뼈 전이의 모델

본 절차의 전반적인 목표는 뼈 내에서 종양 세포의 성장을 유도하고 그에 따른 뼈 파괴를 일으키도록 종양 세포를 주입하는 것입니다. 이는 먼저 차가운 PBS에서 종양 세포를 재현탁하여 얼음에 놓아둠으로써 수행됩니다. 그다음, 적절한 수의 세포를 마취된 마우스의 좌심실 또는 경골에 주입합니다.

그 후, 여러 영상 기술을 통해 골종양의 성장과 골 파라미터를 종단적으로 모니터링합니다. 마지막으로, 종양 및 골 파라미터의 종점 정량을 수행합니다. 최종적으로, in vivo 및 ex vivo 형광 또는 발광 2D 방사선 촬영 3D의 조합이 이루어집니다.

종양의 성장과 골 미세환경의 변화를 세포 및 성장 구조 수준에서 보여주기 위해 Micro CT와 조직학적 분석이 사용됩니다. 이러한 방법들은 유방암과 전립선암의 전이성 군집 형성을 가능하게 하는 골 조직 내의 요인이 무엇인지와 같은 암 전이 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 준비 과정은 제 실험실의 연구 보조원인 Alisa Merkel이 시연할 예정이며, 세포는 1주일 미만으로 유지합니다.

GFP 태그가 부착된 MDA-MB-231 클론을 10% FBS와 0.1 mg/mL Penicillin streptomycin이 포함된 DMEM에서 37 °C, 5~8% CO₂ 조건으로 배양합니다. 세포가 80~90% 밀도(confluence)에 도달하면 1:10 비율로 희석하여 계대 배양합니다. 접종을 위한 세포 준비를 위해, 세포 밀도가 80~90%일 때 0.15% trypsin EDTA 10 mL를 사용하여 트립신 처리(trypsinization)를 수행합니다.

10% FBS가 포함된 ice-cold DMEM을 사용하여 세포를 즉시 50 mL conical tube로 옮기고 5분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 25 mL의 칼슘 및 마그네슘이 없는 ice-cold PBS가 담긴 50 mL conical tube에서 재부유시킨 후 세포 수를 측정합니다. 심장 내 접종용으로는 10⁶ cells/mL, 경골 내 주사용으로는 250,000 cells/mL의 농도가 되도록 ice-cold PBS로 세포를 재부유시킵니다.

이 실험에는 주사 5~10일 전부터 Tela 29 20 x 식단을 섭취한 4~6주령의 면역 결핍 암컷 마우스를 사용합니다. 2.5% isof fluorine이 든 챔버에서 마우스를 마취시킨 후, 환기 후드 아래의 노즈 콘으로 옮겨 마우스를 배면으로 위치시킵니다. 10% povidone iodine 용액으로 가슴 부위를 세척한 후, 70% Ethanol로 닦아냅니다.

흉골 절흔과 검상돌기 상단 사이의 중간 지점이자 흉골에서 약간 왼쪽에 주사 위치를 표시합니다. 다음으로, 300 µL 용량의 28 gauge 0.5인치 인슐린 주사기를 사용합니다. 한 손으로 마우스의 피부를 팽팽하게 잡은 상태에서, 플런저와 액체 표면 사이에 공간을 만들기 위해 공기를 약간 흡입한 후, 세포 현탁액 100 µL를 흡입합니다.

바늘을 수직으로 세운 상태로 유지하며 삽입하십시오. 좌심실에 성공적으로 삽입되면 시린지에 선명한 밝은 빨간색의 혈액 맥동이 나타납니다. 이 깊이에서, 심장을 찌르거나 세포가 흉강으로 쏟아지는 것을 방지하기 위해 바늘을 크게 움직이지 말고 시린지의 플런저를 조심스럽게 누르십시오. 세포가 흉강으로 떨어지는 것을 줄이려면 플런저를 약간 위로 당겨 소량의 음압을 형성하십시오.

그 다음, 바늘을 제거하는 동안 바늘이 기울어지지 않도록 주의하며 흉부에서 수직으로 뽑아냅니다. 바늘이 기울어지면 심장 내막이 찢어져 출혈이 발생할 수 있습니다. 출혈을 줄이기 위해 주사 부위를 약 1분 동안 가볍게 압박합니다. 노즈콘을 제거하면서, 마우스가 완전히 의식을 회복할 때까지 가열 패드 위로 옮겨줍니다.

경골 내 시술 직전에 마우스에 bup printex를 주입합니다. 마우스를 마취시키고 노즈콘(nose cone)에 배치한 후, 양쪽 다리를 10% povidone iodine로 세척하고, 이어서 에탄올을 사용하여 네 손가락과 엄지손가락 방향으로 닦아냅니다.

외측 복사뼈, 내측 복사뼈 및 경골의 하단부를 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 무릎이 보이고 접근 가능하도록 다리를 굽힙니다. 70% ethanol을 사용하여 피부를 적셔 하부의 슬개인대 가시성을 높입니다. 발목을 단단히 잡은 상태에서 슬개인대는 뚜렷하고 굵은 흰색 선으로 보여야 합니다.

28게이지 1/2인치 바늘을 슬개골 아래, 슬개골 인대의 중앙을 통해 경골 상단의 전방 횡간 구역으로 삽입합니다. 약간의 드릴링 동작과 함께 일정하고 강한 압력을 가하여 바늘이 성장판을 조심스럽게 통과하도록 유도합니다. 경골 성장판을 관통하면 바늘에 느껴지는 저항이 현저히 감소합니다.

바늘을 부드럽게 측면으로 움직여 바늘이 경골 내에 있으며 성장판을 통과했는지 확인하십시오. 바늘이 경골 내 적절한 위치에 있다면 움직임이 제한될 것입니다. 플런저를 천천히 눌러 10 µL의 세포 용액을 주입하십시오.

이 시점에서는 저항이 거의 느껴지지 않아야 합니다. 그런 다음 바늘을 천천히 뽑으십시오. 마우스의 마취를 중단하고, 회복될 때까지 가열 패드 위에 두십시오.

마우스를 주 2~3회 모니터링합니다. 루시페라제, GFP 형광 및 x-ray와 같은 다양한 영상 기법을 마취된 마우스에 실시합니다. 형광은 종양 부위를 나타냅니다.

병변의 위치를 파악하기 위해 estron 스캔을 사용합니다. 해당 병변들은 형광 이미지와 일치합니다. 영상 촬영 기술에 대한 자세한 내용은 본 프로토콜의 서면 부분에서 확인할 수 있습니다.

주입 후 21~35일이 지나면, IACUC 승인 방법으로 마우스를 희생시키고 뼈를 4% Formalin에 보관합니다. 분리된 뼈를 사용하여 micro CT 및 hematoxylin 및 DSN 염색을 통한 조직 형태 분석으로 ex vivo 분석을 수행합니다. 자세한 내용은 종양 세포의 심장 내 또는 경골 내 접종 후 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.

마우스는 방사선 촬영과 형광 또는 발광법을 통해 매주 모니터링합니다. 병변은 보통 2주에서 3주 사이에 x-ray로 확인됩니다. 여기에서 보여주는 모델에 따라 2주차만큼 빨리 형광 및 발광으로 보일 수도 있지만, 병변은 뼈 내의 어두운 구멍으로 관찰되며 시간이 지남에 따라 더 뚜렷해질 수 있습니다. 병변은 방사선 사진과 형광 이미지의 metamorph 분석을 사용하여 정량화했습니다.

maestro 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화하였습니다. 이 그림에서 골 손실은 micro CT 분석으로 정량화되었습니다. micro CT 측정으로부터 얻은 골 구조 및 무기질 데이터는 건강한 뼈와 종양 발생 뼈의 3D 이미지로 렌더링되었으며, 여기서 뼈 파괴 영역은 빈 공간으로 표시됩니다.

그 후 샘플에 대해 조직 형태 기하학적 분석(Histo morph geometry)을 수행하여 종양 부하량과 조직 대비 골 부피(bone volume to tissue volume)를 측정하였습니다. 이러한 절차를 수행할 때는 인내심을 가지고 각 마우스의 배치를 세심하게 조정하며 마우스의 상태를 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 마우스가 죽기 시작한다면 세포 응집(cell clumping)으로 인한 가능성이 높으므로 즉시 새로운 세포를 준비해야 합니다.

가장 주의해야 할 점은 절차를 서두르거나 조급해하는 것입니다. 더 많은 연습과 시간이 지나면 숙련도가 높아지고 작업 속도도 빨라질 것임을 기억하십시오. 이러한 기술들의 개발은 암 연구자들이 생체 내(in vivo)에서 골전이를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.