2013년 4월 23일
우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 전기화학 센서를 사용하여 박테리아를 검출하고 식별하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 리보솜 RNA를 방출하여 불소화 검출기 프로브와의 혼성화를 허용함으로써 달성되며, 두 번째 단계로 검출기 프로브에 결합된 리보솜 RNA가 작업 전극에 추가되어 센서 표면의 포획 프로브와 혼성화를 가능하게 합니다. 다음으로, 항 플루오레세인 호스 래디쉬 퍼옥시다제 접합체는 불소화 검출기 프로브에 결합할 수 있습니다.
마지막으로, 간섭계 전류에서, 그 강도는 포획 프로브 리보솜의 수와 상관관계가 있으며, 센서 표면의 RNA 검출기 프로브 복합체를 얻을 수 있습니다. 배양 기반 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 약 45분 만에 박테리아를 검출하고 식별할 수 있어 하룻밤 동안의 무게를 피할 수 있다는 것입니다. 박테리아가 EDGAR 플레이트에 눈에 보이는 군체를 형성하려면 이 기술을 적용하면 전염병 관리가 개선됩니다.
박테리아 병원체의 조기 검출은 표적 항생제 요법과 임상 결과 개선에 필수적입니다. 이 방법은 감염성 질환 진단에 유용하지만 면역 진단과 같은 다른 진단 문제에도 적용할 수 있습니다. 먼저 팽창된 포획 프로브를 실온에서 10분 동안 헥산 디 티올과 함께 배양하여 포획 프로브의 티올 그룹이 감소하여 보다 일관된 결과를 얻을 수 있도록 합니다.
배양 후 질소 흐름을 적용하여 금을 함유하십시오. 수분이나 미립자를 제거하기 위해 5초 동안 16개의 센서 어레이 칩을 사용하고, 소량의 액체를 센서 어레이의 작업 전극에 조심스럽게 적용해야 합니다. 이 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.
피펫팅과 세척 및 건조 기술을 적절하게 수행하면 칩 대 칩 변동성이 크게 줄어듭니다. 다음으로, 6마이크로리터의 HDT 팽창 포획 프로브 믹스를 센서 어레이의 16개 센서 모두의 작동 전극에 적용하고 센서 칩을 섭씨 4도의 뚜껑이 있는 페트리 접시에 다음 날 밤새 보관하고 센서 칩을 탈이온수로 2-3초 동안 세척한 다음 질소 흐름에서 칩을 5초 동안 건조시킵니다. 이제 6마이크로리터의 attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL 용액을 16개 센서 모두의 작동 전극에 적용하고 실온의 페트리 접시에서 50분 동안 센서를 배양합니다.
전기화학 센서 분석을 위한 샘플을 준비합니다. 성장의 통나무 단계에 있는 세균성 배양물의 1 밀리리터를 마이크로 분리기 관에 옮기고, 그 후에 16, 000 GS에 5 분 동안 세포를 원심분리하십시오. 병원성 박테리아는 생물 안전 후드에서 처리해야 합니다.
스내트를 제거한 후 10마이크로리터의 수산화나트륨이 들어 있는 피펫 팁을 마이크로 원심분리기 튜브 바닥에 바르고 피펫을 위아래로 몇 번 당겨 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양한 후 소 혈청 알부민 또는 BSA가 포함된 PBS 50마이크로리터와 플루오레세인 변형 검출기 프로브를 첨가하여 박테리아 용해물을 중화합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 중화된 용해물을 배양합니다.
준비된 센서 칩 중 하나에서 나온 메르캅토에탄올 용액을 탈이온수로 2-3초 동안 세척하여 이 단계를 시작합니다. 방금 설명한 대로 칩을 건조시킨 후 4마이크로리터의 중화된 박테리아 용해물을 작업 전극에 적용합니다. 센서 중 14개.
그런 다음 PBS와 BSA와 플루오레세인 변형 검출기 프로브에 있는 브리징 올리고뉴클레오타이드 4마이크로리터를 두 개의 양성 대조군 센서에 적용합니다. 그런 다음 용해수 및 양성 대조군 센서를 15분 동안 배양한 후 이전과 같이 전체 센서 칩을 세척하고 건조시킵니다. 이제 카제인을 함유한 PBS의 안티 플루오레세인 호스 래디쉬 퍼옥시다제 또는 HRP 4마이크로리터를 16개 센서 모두의 작동 전극에 적용합니다.
15분 배양 후 센서 칩을 세척하고 건조시킵니다. 다음으로, 센서 칩 표면에 필름 웰 스티커를 붙이고 칩을 16개의 센서 모두에 50마이크로리터의 TMB 기판 TMB 기판 피펫에 로드하고 센서 칩 마운트를 닫습니다. 마지막으로 Helios 칩 리더를 사용하여 16개 센서 모두에 대한 고온계 및 순환 원격 측정 측정값을 얻습니다.
방금 설명한 전기화학적 분석법은 이 그림에서 볼 수 있듯이 샌드위치 Eliza와 유사하게 구조화되어 있으며, 포획 및 검출기 프로브를 사용한 RNA 혼성화는 검출기 프로브의 3개의 소나무 플루오레세인 결합을 결합하는 항 플루오레세인 항체 단편에 접합된 HRP에 의해 촉매된 산화 환원 반응에 의해 개발됩니다. 분석 감도의 중요한 구성 요소는 금 전극의 표면 화학입니다. 금 전극은 메르캅토에탄올과 히네 올로 코팅되어 있으며 팽창된 포획 프로브를 추가하여 기능화됩니다.
포획 프로브 및 플루오레세인 표지 검출기 프로브를 사용한 표적 리보솜 RNA의 샌드위치 혼성화는 항 플루오레세인 호스 래디쉬 퍼옥시다제 접합체 및 TMB 기질을 첨가하여 검출되는 복합체를 생성합니다. M 파라메트릭 전류는 양고추냉이 과산화효소에 의한 TMB의 산화와 전극의 전자에 의한 TMB의 환원으로 인해 발생하는 산화 환원 사이클에 의해 생성됩니다. 여기에 시연된 분석은 유전자 유체 16 센서 어레이 칩을 사용합니다.
어레이의 각 센서에는 작동 레퍼런스 및 보조 전극의 세 가지 전극이 포함되어 있으며, 이 전극은 칩의 가장자리에 접점이 있습니다. 칩 리더에는 각 접점과 연결되는 포고 핀이 있습니다. 칩 리더는 컴퓨터 알고리즘에 의해 제어되는 전위차계가 있는 센서 어레이의 인터페이스 역할을 합니다.
여기에서는 전기화학 센서 전류 흐름의 예를 보여줍니다. 센서의 전류 흐름은 파라메트릭 측정이 시작된 후 처음 몇 초 동안 센서에서 인위적으로 높습니다. TMB를 센서 표면에 적용한 후 리더 알고리즘을 시작할 때까지 시간 동안 산화된 기판이 축적되기 때문에 전류 흐름은 빠르게 정상 상태에 도달하고 60초 이내에 정확한 센서 판독값을 안정적으로 얻을 수 있습니다.
센서 간 변동성은 비교적 일정하기 때문에 유전자 유체 16 센서 어레이 칩에 대해 16개의 서로 다른 센서 분석을 병렬로 수행할 수 있으며, 포지티브 대조군과 음성 대조군은 양성 대조군으로 필수적입니다. 포획 및 검출기 프로브 모두에 혼성화되고 알려진 농도의 합성 표적 역할을 하는 합성 브리징 DNA 올리고뉴클레오티드가 이러한 방식으로 사용됩니다. 브리징 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻은 결과는 칩 간 변동을 최소화하기 위해 내부 보정 제어로 작동합니다.
전극의 음전류가 클수록 신호가 높아집니다. 캡처 및 감지기 프로브를 테스트하는 경우. 검출 한계는 이 그림과 같이 알려진 농도의 샘플의 연속 희석에 의해 결정되어야 하며, 분석의 동적 범위에서 샘플 농도와 신호 출력 사이에는 선형 로그 로그 상관관계가 있습니다.
이 막대 그래프에서 요로 감염 환자의 소변에서 자주 발견되는 esia coli와 kleb seal 및 ammonia를 포함하는 샘플에 대한 대표적인 결과는 대부분의 센서에 대한 신호가 낮고 유사할 것으로 표시되며, 이러한 부정적인 결과는 KE 프로브 쌍의 배경 신호 반응성이 canon과 e coli를 구별하기 때문에 통합될 수 있습니다. 브리징 올리고뉴클레오티드는 양성 대조군 및 내부 보정 표준물질로 작용합니다. 이 기술은 항생제에 대한 박테리아의 표현형 반응을 측정하여 임상 표본에서 항생제 내성 박테리아를 검출하는 데 적용할 수 있습니다.
이 기술은 개별 환자에 대한 최적의 치료법을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 칩에 있는 다양한 종별 센서의 연극 전류를 비교하여 박테리아를 감지하고 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 연구는 박테리아의 신속한 검출 및 식별을 위한 전기화학 센서 분석법을 제시합니다. 이 방법은 특정 리보솜 RNA 서열을 표적으로 하는 DNA 올리고뉴클레오티드 캡처 프로브로 기능화된 센서 어레이를 사용합니다.
Rapid bacterial detection and identification within 45 minutes addresses a critical bottleneck in infectious disease management, enabling timely therapeutic decisions. This electrochemical sensor approach supports target validation by providing species-specific ribosomal RNA detection with quantitative amperometric readouts. The method enhances predictive confidence in early discovery by reducing reliance on slow culture-based assays and improving assay reproducibility across a 16-sensor array.
Positions the method within early discovery to lead identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking through specific rRNA detection.