시된 바와 같이 녹아웃 골수는 PE에 대해 강하게 염색되지만 Fitz에는 그렇지 않습니다. 그러나 이식 후, 녹아웃 골수를 투여받은 야생형 마우스의 골수와 혈액 모두 PE에 대해 강하게 염색되었으나 Fitz는 그렇지 않았는데, 이는 염색된 세포의 우세한 집단이 기증자로부터 유래했음을 나타냅니다.

마찬가지로, 야생형 골수를 투여받은 녹아웃 마우스의 골수와 혈액은 fitzy에 대해 강하게 염색되었지만 PE는 다시 염색되지 않아 우세한 염색 집단이 기증자 기원임을 확인했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 골수 이식 실험을 수행할 수 있어야 하며 골수 유래 세포를 통해 대장염을 수정할 수 있어야 합니다.