두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

이 절차의 목적은 두개골 미명 배양의 행동을 모니터링하는 것입니다. 정의된 배양 조건에서. 첫 번째 단계는 시간이 지정된 임신한 쥐에서 자궁 뿔을 채취하는 것입니다.

쿵쿵 후 8.5일. 일단 분리되면, 배아는 decidua에서 제거되고 난황낭은 유전형 분석을 위해 제거됩니다. 다음으로, 두개골 메키 식물을 미세절개하여 세포외 기질로 코팅된 조직 배양판으로 옮긴다.

X 외식은 부착된 것이 허용되며 정의된 약리제의 유무 하에 최대 48시간 동안 배양됩니다. 최종적으로, 세포 이동의 차이를 보여주기 위해 explan에서 이미지를 촬영합니다. 이 방법은 관련된 신호 경로 및 세포 외 기질 단백질이 무엇인지와 같은 주요 질문에 답하고 신경 주름 상승 중 종류를 사용하여 cran의 행동을 제어하는 데 유용합니다.

미세해부 단계는 배우기 어렵고 숙달하기 위해 인내와 연습이 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저 면역조직화학을 수행할 경우 커버 슬립을 준비하고, 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고, 조직 배양 플레이트를 ECM 멸균 12mm 원형 유리 커버 슬립으로 직접 코팅합니다. 자연 건조시키십시오. 다음으로 멸균된 덮개 슬립을 12웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.

1밀리리터의 세포외 기질 또는 ECM의 라이나 후드에서 작업하여 커버 슬립 또는 조직 배양 플레이트의 바닥을 코팅합니다. 배양 후 3시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 ECM 용액을 흡입한 다음 PBS에서 3회 세척합니다. 이 시점에서 코팅된 플레이트는 즉시 사용하거나 포장하여 최대 2주 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

반투명 배아를 시각화하는 에이드. 저항력이 강한 검은 색 배경의 실 가드 플레이트가 준비됩니다. 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.

핀 홀더에 미세한 핀을 삽입하여 해부 도구를 준비합니다. 모든 것이 준비되었을 때 샤프닝 블록을 사용하여 집게를 날카롭게 하십시오. 인용문 후 8.5일 동안 시간이 지정된 임신 마우스에서 자궁을 수집합니다.

격리된 자궁을 멸균 PBS가 있는 접시에 넣고 씻습니다. 해부 현미경으로 들어가면 집게가 있는 가위를 사용하여 개별 낙엽을 분리합니다. 찢어지는 동작으로 자궁 결합 조직을 제거하고, 압력을 가하지 않도록 주의하고 배아를 데시두아에서 튀어나오게 하지 않도록 주의합니다.

집게를 사용하여 태반 반대쪽의 자궁 조직을 조심스럽게 찢습니다. 난황 자루에 담긴 배아를 노출시키려면 집게를 사용하여 태반에서 배아와 난황 자루를 꼬집고 접시에서 자궁 조직을 제거합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 배아에서 난황 자루를 부드럽게 찢습니다.

피펫을 사용하여 유전형 분석을 위해 노른자 자루를 에펜도르프 튜브에 넣고, 분리된 후 소마이트를 계수하여 배아를 단계화합니다. 이상적으로, 배아는 6에서 10 사이가 될 것이고, 따라서 단계도 마찬가지일 것이다. 이 단계에서 신경 주름은 막 상승하기 시작했으며 두개골 간엽의 주요 형태 형성은 아직 발생하지 않았습니다.

단계가 결정되면 페놀 레드가 없는 DMEM이 포함된 검은색 세포 보호판으로 배아를 이식합니다. 먼저 가능한 가장 높은 배율의 해부 현미경으로 양손에 해부 바늘을 들고 배아의 머리에 초점을 맞추고 rmba meres 앞쪽의 머리를 절개합니다. 다음으로, 정중선을 따라 bi로 자릅니다.

양손에 박리 바늘을 사용하여 머리를 두 개의 동일한 반으로 절부합니다. 배아 머리와 정중선의 가장자리를 따라 바깥쪽 가장자리를 절개합니다. 원하는 explan과 원치 않는 조직을 혼동하는 것을 방지하기 위해 필요한 a를 제거합니다.

Explan은 느슨하게 부착된 세포를 제거하기 위해 이동하는 두개신경능선, 두개배엽 및 표면 외배엽을 포함합니다. 200 마이크로 리터 피펫 팁으로 조심스럽게 위아래로 피펫을 만듭니다. 그리고 Pepin의 경우 피펫 팁으로 엑스플랜을 조심스럽게 집어 듭니다.

약 10마이크로리터의 DMEM이 코팅된 조직 배양의 중앙에 배치되고 15% FBS가 보충된 20마이크로리터의 따뜻한 DMEM에서 배양 접시는 이제 조직 배양 인큐베이터로 옮겨질 수 있습니다. 약 1-2시간 후에 엑스플랜이 부착되고 250마이크로리터의 매체를 추가로 추가할 수 있습니다. 약 24시간이 지나면 엑스플랜이 커버 슬립에 단단히 부착됩니다.

이때, 약리학적 제제는 추가로 24시간 후에 배지에 첨가될 수 있으며, 세포는 그로부터 이동할 것입니다. 이미지는 일반적으로 세포에서 이동하는 세포의 거리와 수를 문서화하기 위해 획득됩니다. 이 시점에서, sinces는 더 긴 잠복기가 보이며 생존력이 감소하는 징후를 보이기 시작합니다.

다음은 두개골 Me와 chix 식물에서 이동하는 세포의 예입니다. 서로 다른 기질에서 48시간 후, 엑스플랜에서 이동하는 세포의 모양과 크기는 모두 이에 따라 달라집니다. 기질 이동은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 맥스 겔(max gel), ECM 및 히알루론산(hyaluronic acid)에서 지원되었습니다.

이 절차에 따라 면역형광 및 라이브 이미징과 같은 다른 방법을 사용하여 신경 주름 상승 중 두개골 잉킨의 행동을 조절하는 경로를 추가로 조사할 수 있습니다.