두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

이 절차의 목적은 정의된 배양 조건 하에서 두개골 meen chiming 배양물의 거동을 모니터링하는 것입니다. 첫 번째 단계는 임신 시기가 조절된 마우스로부터 자궁각을 수집하는 것입니다.

coum 후 8.5일이 경과한 시점입니다. 분리된 배아를 탈락막에서 제거하고, 유전자형 분석을 위해 난황낭을 제거합니다. 다음으로, 두개부 메쉬 식물을 미세 절제하여 세포외 기질이 코팅된 조직 배양 플레이트에 옮깁니다.

X 조직편을 부착시킨 후, 특정 약물의 처리 여부에 따라 최대 48시간 동안 배양합니다. 최종적으로 조직편의 이미지를 촬영하여 세포 이동의 차이를 확인합니다. 이 방법은 신경배 fold 상승 과정에서 두개골 형성에 관여하고 그 행동을 조절하는 신호 전달 경로와 세포외 기질 단백질이 무엇인지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 유용합니다.

미세절제술 단계는 학습하기 어렵고 숙달하기 위해 인내심과 연습이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선 면역조직화학 염색을 수행할 예정이라면 커버슬립을 준비하고, 그렇지 않은 경우에는 이 단계를 생략하고 조직 배양 플레이트에 ECM을 직접 코팅하십시오. 12 mm 원형 유리 커버슬립을 에탄올에 담가 멸균한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로 멸균된 커버슬립을 12 웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.

라미나 플로우 후드 내에서 1 mL의 extracellular matrix(ECM)를 사용하여 커버슬립이나 조직 배양 플레이트 바닥을 코팅합니다. 플레이트를 37 °C에서 3시간 동안 배양한 후, ECM 용액을 흡입하여 제거하고 PBS로 3회 세척합니다. 이 단계에서 코팅된 플레이트는 즉시 사용하거나, 랩으로 감싸 4 °C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.

반투명한 배아를 시각화하는 데 도움을 줍니다. 제조사의 프로토콜에 따라 내성이 있는 검은색 배경의 Sylgard 플레이트를 준비합니다.

핀 홀더에 미세 핀을 꽂아 해부 도구를 준비합니다. 모든 준비가 완료되면 샤프닝 블록을 사용하여 핀셋을 날카롭게 다듬습니다. quot 후 8.5일이 지난 임신 시점이 맞춤화된 마우스로부터 자궁을 채집합니다.

분리한 자궁을 멸균된 PBS가 담긴 디쉬에 넣고 세척합니다. 해부 현미경 하에서 포셉과 가위를 사용하여 개별 탈락막을 분리합니다. 압력이 가해져 배아가 탈락막에서 튀어나오지 않도록 주의하며, 찢는 동작으로 자궁 결합 조직을 제거합니다.

포셉을 사용하여 태반 반대편의 자궁 조직을 조심스럽게 찢습니다. 난황낭에 둘러싸인 배아를 노출시키기 위해, 포셉으로 배아와 난황낭을 태반에서 집어 올려 자궁 조직을 디쉬에서 제거합니다. 다음으로, 포셉으로 부드럽게 찢어 배아에서 난황낭을 제거합니다.

피펫을 사용하여 분리한 난황낭을 제노타이핑을 위해 에펜도르프 튜브에 넣고, 체절 수를 세어 배아의 단계를 결정합니다. 이상적으로 배아는 6개에서 10개 사이의 체절을 가지며, 이는 대략 6~10단계에 해당합니다. 이 단계에서는 신경절이 막 융기하기 시작하며, 두개 중배엽의 주요 형태 형성 과정은 아직 일어나지 않은 상태입니다.

배아의 단계가 결정되면, 페놀 레드(phenol red)가 포함되지 않은 DMEM이 들어있는 검은색 셀 가드 플레이트로 배아를 옮깁니다. 먼저 가능한 최고 배율의 해부 현경하에서, 양손에 해부용 바늘을 잡고 배아의 머리 부분에 초점을 맞춘 뒤, rmba 부위의 앞쪽에서 머리를 절단합니다. 다음으로, 중앙선을 따라 이분할하도록 절단합니다.

양손에 해부용 바늘을 잡고 머리를 두 개의 동일한 절반으로 분리합니다. 배아 머리의 가장자리와 정중선을 따라 외곽 부분을 절개합니다. 원하는 설명 부위가 원치 않는 조직과 혼동되는 것을 방지하기 위해 필요한 부분을 제거합니다.

설명체(explan)에는 이동 중인 두개 신경능, 축방향 중배엽 및 표면 외배엽이 포함되어 있으며, 느슨하게 부착된 세포들을 제거해야 합니다. 200 µL 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 피펫팅하십시오. 그런 다음, 피펫 팁으로 설명체를 조심스럽게 집어 올리십시오.

코팅된 조직 배양 웰 중앙에 약 10 µL의 DMEM을 넣고, 15% FBS가 첨가된 따뜻한 DMEM 20 µL를 추가한 후, 배양 접시를 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 약 1~2시간 후, 외식편(explant)이 부착되면 배지를 250 µL 더 추가할 수 있습니다. 약 24시간이 지나면 외식편이 커버슬립에 단단히 부착됩니다.

이 시점에서 24시간이 더 지난 후 배지에 약물을 추가할 수 있으며, 세포들이 이로부터 이동하게 됩니다. 일반적으로 이동한 세포의 수와 거리를 기록하기 위해 이미지를 획득합니다. 이 단계에서 배양 시간이 길어짐에 따라 세포의 생존력이 감소하는 징후가 나타나기 시작합니다.

다음은 두개낭과 닭의 배아 조직에서 이동하는 세포들의 예시입니다. 48시간 동안 서로 다른 기질에서 배양했을 때, 절편에서 이동하는 세포의 모양과 크기는 모두 기질에 따라 달라집니다. 세포 이동은 fibronectin, laminin, matrigel, ECM, 그리고 hyaluronic acid 상에서 지원되었습니다.

이 절차에 따라, 면역형광법 및 라이브 이미징과 같은 다른 방법들을 사용하여 신경절 상승 동안 두개부 중배엽의 거동을 조절하는 경로를 추가로 탐색할 수 있습니다.