플라즈마 단백질 보존을위한 혈액 수집 장비로부터 게놈 DNA를 추출하는 실제적이고 새로운 방법

본 영상에서는 P 100 튜브라고 불리는 새로운 BDP 100 혈장 단백질 보존 시스템에서 게놈 DNA를 추출하는 실용적이고 새로운 방법을 설명합니다. 혈청이나 혈장 튜브에서 DNA를 추출하는 것은 과거에 꽤 일반적인 절차였으나, 이 새로운 P 100 튜브와 본 영상에서 제시하는 추출법의 조합은 훨씬 적은 노력으로 더 우수한 품질의 DNA를 회수할 수 있는 새롭고 더 간편한 접근 방식을 제공합니다. P 100 튜브의 내부는 potassium EDTA 및 프로테아제 억제제로 코팅되어 있습니다.

이는 응고를 방지하고 혈장 단백질을 안정화합니다. 원심분리 후 테스트를 위해 혈장을 회수할 목적으로 이러한 튜브에 혈액을 수집합니다. P 100에 담긴 혈액은 밀도에 따라 층으로 분리되며, 상단에는 혈장, 하단에는 적혈구, 그리고 백혈구가 위치하게 됩니다.

이 두 층 사이에 Buffy coat가 위치합니다. 이러한 튜브는 일반적으로 혈장을 회수하기 위한 목적으로 주로 사용됩니다. 항체 및 단백질 수치와 같이 이 혈장을 이용해 여러 가지 측정을 수행합니다.

버피코트는 일반적으로 폐기되지만, 본 영상에서 보여주듯이 시퀀싱, 유전자형 분석, 바이오마커 식별 등을 포함한 여러 분석에 충분한 DNA를 함유하고 있습니다. P one hundreds는 캡, 튜브, 세퍼레이터의 세 가지 주요 구성 요소로 이루어져 있습니다. 기계적 세퍼레이터는 버피코트 층의 바로 위까지 이동합니다.

버피코트(buffy coat)에 접근하려면 세퍼레이터(separator)와 버피코트 사이의 거리를 넓혀야 합니다. 이는 17% sucrose를 첨가함으로써 수행됩니다. 버피코트는 보통 P 102와 함께 폐기되지만, 본 영상에서 보여주듯이, -80°C 냉동고에서 P 100 튜브를 꺼내기 전에 여러 분석 테스트를 수행하기에 충분한 양의 DNA를 이 층에서 쉽게 회수할 수 있습니다.

항온수조를 37°C로 예열한 다음, 각 P 100 튜브를 항온수조에 넣고 약 5분간 배양하여 모든 샘플을 해동합니다. 모든 샘플이 완전히 해동되면, 세퍼레이터 위에 남아 있는 혈청을 제거해야 합니다. 그 다음, 세퍼레이터 위에 17% sucrose 5 mL를 첨가합니다. sucrose를 첨가한 후, 모든 튜브를 2,500 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 이제 세퍼레이터가 튜브 상단으로 이동하여 버피 코트(buffy coat)로부터 분리되었으므로, 쉽게 제거할 수 있습니다.

화학용 와이프에 70% ethanol을 뿌린 후, 종이클립 후크의 전체 표면을 철저히 닦아 멸균합니다. 멸균된 종이클립을 사용하여 P 100 튜브를 45도 각도로 잡습니다. 분리기의 입구 부분을 부드럽게 위로 당겨 튜브 밖으로 꺼내기 시작하며, 이를 생물학적 위험물 폐기 봉투(biohazard bag) 안으로 안내합니다.

분리기를 제거한 후, 버피코트(buffy coat)나 적혈구 층을 건드리지 않도록 주의하며 17% sucrose 층을 최대한 제거합니다. 이제 버피코트가 튜브의 최상층이 되어야 합니다. 이 층을 라벨이 부착된 새로운 15 milliliter 원추형 바이알로 옮깁니다. 각 튜브에서 제거되는 버피코트의 부피는 다양하겠지만, 3 milliliter 미만이어야 합니다.

모든 튜브의 부피를 일정하게 맞추기 위해, 각 튜브의 부피가 3 mL가 되도록 PBS(인산염 완충 식염수)를 충분히 첨가합니다. 이제 모든 버피코트(buffy coat)가 동일한 부피로 현탁되었으므로, 9 mL의 적혈구 RBC 용해액을 첨가하여 남아 있는 적혈구를 제거해야 합니다.

다음으로, 용혈된 적혈구를 버피코트(Buffy coat)와 분리하기 위해 실온에서 10분간 배양하는 동안 튜브를 여러 번 뒤집어 줍니다. 2,500 G에서 5분 동안 원심분리하여 DNA를 추출할 펠릿(pellet)을 형성합니다. 각 튜브에서 폐액을 액체 생물학적 위험물 수거함에 붓고, 펠릿을 재현탁할 수 있는 소량의 액체만 남깁니다. 튜브를 볼텍싱(vortex)하여 펠릿을 떼어내어 재현탁합니다.

세포 용해액 3 mL를 추가하고 최소 10초 동안 격렬하게 볼텍싱합니다. 세포가 용해되면 단백질과 DNA가 용액 내에 자유롭게 부유하게 되므로 이를 분리해야 합니다. 먼저 단백질 침전액 1 mL를 사용하여 단백질을 침전시키고, 강한 강도로 최소 15초 동안 볼텍싱합니다. 그다음, 튜브를 2,500 G에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 펠릿화합니다.

적절하게 단계를 진행하십시오. 새로운 튜브로 처리될 각 샘플에 대해 15 mL 원추형 튜브에 각각 라벨을 붙입니다. 100% isopropanol 3 mL를 옮깁니다.

단백질을 침전시키고 원심분리하고 나면, 각 튜브에는 상대적으로 큰 펠릿과 투명하고 대부분 맑은 상층액이 형성되어야 합니다. 각 튜브의 DNA가 포함된 상층액을 마지막 단계에서 준비한 해당 이소프로판올 튜브로 디캔팅합니다. 이소프로판올은 용액 내의 DNA를 침전시켜 작고 하얀 실 같은 가닥을 형성하게 합니다. 모든 튜브를 50회 반전시켜 충분히 혼합한 다음, 모든 튜브를 2,500 G에서 3분 동안 원심분리하여 DNA 펠릿을 생성합니다. DNA는 보통 튜브 바닥에 작은 하얀 펠릿 형태로 보이지만, DNA 수율이 낮으면 눈에 보이지 않을 수 있습니다. 농도를 측정할 때까지 모든 추출 과정을 계속 진행합니다.

DNA 펠렛의 형성 여부와 관계없이 이소프로판올 상층액을 제거합니다. 70% ethanol을 첨가하여 DNA를 세척합니다. 이를 통해 이후 분석을 방해할 수 있는 잔류 불순물을 제거하며, 2,500 G에서 1분간 원심분리합니다. DNA 펠렛이 튜브 바닥에 잘 부착되도록 튜브 내의 70% ethanol을 모두 제거한 다음, 깨끗한 종이 타월 위에 뒤집어 놓아 1시간 동안 자연 건조합니다.

프로토콜을 계속 진행할 때 튜브에 눈에 보이는 에탄올이 남아 있어서는 안 됩니다. 추출의 마지막 단계는 DNA를 용액에 재현탁하는 것입니다. 대부분의 추출 과정에서는 DNA hydration solution 또는 물이 적절한 선택지입니다.

가시적인 DNA 실타래나 펠릿이 거의 또는 전혀 생성되지 않은 샘플의 경우, DNA 수화 용액을 250 µL 적게 추가하십시오. DNA를 부드럽고 단계적으로 볼텍싱하여 현탁시킵니다. 마지막으로, 현탁된 모든 DNA를 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 단계에서 NanoDrop 또는 다른 분광광도계를 사용하여 DNA의 농도와 순도를 측정할 수 있습니다.

일반적으로 DNA의 순도는 DNA 추출만을 목적으로 수집된 potassium EDTA 튜브의 전혈에서 직접 추출한 DNA의 순도와 유사할 것으로 예상됩니다. DNA 농도는 시작 물질의 양에 따라 달라지지만, µL당 50 ng에서 거의 1000 ng까지 범위가 넓으며 평균적으로 µL당 200 ng 범위에 있습니다. 이 프로토콜을 사용함으로써 얻는 이점은 두 가지입니다. 첫째, 임상의가 혈액을 두 번 채취하는 대신 한 번의 채혈로 두 가지 임상 검사를 수행할 수 있게 해줍니다.

둘째로, 이전 세대의 튜브 대신 현대적인 기계식 분리 튜브를 사용하여 DNA 함유 세포에 접근하는 과정을 간소화합니다. 이전 세대의 겔 분리 튜브에서는 겔 분리제 자체와 혈전이 모두 DNA 함유 세포의 장벽으로 작용했습니다. P 100 튜브의 경우, 17% Sucrose를 이용한 밀도 구배 분리법을 통해 기계식 분리제를 쉽게 제거할 수 있습니다.

이것은 일반적인 DNA 추출물의 나노드롭(NanoDrop) 측정 결과 스크린샷입니다. 샘플 P 109에 대해 이 방법을 사용하여 추출한 결과, 209 ng/µL 농도의 DNA 솔루션 250 µL를 얻었습니다. 총 수율은 약 52 µg였습니다.

DNA 순도의 주요 측정 지표인 260/280 비율은 1.88로, 최적 범위인 1.8에서 1.9 사이에 있었습니다. DNA 순도의 보조 측정 지표인 260/230 비율은 2.35로, 예상 범위인 2에서 2.2에 근접하였습니다.

이는 상당히 전형적인 결과입니다. 실제로 추출 수율과 품질은 표준 겔 전기영동과 티오브로마이드(thio bromide) 염색을 사용했을 때, 추출 전 혈액의 양과 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 추가 품질 테스트 결과, P 100 튜브에서 추출한 게놈 DNA는 전혈에서 추출한 DNA만큼 온전한 것으로 나타났습니다.

이는 genomic DNA가 포함된 각 레인의 상단에 나타나는 밝고 두꺼운 밴드를 통해 확인할 수 있습니다. 이전 방법 대신 이 프로토콜을 사용하면 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 일반적으로 두 번 수행해야 하는 채혈 과정을 한 번으로 통합할 수 있습니다.

둘째로, 본 프로토콜은 일반적인 SST 젤 분리관을 사용하는 프로토콜보다 더 빠르고 깔끔합니다. 응고된 혈액을 주기적으로 분리해야 하는 필요성을 제거함으로써, 임상의는 유전학 및 혈청학적 검사가 필요한 경우 두 개의 혈액 채취관을 사용합니다. 일반적으로 골드 탑이라고 불리는 SST 젤 분리관과 퍼플 탑이라고 불리는 potassium EDTA 관을 사용하는데, SST 관에서는 혈청을 분리하고 퍼플 탑 관에서는 DNA를 추출합니다. 본 방법을 사용하면 단 하나의 레드 탑 P 100 관만 채취하면 됩니다.

DNA 추출을 위한 겔 분리법에 익숙한 기관에서는 이미 혈청학적 검사와 유전학적 검사를 위해 하나의 튜브를 사용하고 있을 수 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 기존의 겔 분리법보다 점진적이지만 실질적인 개선이 이루어진 방식입니다. 두 방법 모두 어떤 형태의 분리물을 제거해야 하지만, 겔은 플라스틱 겔보다 더 지저분해지는 경향이 있습니다.

분리 튜브를 사용하려면 DNA 추출 전에 와이어 메시를 통해 응고된 혈액을 균질화해야 합니다. 이러한 균질화 과정은 번거로울 수 있으며, DNA가 없는 적혈구가 상당량 존재할 경우 DNA 추출이 더 어려워집니다. 이 P 100 추출법은 DNA를 함유한 백혈구를 헤마토크릿으로부터 분리하여, DNA 추출을 방해하는 적혈구를 거의 남기지 않게 해줍니다.

이전 세대의 겔 분리 튜브 대신 P 100 혈장 튜브에서 DNA를 회수하는 이 시스템은 많은 장점이 있습니다. P 100 튜브에는 마그네슘 의존성 엔도뉴클레아제를 억제하는 EDTA와 혈액 응고를 방지하는 항응고제가 포함되어 있습니다. 결과적으로 응고된 혈액을 부수고 균질화하는 과정을 피할 수 있어, 훨씬 더 간편한 추출 프로토콜을 통해 더 높은 DNA 무결성을 얻을 수 있습니다.

또한, 혈장 제거 혈액은 DNA 추출이 필요할 때까지 최대 3년 동안 P one hundreds에 보관할 수 있습니다. 나아가, 임상의는 더 적은 횟수의 채혈로 더 유용한 환자 데이터를 생성할 수 있으며, 결과적으로 시술을 받는 환자의 스트레스를 줄일 수 있습니다.