Name: 인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 배우세요 인간 태아 신경 전구세포를 올리고덴드로사이트로 분화시키는 세포 배양 기법을. 이 방법은 지지세포 없이 순수한 올리고덴드로사이트 집단을 생성하여 탈수초성 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 보건원, NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. 저자는 편집을 돕기 위해 현미경과 파멜라 C.의 체질을 돕기 위해 분자 의학 및 신경 과학, 릭 Dreyfuss의 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다.

참고 : 신경 전구와 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 세포의 일상 배양를 들어, 부화는 37 번 ° C humidified 5 % CO 2 분위기에서 이루어집니다. 모든 2 일, 매체는 문화가 40~70%의 합류 경우 신선한 매체의 50~100%를 사용하여 대체됩니다. 근처 confluency의 시간에서, 문화는 보통 주간 일정에 2-2.5e6/T75 플라스크에 passaged 있습니다. 1. 코팅 휴대용 술병을 준비 <ol><li> 코팅 플라스크 그런 다음 탈 이온수 (DI 물)와 코트 T75 플라스크를 100 ML에 폴리-D-리신 (PDL)의 5 밀리그램을 희석 준비 50 μg / 어둠 속에서 실온 (RT)에서 PDL의 ML. 1 ½ 시간 후, PDL을 기음과 DI-물에 한 번 플라스크를 씻어. 세포를 (표 1) 퍼 뜨리고 전에 건조 플라스크합시다. </li></ol> 2. 전구 - 파생 Oligodendrocytes (PDO)로 신경 전구 세포의 차별화를 시작 에 대한 프로토콜입니다인간 CNS의 전구 세포를 olate 것은 이전 발행물에서 설명하고이 프로토콜 1의 일부가 아닙니다. 인간 CNS의 전구 세포는 NIH 지침에 따라 취득 8 주 회임 태아 뇌의 telencephalon에서 고립되었다. <ol><li> 25 NG / ML bFGF의 20 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF) (그림 1A)를 보충 neurobasal 중간에 PDL 코팅 플라스크에 신경 전구 세포의 multipotential 인구 성장. 통로 11 (p11)보다 높은 경우를 사용하지 마십시오. </li><li> 문화가 약​​ 70 % 합류 할 때 신경 전구 세포를 차별화 할 시작합니다. </li><li> 소 혈청 알부민, L-글루타민, gentamicin, N2 부품, T3, 쉬, NT-3, bFGF, 그리고 PDGF-AA (표 1) 보충 혈청이없는 DMEM / 햄 F12 1:1 매체를 사용하여 완벽한 차별화 oligodendrocyte 미디어를 확인 . 이 매체는 성장 요인 (oligo 중간 + GF)와 oligo 매체로 정의됩니다. </li><li> progen를 제거플라스크에서 itor 미디어와 한 번 세포를 씻어 인산염 버퍼 생리 (PBS)가 다음 oligo 매체를 추가 + GF oligodendrocyte 차별화를 시작합니다 (2.3에서 설명 내용). oligodendrocytic 혈통 위해 최선을 다하고 만 셀 (그림 1B) 성장합니다. 3 주 동안은이 매체의 문화 셀을. </li><li> 매주, 전지 90-95%의 합류, 통로들이 트립신 (0.05 %) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.1 %) (T75 플라스크 4 ML)을 사용하여에있을 때. 50 ML 원뿔 튜브에 passaged 할 셀에서 전체 미디어를 전송,이 완비 된 매체는 트립신을 해소하는 데 사용됩니다. 세포를 건조하지 있는지 확인하십시오. 그런 다음 트립신을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 셀 부대를 지원하기 위해 플라스크를 여러 번 도청, RT에서 5 분에 트립신의 세포를 배양. </li><li> 분리 된 세포와 병에 설치된 매체의 4-5 ML을 추가하여 트립신을 해소. </li><li> 같은 50 ML 원뿔 튜브로 매체와 세포를 전송합니다. 1200 RPM (~에서 매체와 세포를 원심 분리기300 XG) RT에서 5 분을위한. </li><li> 표면에 뜨는을 대기음, 부드럽게 튜브를 팁, 세포 펠렛을 resuspend하고 신선한 oligo 매체 + GF를 추가합니다. 부드럽게 피펫 매체와 세포 위아래로는 단일 세포 현탁액을 확인합니다. </li><li> 각각의 새로운 PDL 코팅 T75 플라스크에 세포, 및 전송 2.5e6를 계산합니다. </li></ol> 3. Oligodendrocytes의 차별화에 마지막 단계 <ol><li> oligo 중간 + GF, 세포가 70~80%의 합류에 있습니다의 문화 3 주 후, 차별화의 마지막 과정 (그림 1C)를 시작합니다. </li><li> oligo 매체 + GF과 같은 방식으로하지만, 네 개의 GF를 추가하지 않고 미디어를 준비 : 쉿, NT-3, bFGF와 PDGF-AA. GF - 네 개의 GF없이 해당 매체는 oligo 매체로 정의됩니다. </li><li> 술병에서 oligo 매체 + GF를 대기음, PBS로 한 번 씻어하고 매체 16 ML의 총 볼륨을 추가 oligo 매체입니다 ¾ (12 ML)의 - GF와 ¼ (4 ML) PDN이 설치된 매체입니다에 대해 6-10 일). PDN에서 설치된 매체의 사용은 차별화 과정이나 세포의 생존에 중요한되지 않습니다. 우리는 실제로 공동 문화 실험에서 PDN 세포와 PDO 만 직접 접촉 PDO의 생존의 길이에 영향이 있다고 관찰했다. oligo 매체의 생존 시간 - PDO 세포가 PDN 세포와 공동 배양하는 경우 GF는 2 ~ 3 주에 연장 할 수있다. PDN에 인간의 신경 전구 세포를 차별화 할 수있는 프로토콜은 이전 발행물에서 설명하고이 프로토콜 1의 일부가 아닙니다. 여러 프로세스 (그림 1D)와 세포의 점진적 차별화 된 문화의 문화 중간 결과에서 성장 인자의 탈퇴. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 분석 유동 세포 계측법 분석은 부모 인구의 사람들과의 관계에서 차별화가 진행되는 동안 oligodendrocyte 마커의 인수를 비교합니다. <ol><li> 신경 프로를 사용컨트롤로 genitors. oligo 중간 + GF의 폴리-D-라이신과 코팅이 T75 플라스크에 2.5x10 6 셀의 씨앗 PDO 세포. </li><li> GF - 다른 플라스크는 oligo 매체가 있었을 때 일주일 후, 세포 생존을위한 제어 문화 플라스크에 신선한 oligo 매체 + GF와 매체를 교체하십시오. </li><li> 두 미디어에서 PDO 세포를 떼어 놓다하려면 20 U / papain의 ML과 트립신하지를 사용합니다. papain은 세포 형태를 보존 해리 동안 세포에 gentler 효과가 있기 때문입니다. </li><li> papain의 유리 병에 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)의 5 ML을 추가합니다. 10 분 또는 papain이 완전히 용해 및 솔루션을 분명히 나타납니다 때까지 37 ° C에서 약을 놓으십시오. 이 세포를 떼어 놓다하는 데 사용되는 papain 솔루션입니다. </li><li> Deoxyribonuclease I (DNase) 유리 병 (표 1)에 EBSS의 0.5 ML를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. 용해 papain의 약병이 솔루션의 0.25 ML을 추가합니다. 이 준비는 약 20 U / ML papain과 0의 최종 농도를 포함0.005 % DNase. </li><li> 15-30 분을위한 37 ° C에서 세포와 배양에 장소 papain 솔루션 (위에서 설명), 현미경을 사용하여 세포의 부대를 모니터링 할 수 있습니다. 와 함께 또는 7 분에 1,200 RPM의 GF와 원심 분리기가없는 매체의 5 ML로 반응을 중지합니다. </li><li> 두 개의 서로 다른 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 두 플라스크에서 세포 알약을 전송하고 정상 생리 매체 (NPM : 145 MM NaCl, 5 MM KCl, 1.8 MM CaCl 2, 10 밀리미터 Hepes 10 MM 포도당)로 씻어 1 MG / ML로 보충 소 혈청 알부민 (NPM + BSA). </li><li> 표면이 4에 immunostaining 수행 ° GalC (표 2), A2B5, O4에 대한 구체적이고 적절하게 titrated 차 항체를 사용하여 20 분에 C. </li><li> 5 분에 대해 4 ° C에서 NPM + BSA와 세포를 깨끗이 씻어 20 분 (표 2)에 대해 4 ° C에서 특정 보조 항체로를 품다. </li><li> nestin, glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 클래스 III 및 수 등의 세포 항원을 착색하기타, - tubulin과 myelin 기본 단백질 (MBP) (표 2), RT 20 분 동안 2 % paraformaldehyde (PFA)에 셀을 수정하고 -20 ° C. 15 분 동안 차가운 70 % 에탄올로 permeabilize </li><li> 1X PBS로 세포를 씻어하고 특정 보조 항체 (표 2)에 품다. </li><li> 유동 세포 계측법 분석하는 동안 그대로 세포와 subcellular 부스러기 사이에 차별하기 위해 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (생명 기술, 그랜드 아일랜드, NY)으로 세포를 얼룩. </li><li> 위의 프로토콜을 최적화에서, 우리는 각 immunoreagent의 특이성을 확인하기 위해 모든 적절한 제어 실험을 수행했습니다. 간단히 직접 레이블 항체를 들어, 적절한 대조군은 기본 항체 (즉, isotype 제어)와 같은 면역 글로불린 isotype 클래스 (또는 서브 클래스)와 fluorochrome 켤레의 직접 복합 항체했다. 차 항체의 간접 immunostaining, 적절한 대조군 w에 대한특히 차 항체가 생성 된에서 호스트의 면역 글로불린 클래스 (또는 서브 클래스)를 목표로 관심 fluorochrome에 복합 보조 항체 있습니다. 여러 호스트 (마우스, 토끼, 닭)의 기본 항체를 함께 사용되었을 때, 우리는 일반적으로 최소화하기 위해 상호를 다른 호스트에서 면역 글로불린에 대한 교차 adsorbed 된 사용되는 각 호스트 및 각 보조 항체의 주요 항체을 대상으로 보조 항체를 사용 immunoreactivity를 개최했습니다. 긍정적 인 컨트롤이 항원에 대한 특정의 기본 항체를 직접 또는 간접적으로 immunoreactions을 사용하여 관심있는 항원을 표현하는 것으로 알려진 세포 준비를 직접 또는 간접적으로 immunostaining이 포함되어 있습니다. 위의 최적화 방법은 실험을 immunostaining의 각 유형에 대해 한 번 수행되었습니다. 제어 immunoreactions는 기본 및 보조 항체 중에서 더 큰 크로스 에피토프 immunoreactivity을 공개하지 않습니다. 유동 세포 계측법은 균일하게 수행되었다488 나노 미터, 647 나노 미터로 조정 여기 파장을 제공 세 레이저가 장착 FACVantage SE 셀 정렬 (BD Biosciences, 산호세, CA), 그리고 폭 넓은 UV (351-364 nm 정도) (그림 2)를 사용하여 정지 휘황 표시 셀 . </li></ol> 5. Immunofluorescence 분석 참고 : immunofluorescence 실험 PDO는 oligo 중간 + GF 또는 oligo 매체에 도금 있습니다 - PDL으로 코팅 6 잘 접시에 2.5e5에서 GF. 세포는 성장 요인의 탈퇴 후 여러 시간 지점에서 2퍼센트 PFA에서 수정되어 있습니다. 얼룩 항체는 플라스틱 6 잘 접시 대신 유리 coverslips에 수행됩니다. <ol><li> 미디어를 제거하고 2% PFA를 추가합니다. RT 10 분에 품다. PFA 폐기하십시오. PBS, 5 분마다 시간을 세포에게 3 번 씻으십시오. 세포를 건조하지 않도록주의하십시오. </li><li> RT에서 10 분 동안 PBS에 0.​​25 % 트리톤의 솔루션을 사용 세포 마커에 대한 세포를 Permeabilize. </li><li> 비 특정 바인딩, 블록 세포를 방지하기 위해 F또는 HHG (1 밀리미터 HEPES 버퍼, 2 % 말 혈청, 그리고 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 10 % 염소 혈청)와 10 분. HHG에 미리 정해진 농도에 따라 특정 기본 항체 (표 2) 희석. 세포에 희석 항체를 놓습니다. 셰이커에 또는 4 ° C 하룻밤에 RT에서 1 시간을 품다. </li><li> 5 분마다 시간, PBS로 세포에게 3 번 씻으십시오. HHG에 미리 정해진 농도에 fluorochrome와 커플 링 적절한 보조 항체 (표 2) 희석. 세포에 희석 차 항체의 혼합물를 놓습니다. 어둠 속에서 흔드는에 RT에 품다 1 시간. </li><li> 5 분마다 시간, PBS로 세포에게 3 번 씻으십시오. </li><li> photobleaching 피하기 위해 셀에 DAPI와 골드을 연장하고 위에 유리 coverslip을 배치의 10 μl를 추가합니다. Axiovert 200M 형광 현미경 (Zeiss, Thornwood, NY) (그림 3)을 사용하여 라벨이 셀을 표시합니다. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 기본 인간 신경 전구 세포에서 태아 oligodendrocytes을 유도하고 유동 세포 계측법과 immunofluorescence 얼룩을 모두 사용하여 표현형을 특징하는 방법에 대해 설명합니다. 태아 CNS에서 신경 progenitors의 확장과 성장은 잘 1-4에 설명되어 있습니다. 이 성인의 흰색 물질 5-13에서 glial 전구체를 식별하고 분리 할 수 있습니다에도 불구 그러나, 체외 실험에서 충분한 인간의 oligodendrocytes을 획득하는 것은 어려운 남아있다. oligodendrocytes에게 14-21를 생산 myelin에 태아 신경 progenitors의 직접적인 차별화로 다양한 문화 환경의 발전의 여러 시도가 있었다. 이 프로토콜은 선택 성장 요소 (PDGF-AA, bFGF, 쉬, 그리고 NT-3), t로 보충 혈청 무료 매체에 3 주 동안 성장하면 O4 마커 (그림 2)를 표현 nest...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> DME / 햄 F12 1시 1분 </td><td> 오메가 과학자 </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 알부민 소 </td><td> 시그마 </td><td> A9418 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 품질 체액 </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 μg / ML </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 품질 체액 </td><td> 118-084-061 </td><td> 이 MM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> 시그마 </td><td> T2877 </td><td> 3 NM </td></tr><tr><td> N2 구성 요소 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17,502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech 주식회사 </td><td> 450-03 </td><td> 이 NG / ML </td></tr><tr><td> 쉬 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 이 NG / ML </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech 주식회사 </td><td> 100-18B </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech 주식회사 </td><td> 100-13A </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> PDL </td><td> 시그마 </td><td> P6407 </td><td> 50 μg / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,712 </td><td> 2퍼센트 </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> 품질 체액 </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> 워싱턴 </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ML </td></tr><tr><td> DNase 튜브 </td><td> 워싱턴 </td><td> LK003172 </td><td> 0.005 % </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> 워싱턴 </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> 골드을 연장 과DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 시약. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 기본 애비 (모든 1 μg / ML에서) </td><td></td><td> 종 Isotype </td><td> 출처 </td><td> 차 애비 </td></tr><tr><td colspan="5"> 유동 세포 계측법 </td></tr><tr><td> A2B5-비오틴 </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> 선물 J. Nielson </td><td> Streptavidin 페트로, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> J. Nielson의 선물 </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> 마우스 </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3 PE, 남부 생명 공학, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> 닭 </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, 잭슨 Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> 마우스 </td><td> IgG 1 </td><td> Messam 외. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> 토끼 </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, 잭슨 Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII의 tubulin </td><td> 마우스 </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 - 페트로, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochemistry </td></tr><tr><td> βIII의 tubulin (1:1,500) </td><td> 마우스 </td><td> IgG 2A </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2A-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> 토끼 </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, 잭슨 Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1시 50분) </td><td> 닭 </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, 잭슨 Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1시 10분) </td><td> 토끼 </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . 유동 세포 계측법 및 immunocytochemistry의 assays에 사용되는 표 2 항체 (ABS) 항체 conjugates : PE, phycoerythrin, 페트로, phycoerythrin 텍사스 레드, AMCA, 아미노 메틸 coumarin - 아세테이트, 싸이, cyanine, FITC, fluorescein의 isothiocyanate IG :. 면역 글로불린. . AF : 알렉사 형석, gαm : 염소 안티 - 마우스, gαrb : 염소 안티 - 토끼, dαck : 당나귀 방지 닭. </td></tr></tbody></table>

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 oligodendrocyte 문화 시스템

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

neuronal와 glial 세포 유형으로 인간의 신경 progenitors의 차별화 신경 세포 계보 (Lineage) 개발의 분자 규정을 연구하고 비교하는 모델을 제공합니다. 태아 CNS 조직에서 신경 progenitors의 체외 확장에 잘 특징되었습니다. 체외 실험에서 충분한 인간의 oligodendrocytes을 획득 myelin 생산 oligodendrocytes에 태아 신경 progenitors의 직접 분화에 다양한 문화 조건 성인의 하위 대뇌 피질의 흰색 물질과 개발에서 glial progenitors의 식별 및 격리에도 불구하고 어려운 남아있다. galactocerebroside + (GalC)와 O4의 차별화가 + oligodendrocyte 전구체 또는 신경 전구체 세포의 전구 세포는 (OPC) 둘째 임신 태아 뇌를 사용하는 것으로보고되었습니다. 그러나, 이러한 전지는 astrocytes 뉴런 등의 지원 세포의 부재에서 세포 분열 따위에 의해 번식하지 않으며, 문화에 시간이 지남에 따라 빠르게 사라집니다. 필요가 체외 실험에서 적합 oligodendrocyte 혈통의 세포를 생산하는 문화 시스템 남아 있습니다. 기본 인간 oligodendrocytes의 문화 예를 들어, 생체에 그 세포를 감염 인간의 polyomavirus, JCV 같은 neurotropic 전염성 대리인의 pathogenesis을 연구 할 수있는 유용한 모델이 될 수 있습니다. 이러한 배양 세포는 중추 신경계 (CNS)의 다른 demyelinating 질병의 모델을 제공 할 수 있습니다. 뉴런 (전구 - 파생 뉴런, PDN)와 astrocytes (전구 파생 astrocytes, PDA)이 연구는 신경 progenitors을 유도 할 수 있다는 표시로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서 기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 신경 전구 세포는 체외에서 세포 분열 따위에 의해 번식 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 개발의 단계 (전구 파생 oligodendrocytes, PDO)의 많은을 통해 차별화합니다. DMEM-F12 혈청이없는 미디어의 우리 문화 신경 전구 세포는 저녁을 먹다기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA), 소닉 고슴도치 (쉬), neurotrophic 요인 3 (NT-3), N-2 및 triiodothyronine (T3)로 plemented. 배양 세포는 대략 칠일 75cm 플라스크 당 2.5e6 세포에 passaged 있습니다. 이러한 조건에 사용 문화의 세포의 대부분이 몇 프로세스 및 A2B5 및 O-4 같은 사전 oligodendrocyte 세포의 명시 적 마커 특징으로 형태를 유지하고 있습니다. 우리가 네 가지 성장 요인 (GF) (bFGF, P​​DGF-AA, 쉬, NT-3)을 제거하고 PDN에서 설치된 미디어를 추가하면 세포는 GalC 및 myelin 등 oligodendrocyte 차별화의 특정 더 많은 프로세스와 명시 적 마커를 획득하기 시작 기본 단백질 (MBP). 우리는 oligodendrocyte의 독특한 마커를 식별 할 수 다색의 유동 세포 계측법을 사용하여 phenotypic 특성을 선보였습니다.

이 70 % -80 % 합류 신경 전구 세포 배양 (그림 1A)에서 차별화 프로세스를 시작하는 것은 매우 중요합니다. 많은 세포는 특정 성장 요인을 포함 있기 때문에 전구에서 oligo 매체에 문화 매체를 변경 한 후에는 죽을 것이다. 이 oligodendrocytic 표현형에 커밋되지 신경 전구 세포의 성장이 새로운 매체 (그림 1b)에 의해 지원되지 않습니다 나타냅니다. 일주일 동안 oligo 중간 + GF의 부화는 좁은, 바이폴라 형태를 (그림 1B) 전시 중간 문화되었습니다. 세포는 oligo 중간 + 3~4주 (그림 1C)의 GF에 보관됩니다. 문화 매체의 성장 인자 탈퇴는 여러 프로세스 (그림 1D)와 세포의 점진적 차별화 된 문화되었습니다. 유동 세포 계측법는 데이터의 양적 표현에 사용됩니다. 그림 ...

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식<em&gt; 체외에서</em&gt; 뉴런과 astrocytes로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서. 이 작품은 신경 progenitors은 선택의 성장 요인과 에어컨하여 oligodendrocytic 계보 (Lineage)의 단계를 통해 차별화하도록 유도 될 수 것으로 나타났습니다.

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

인간 신경 전구세포의 신경세포 및 글리아세포 유형으로의 분화는 신경세포 lineage 발달의 분자적 조절을 연구하고 비교할 수 있는 모델을 제공합니다. 태아 중추신경계(CNS) 조직 유래 신경 전구세포의 인비트로(in vitro) 증식은 이미 잘 특성화되어 있습니다. 성인 인간 피질하 백질에서 글리아 전구세포를 식별 및 분리하고, 태아 신경 전구세포를 수초 형성 희소돌기아교세포로 분화시키기 위한 다양한 배양 조건을 개발했음에도 불구하고, 인비트로 실험에 충분한 양의 인간 희소돌기아교세포를 확보하는 것은 여전히 어렵습니다. 임신 2분기 태아 뇌를 이용하여 신경 전구세포로부터 galactocerebroside+(GalC) 및 O4+ 희소돌기아교 전구세포(OPC)를 분화시킨 사례가 보고된 바 있습니다. 그러나 이러한 세포들은 성상세포와 신경세포를 포함한 지지 세포가 없으면 증식하지 않으며, 배양 과정에서 빠르게 소실됩니다. 따라서 인비트로 실험에 적합한 희소돌기아교 lineage 세포를 생산할 수 있는 배양 시스템이 여전히 필요합니다. 일차 인간 희소돌기아교세포 배양은, 예를 들어, 체내에서 해당 세포를 감염시키는 인간 폴리오마바이러스(JCV)와 같은 신경친화성 감염원의 발병 기전을 연구하는 데 유용한 모델이 될 수 있습니다. 또한 이러한 배양 세포는 중추신경계(CNS)의 다른 탈수초 질환 모델을 제공할 수 있습니다. 인간 태아 뇌 유래의 일차 다능성 신경 전구세포는 인비트로에서 증식하면서 신경세포(전구세포 유래 신경세포, PDN) 및 성상세포(전구세포 유래 성상세포, PDA)로 분화하는 능력을 유지합니다. 본 연구는 신경 전구세포가 희소돌기아교 lineage 발달의 여러 단계를 거쳐 분화하도록 유도될 수 있음을 보여줍니다(전구세포 유래 희소돌기아교세포, PDO). 당사는 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF-AA), Sonic hedgehog(Shh), 신경영양인자 3(NT-3), N-2 및 triiodothyronine(T3)이 첨가된 DMEM-F12 무혈청 배지에서 신경 전구세포를 배양합니다. 배양된 세포는 약 7일마다 75cm 플라스크당 2.5e6개의 세포로 계대 배양합니다. 이러한 조건에서 배양 세포의 대부분은 돌기가 거의 없는 형태학적 특징을 유지하며, A2B5 및 O-4와 같은 전-희소돌기아교세포 마커를 발현합니다. 4가지 성장인자(GF)(bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3)를 제거하고 PDN의 조건화 배지를 첨가하면, 세포는 더 많은 돌기를 형성하기 시작하며 GalC 및 myelin basic protein(MBP)과 같은 희소돌기아교세포 분화 특이적 마커를 발현합니다. 당사는 다색 유세포 분석법을 사용하여 표현형 특성 분석을 수행함으로써 희소돌기아교세포의 고유 마커를 식별하였습니다.

본 영상에서는 일차 인간 태아 신경 전구 세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법을 보여줍니다. 먼저 신경 전구 세포를 전구 세포 배지에서 배양하여 거의 융합(confluency) 상태에 도달하게 합니다. 그 후 전구 세포 배지를 분화 과정을 촉진하는 성장 인자가 첨가된 희소돌기아교세포 배지로 교체합니다. 이후 세포를 3주 동안 배양 및 증식시킵니다.이후 성장 인자가 첨가된 희소돌기아교세포 배지를 성장 인자가 없는 희소돌기아교세포 배지로 교체하고, 현미경을 통해 표현형 변화가 관찰될 때까지 6~10일 동안 추가로 배양합니다. 그런 다음 희소돌기아교세포 계보 특이적 항체를 이용한 면역형광 현미경 검사와 유세포 분석법으로 분화를 확인합니다. 최종적으로, 성공적으로 분화된 희소돌기아교세포는 희소돌기아교세포의 생물학 및 인간 폴리오마바이러스인 JCV와 같은 감염원과의 상호작용에 관한 인비트로(in vitro) 연구에 사용할 수 있습니다.기존에 발표된 문헌의 방법들과 비교했을 때 본 실험실에서 확립한 기술의 실제적인 장점 중 하나는, 우리의 시스템에서는 별도의 성상교세포나 신경세포와 같은 지지 세포 없이도 희소돌기아교세포를 배양하고 분화시킬 수 있다는 점입니다. 또한 저희 프로토콜의 또 다른 장점은 oh four와 같은 마커를 발현하는 이러한 전구 희소돌기아교세포를 대량으로 배양할 수 있다는 것이며, 표현형을 유지하면서 여러 주 동안 병원균 배양(pathogen culture)을 통해 대규모의 세포 집단으로 증식시키는 것이 가능합니다. 분화의 최종 결과로 거의 순수한 희소돌기아교세포 집단을 얻을 수 있습니다.우리는 먼저 쥐와 마이 세포에서 희소돌기아교세포의 인비트로(in vitro) 분화에 관한 광범위한 문헌을 읽으며 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 또한 여러 연구자들이 세포의 분화를 완료하기 위해 좁은 배양 환경에서 성장 인자를 제거하고 있었습니다. NINDS에 있는 우리 실험실의 학부생인 Alexa Bandon이 이 프로토콜을 통해 해당 절차를 시연할 것입니다.분화를 준비하기 위해, BFGF와 EGF가 첨가된 신경 기초 배지(neural basal medium)가 들어있는 폴리라이신 코팅 플라스크에서 다분화능 신경 전구세포 집단을 배양하고, 사용하지 않는 세포는 폐기합니다. 배양이 약 70에서 80% 정도로 합쳐졌을 때(confluent), 분화를 유도합니다. 이를 위해 플라스크에서 전구세포 배지를 흡입하여 제거합니다.PBS로 세포를 한 번 헹군 다음, 성장 인자가 포함된 oligo 배지 12 milliliters를 첨가합니다. 습도가 유지되는 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 degrees Celsius로 세포를 배양합니다. 일주일 후, 남은 세포들은 좁은 양극성 형태(bipolar morphology)를 나타낼 것입니다.분화된 세포의 밀도가 최소 70%confluent에 도달하면, 배지를 제거하여 새로운 50 milliliter 원뿔형 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 저장된 조건화 배지(conditioned medium)는 나중에 사용하기 위해 따로 보관합니다. 그런 다음 0.05%trypsin, 0.1%EDTA 4 milliliters를 세포에 빠르게 첨가하고, 상온에서 5분 동안 배양합니다.플라스크를 여러 번 가볍게 두드려 세포가 잘 떨어지도록 합니다. 배양 후, 보관해 둔 조건화 배지 4~5 mL를 플라스크에 첨가하여 트립신 반응을 중단시킵니다. 그다음, 배지와 세포를 다시 50 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.그 다음 배지와 세포를 상온에서 310 RCF로 7분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 완료되면 상층액을 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠릿을 재현탁한 후, 성장 인자가 포함된 신선한 oligo 배지를 첨가합니다.배지와 세포를 조심스럽게 파이펫팅하여 균일한 세포 현탁액을 만듭니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그런 다음 250만 개의 세포를 새로운 poly-D-lysine 코팅 T 75 플라스크로 옮기고 인큐베이터에 배양합니다. 3주 후 세포 밀도가 80~85%에 도달하면 플라스크에서 성장 인자가 포함된 oligo 배지를 흡입하여 제거합니다.PBS로 한 번 헹군 다음, 성장 인자가 포함되지 않은 oligo 배지 12 milliliters와 progenitor derived neuron 비조건화 배지 4 milliliters를 첨가하십시오. 이 배지에서 세포를 격일로 6~10일 동안 유지하십시오. 위상차 현미경으로 세포를 관찰하여 분화 및 합쳐짐(co fluency) 정도를 평가하고, 성장 인자 제거 후 배지의 최소 50%를 교체하십시오. 세포는 점진적으로 다수의 돌기를 형성하며, 이는 세포가 progenitor derived oligodendrocytes로 성공적으로 분화되었음을 나타냅니다.이 시점에서 전구세포 유래 희소돌기아교세포는 이 비디오의 다음 섹션에서 설명하는 바와 같이 유세포 분석 또는 면역형광 실험에 사용할 수 있습니다. 유세포 분석법은 분화 과정 중의 희소돌기아교세포 마커 획득을 모집단과 비교하여 분석합니다. 인간 신경 전구세포를 대조군으로 사용합니다. 폴리리신이 코팅된 두 개의 T 75 플라스크 각각에 성장 인자가 포함된 oligo 배지 내의 전구세포 유래 희소돌기아교세포 2.5 million개를 넣고 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다. 일주일 후, 세포 생존률 대조군으로서 한쪽 플라스크의 배지를 성장 인자가 포함된 신선한 oligo 배지로 교체합니다.두 번째 플라스크의 배지를 성장 인자가 없는 신선한 oligo 배지로 교체합니다. 이 세포들을 최대 10일 동안 배양하며, 성장 인자를 제거한 후 3~9일이 지나면 세포들이 희소돌기아교세포 표현형의 전형적인 돌기들을 더 많이 형성하기 시작할 것입니다. 전구세포 유래 희소돌기아교세포를 분리하기 위해 배지를 흡입하고 각 플라스크에 5.25 milliliters의 perian 용액을 첨가합니다.세포 해리 과정에서 세포에 더 완만한 영향을 주기 때문에 trypsin 대신 Perian을 사용합니다. 세포 형태를 보존하기 위해 37 °C에서 15~30분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포의 박리 상태를 주기적으로 확인하십시오.세포가 분리되면, 반응을 중단시키기 위해 성장 인자가 포함되었거나 포함되지 않은 배지 5 mL를 추가합니다. 다음으로, 각 플라스크의 내용물을 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 실온에서 310 RCF로 7분간 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠릿을 1 mg/mL bovine serum albumin 또는 NPM plus BSA가 보충된 4 mL의 일반 생리적 배지에 재현탁합니다.그 후 이전과 동일하게 세포 수를 측정하고, 각 면역염색 조건에 따라 100만 개의 세포를 5mL 폴리프로필렌 튜브에 분주합니다. 각 면역 시약의 특이성을 확인하기 위해 모든 적절한 대조군을 반드시 포함하십시오. 다음으로 면역염색을 수행하기 위해, 세포를 표면 단백질인 A2B5, O4 및 gal C에 대한 항체와 함께 먼저 배양합니다. 그 후 결합하지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 세포를 세척하고, 적절한 형광 색소 표지 2차 항체와 함께 배양합니다.그 후 2차 항체를 제거하기 위해 세포를 다시 세척합니다. 2% paraldehyde로 고정한 뒤 차가운 70% ethanol로 투과화시키고, 세포 내 단백질 염색을 위해 세포를 세척한 다음 nesting, glial fibrillary, acidic protein, class three beta tubulin 및 myelin basic protein에 대한 항체와 함께 배양합니다. 이후 결합되지 않은 1차 항체를 세척하여 제거합니다.세포를 적절한 형광 표지 2차 항체와 함께 배양합니다. 마지막으로, 유세포 분석 중에 온전한 세포와 세포 내 잔해를 구별하기 위해, 세포를 4-6-DIA-medino, 2-phenol Lind dihydrochloride 또는 DAPI로 염색합니다. 488 nm, 647 nm 및 광범위 UV에 맞춰 조정된 들뜸 파장을 제공하는 3개의 레이저가 장착된 기기에서 유세포 분석을 수행합니다. 면역형광 현미경 관찰을 위해, poly-D-lysine이 코팅된 6개를 준비합니다.웰당 250,000개의 전구세포 유래 희소돌기아교세포가 들어있는 6-웰 플레이트를 준비합니다. 각 시점당 두 개의 플레이트가 필요합니다. 세포가 70~80% 밀집(confluent)되었을 때, 하나는 성장 인자를 포함하여 배양하고 다른 하나는 성장 인자 없이 배양합니다.플레이트에서 성장 인자가 포함된 배지를 흡입하여 제거합니다. PBS로 한 번 헹군 다음 성장 인자가 없는 배지 12 milliliters를 첨가합니다. 성장 인자 제거 후 5일 및 9일에 다음과 같이 면역 염색을 수행합니다. 먼저, 세포를 2% PFA로 실온에서 10분 동안 고정합니다.다음으로 PFA를 제거하고 PBS로 세포를 5분씩 세 번 세척합니다. 그 후 0.25% triton으로 세포를 처리한 뒤, 비특이적 결합을 방지하기 위해 2% horse serum과 10% goat serum으로 세포를 블로킹합니다. 블로킹 후, beta three tubulin, G-F-A-P-M-V-P oh four 및 gal C에 대한 항체를 세포와 함께 배양합니다. 이어서 결합되지 않은 항체를 세포에서 세척하고, 적절한 형광색소 표지 2차 항체와 함께 세포를 배양합니다.세포에서 결합되지 않은 2차 항체를 세척한 다음, 광퇴색과 탈색을 방지합니다. 핵을 마운팅합니다. dpi가 포함된 prolonged gold 10 µL를 사용하여 커버슬립을 고정합니다.인간 일차 신경 전구 세포가 희소돌기아교세포로 분화할 수 있는지 확인하기 위해, 적절한 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 라벨링된 세포를 시각화합니다. 다능성 신경 전구 세포는 본 영상에서 설명한 방법으로 배양되었습니다. 이후 유세포 분석 및 면역형광 현미경법을 통해 표현형 변화를 관찰하였습니다.여기서 볼 수 있듯이, 대부분의 신경 전구세포는 신경 상피 줄기세포 마커인 Nestin을 발현하는 반면, 성상교세포 마커인 GFAP, 신경세포 마커인 class three beta tubulin, 또는 희소돌기아교세포 마커인 OL4와 같은 계통 제한적 마커는 소수의 하위 집단에서만 발현됩니다. 배양액을 성장 인자가 포함된 희소돌기아교세포 배양액으로 교체하여 1주일 동안 배양했을 때, 2주일 후 Nestin의 발현은 감소하고 A2B5의 발현은 증가하는 것이 관찰되었습니다.Nesting 발현은 더욱 감소하였으며, 신경교 전구세포 마커인 A2B5의 발현이 증가하였습니다. 성장 인자 제거 2일 후에는 또 다른 희소돌기아교세포 마커인 O4의 발현 또한 증가하였습니다. 성장 인자 제거 6일 후에는 O4 발현과 후기 희소돌기아교세포 마커인 GALC의 발현이 증가하였습니다. O4와 GALC의 공동 발현이 증가하였으며, 이는 GALC와 MBP의 공동 발현 수준과 유사하였습니다.다중 에피토프 면역 염색 결과, 배양 세포의 72%가 MBP를 발현하는 것으로 나타났습니다. 전구세포 유래 희소돌기아교세포 분화의 추가 증거는 면역형광 분석법을 통해 확인되었습니다. 성장 인자를 제거한 지 2일 후, 녹색으로 표시된 MVP의 발현이 검출되었습니다.이는 5일 차에 증가하였으며 9일 차에 더욱 증가하였습니다. 분화된 희소돌기아교세포에서 MVP의 국소화가 분명하게 나타납니다. 종합하면, 이러한 데이터는 설명된 방법을 사용하여 배양한 인간 태아 신경전구세포가 희소돌기아교세포 계통의 단계별 분화 능력을 유지하면서 in vitro에서 증식할 수 있음을 나타냅니다.본 프로토콜의 개발 이후, 이 기술을 통해 발생생물학, 신경과학, 바이러스학 분야의 연구자들은 인간 뇌의 생물학적 특성과 인간 뇌에 영향을 미치는 질환, 특히 백질 질환을 유발하는 질환들을 연구할 수 있게 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 성숙 oligodendrocytes (OLs)를 생산하는 차별화 기본 문화에 murine oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 풍부한 인구를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한,이 보고서는 생산 기술에 대해 설명합니다 murine 마우스 등의 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)의 neurite 침대에 마우스 OPCs을 심는 공동 문화 myelinating.

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

이 비디오는 성체 쥐의 뇌에서 외측 심실 벽을 분리하고 효소 조직 해리를 수행하여 단일 세포를 얻기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 세포는 신경 줄기 세포의 증식을 선택적으로 강화하고 희소돌기아교세포와 성상세포의 공동 배양으로의 분화를 촉진하는 특정 배양 조건에 적용됩니다.

성체 마우스 신경 줄기세포에서 혼합 희소돌기아교세포와 성상교세포 배양 획득

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

이 비디오는 쥐 새끼 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다.

Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex(쥐 강아지 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포)

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

배우세요 인간 태아 신경 전구세포를 올리고덴드로사이트로 분화시키는 세포 배양 기법을. 이 방법은 지지세포 없이 순수한 올리고덴드로사이트 집단을 생성하여 탈수초성 질환 연구에 활용됩니다.

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

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