Name: 生物发光细菌成像 em在体内 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: 了解生物发光成像技术用于追踪活体小鼠体内细菌在肿瘤异种移植中的分布与生长动态。该方法利用lux标记菌株实现无创纵向监测，为细菌载体癌症治疗研究提供可靠数据。

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作者希望感谢欧洲委员会第七框架计划（PIOF-GA-2009-255466）和爱尔兰健康研究委员会（HRA_POR/2010/138）对本论文提供的资助支持。Lux标记的E. coli菌株由科马克·加汉博士（Dr. Cormac Gahan）惠赠，来源为科克大学学院。

1. 肿瘤诱导
<ol>
 <li>常规肿瘤诱导时，将悬浮于200 μl无血清培养基中的最低成瘤剂量细胞，使用21号注射器针头皮下（s.c.）注射至无感染的6-8周龄雌性Balb/C或裸鼠MF1-nu/nu小鼠（n=6，Harlan，牛津郡，英国）的侧 flank 部位（1 × 106 4T1细胞）。接种所用细胞的活力经血细胞计数板结合台盼蓝染料排除法（Gibco）目视计数测定，高于95%。</li>
 <li>肿瘤成瘤后，允许其生长发育，并每周监测两次。肿瘤体积按公式 V=(ab2) Π/6 计算，其中 a 为肿瘤的最长直径，b 为垂直于直径 a 的最长直径。</li>
</ol>
2. 细菌制备
<ol>
 <li>本实验所用菌株为大肠杆菌 K-12 MG1655（E. coli K-12 MG1655），该菌株不表达蛋白质毒素，并携带编码luxABCDE的质粒，使其可通过生物发光成像（BLI）进行检测。含有整合型luxABCDE的E. coli MG1655在添加了300 μg/ml 红霉素（Em）的LB培养基（Sigma-Aldrich，爱尔兰）中，于37 °C有氧条件下培养。MG1655的生物发光衍生菌株是通过含有组成型启动子PHELPluxABCDE操纵子的质粒p16Slux构建而成1。</li>
 <li>为准备对小鼠给药，将菌液在LB培养基（Sigma）中于37 °C、200 rpm振荡培养至对数中期（600 nm处的光密度值）。细菌经离心（6,000 × g，5分钟）收集，用PBS（Sigma）洗涤后，重悬于PBS中，静脉注射时调整浓度为1 × 107菌落形成单位（cfu）/ml，灌胃时为1 × 1010 cfu/ml。</li>
</ol>
3. 细菌给药
<ol>
 <li>当肿瘤体积达到约 100 mm3 时，将小鼠随机分配至实验组。进行静脉注射时，将小鼠固定后，每只通过 28G 注射器针头向尾静脉直接注射 100 μl 含 106 个细胞的悬液。每次接种物的活菌数通过回溯性平板计数法确定。</li>
 <li>对于胃肠道定植研究，通过灌胃法每天向每只小鼠口服 100 μl 含 109 个细菌细胞的悬液，连续给药三天。在开始口服灌胃前，通过在小鼠饮用水中添加 5 mg/ml 链霉素持续 7 天，以降低原有的共生菌水平1。</li>
</ol>
4. 生物发光成像
<ol>
 <li>使用 IVIS100（Caliper）进行二维 体内 生物发光成像（BLI）。在细菌给药后的指定时间点，采用 Caliper 的 XGI-8 气体麻醉系统（3% 异氟烷）对小鼠进行麻醉，并在 IVIS 100 系统中以高灵敏度模式进行全身图像采集，持续 2–5 分钟。</li>
 <li>对于三维成像，将麻醉后的小鼠置于光学成像系统内的小鼠成像转运舱中，进行背部成像（IVIS Spectrum，Caliper）。为获取用于三维光学重建的细菌荧光素酶信号，采用 500–580 nm 范围内的发射滤光片，每个滤光片的 bin 16 采集时间为 3–4 分钟，以最大化信噪比。在此图像采集过程中，同步获取结构光图像以生成高度图。该高度图被输入至扩散光成像断层扫描（DLIT）重建算法中，通过非负最小二乘优化方法生成三维光学图像2。</li>
 <li>图像分析：使用 Living Image 软件（Caliper）识别并定量分析感兴趣区域。</li>
</ol>
5. 代表性结果
本研究中，将表达 luxABCDE 操纵子的非致病性共生细菌 E.coli K-12 MG1655 经静脉注射至皮下接种 4T1 异种移植瘤的小鼠体内。细菌的 lux 信号在静脉注射后仅在小鼠肿瘤部位被特异性检测到（图 2）。从小鼠样本中培养回收细菌的结果证实，活菌数量与检测到的光信号强度之间存在线性关系（图 3）。此外，利用三维生物发光成像（3D BLI）也可实现对口服给予的共生菌在胃肠道内分布的体内成像。
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1.jpg" alt="肿瘤生长曲线图；体积 vs. 天数；细菌治疗；生物发光成像（BLI）时间点。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实验方案时间线。在小鼠体内诱导皮下肿瘤，并在肿瘤发育至 100 mm3 时给予细菌治疗。在细菌给药后的不同时间点对活体小鼠进行生物发光成像（BLI）（箭头表示典型成像时间点）。
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig2.jpg" alt="生物发光成像、细菌生长曲线；荷瘤小鼠实验，肿瘤中CFU对数分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 向荷瘤小鼠给予E. coli MG1655 luxABCDE。 在MF1 nu/nu小鼠中建立皮下4T1肿瘤，并在肿瘤形成后给予E. coli MG1655 luxABCDE。每只动物通过尾静脉侧支直接注射106个细胞。在实验期间于四个时间点对小鼠进行成像（黑色圆点表示Z轴及图像），随后从安乐死小鼠的肿瘤组织中回收存活细菌（菌落形成单位，cfu）并绘制柱状图。随时间推移，观察到肿瘤内细菌数量增加以及质粒基因特异性表达（每个时间点展示一只代表性小鼠）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4318/4318fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。 
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig3.jpg" alt="E. coli growth vs. in vivo luminescence graph; correlation analysis, data points, trend line." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 肿瘤内细菌数量与生物发光之间的关系 通过菌落计数法对肿瘤中可存活细菌进行定量 离体 不同时间点静脉注射后通过生物发光成像（BLI）检测肿瘤中细菌培养的菌落形成单位（cfu）对数值 体内 将生物发光单位作图。观察到细菌计数与细菌生物发光信号之间存在显著相关性 R2=0.97171.
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig4.jpg" alt="Tomographic imaging, mouse model, fluorescence intensity map; photonic study in vivo analysis." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
 图4. 小鼠胃肠道定植的3D IVIS图像 E. coli MG1655 通过口服灌胃使小鼠胃肠道定植 109 菌落形成单位（cfu）的 E. coli 连续三天。图中显示了定植小鼠三维断层成像的单个分离图像。三维图像展示了骨骼的数字小鼠图谱，以提供解剖学定位参考。 E. coli MG1655 的生物发光在较低水平时呈绿色，高水平时呈紫色。

<ol><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Postgrad+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for prostate cancer.</a> Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).</li>
<li>Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+targeting+with+systemically+administered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumour targeting with systemically administered bacteria.</a> Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+cancer+immunotherapy%3A+which+vector+for+which+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy.</a> Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).</li>
<li>Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditions+required+for+tumor+colonization+by+intravenously+delivered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).</li>
<li>Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+as+vectors+for+gene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Bacteria as vectors for gene therapy of cancer.</a> Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bifidobacteria+as+vehicles+for+delivery+of+agents+to+systemic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors.</a> Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).</li>
<li>van Pijkeren, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Listeria+monocytogenes-based+DNA+delivery+system+for+cancer+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+effective+antitumor+response+after+mucosal+bacterial+vector+mediated+DNA+vaccination+with+endogenous+prostate+cancer+specific+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen.</a> J. Urol. 186, 687-693 (2011).</li>
<li>Riedel, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+luciferase+tagging+system+for+Listeria+monocytogenes+allows+real-time+monitoring+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+prodrug-activating+bacteria+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy.</a> Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).</li>
<li>Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+intestinal+colonization+by+Escherichia+coli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+For+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">PET Imaging For Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Tangney, M., Francis, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optical+Imaging+in+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在基因治疗领域，利用生物载体将治疗性基因递送至患者的策略已展现出巨大前景 3-5与病毒类似，细菌的天然生物学特性使其能够高效地将DNA递送至细胞或组织，尤其在癌症背景下具有显著潜力。研究表明，当细菌经全身给药后，能够自然趋向于肿瘤组织，并在局部高水平复制，这种复制可发生于肿瘤细胞外部（非侵袭性菌种）或内部（致病菌）。最初认为，细菌在肿瘤部位的特异性复制归因于实体瘤的缺氧微环境（低氧水平）2 水平），肿瘤内缺氧/坏死区域的厌氧环境促进了专性厌氧菌和兼性厌氧菌的生长。近年来，研究还提出其他因素可能发挥作用，例如肿瘤中不规则且渗漏的血液供应以及局部免疫抑制。大多数临床前研究采用异种移植肿瘤模型来探究细菌载体在肿瘤中的定植情况。而自发性肿瘤的小鼠模型在血管结构方面（可能影响细菌在肿瘤中定植的变量）更接近临床实际情况，且已有研究表明细菌同样能够定植于此类模型。 6多种细菌菌株在肿瘤内特异性运输和扩增编码前药转化酶、毒素、血管生成抑制剂以及细胞因子等因子基因的能力，已在多项临床前和临床试验中得到证实 4,7尽管已证明细菌在肿瘤中的定植与细菌菌株和肿瘤类型无关 <...

<table><tbody><tr><td>4T1细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td>源自自发性BALB/c小鼠乳腺肿瘤的同源性乳腺癌模型</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>&lt;em&gt;&lt;em&gt;Dulbecco改良型Eagle培养基&lt;/em&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>IVIS 100 用于二维成像；IVIS Spectrum 用于三维成像。</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller 型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2542</td><td>用于培养的培养基 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>红霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5389</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>抗生素 </td></tr><tr><td>MF1nu/nu 小鼠</td><td>Harlan (英国)</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Hsd:Athymic Nude-&lt;em&gt;Foxn1nu&lt;/em&gt; </td></tr><tr><td>Balb/c 小鼠</td><td>Harlan（英国）</td><td>066</td><td>单倍型：&lt;em&gt;H-2&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>灌胃针 </td><td>Vet-tech Solutions (UK)</td><td>DE009</td><td>22G × 38 mm 直式灌胃针 </td></tr><tr><td>用于静脉注射的注射器 </td><td>BD BioSciences</td><td>309309 - 1 毫升</td><td>胰岛素注射器，28 G × &amp;#189; 英寸超细静脉注射针</td></tr><tr><td>用于肿瘤接种的注射器</td><td>布劳恩</td><td>9161376V</td><td>Omnifix 26 G x &amp;#189; 英寸针头</td></tr></tbody></table>

活体生物发光细菌成像 in vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

本视频介绍了在活体小鼠中利用全身生物发光成像（BLI）研究细菌迁移的方法，重点阐述了细菌在癌症基因与细胞治疗中的应用。细菌是一类极具吸引力的癌症治疗载体，因其在全身给药后具有天然地在肿瘤组织中优先增殖的特性。经基因工程改造以表达lux基因片段的细菌，可通过BLI技术实现对细菌及其所处肿瘤部位的同步检测。通过该方法，可方便地在二维或三维水平上动态观察细菌在肿瘤内的时间分布与数量变化。该技术适用于多种细菌种类及异种移植肿瘤模型。本文描述了在皮下荷瘤小鼠中分析生物发光细菌的实验方案，同时也介绍了利用BLI可视化胃肠道（GIT）中共生菌群的方法。这一强大且经济的实时成像策略，是癌症研究（特别是基因治疗及感染性疾病）中研究细菌在体（in vivo）行为的理想方法。本视频概述了在活体小鼠中研究携带lux标签的E. coli的操作流程，展示了利用IVIS系统进行BLI所获得的空间与时间分辨结果。

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。

活体生物发光细菌成像 In Vivo

本视频介绍了活体小鼠中利用全身生物发光成像（BLI）研究细菌迁移的技术，重点阐述了……的应用

本视频介绍了在活体小鼠中利用全身生物发光成像研究细菌迁移的方法，重点在于检测异种移植肿瘤内细菌的生长。细菌作为癌症治疗的一类有吸引力的载体，具有在静脉注射后优先在肿瘤内部或肿瘤细胞外生长的天然能力。经过基因工程改造、表达 lux 基因盒的细菌菌株，可实现对细菌和肿瘤的同时检测。无创性、纵向的体内细菌菌株监测已被广泛认可，该方法可减少实验动物的使用量，并比终点检测获得更具统计学意义的数据。该实验涉及在小鼠体内诱导皮下肿瘤。允许肿瘤生长，并在一段时间内对其进行监测。给予细菌后，对小鼠在特定时间点进行生物发光成像，以开展本文所述的实验。在免疫健全或胸腺缺陷背景的小鼠中诱导皮下肿瘤。根据所选异种移植模型，培养所需物种（如大肠杆菌）的Lux型细菌过夜。细菌细胞经洗涤后，重悬于所需浓度的溶液中，用于静脉注射。10的6次方。通常使用100微升注射体积的细菌细胞。常规制备肿瘤体积为100立方毫米的皮下荷瘤小鼠用于治疗。使用29号针头的注射器将细菌悬液注入小鼠尾静脉外侧。随着时间推移，细菌优先在肿瘤组织内复制。瘤内细菌可持续复制数周，并可在注射后第3至6天通过IVUS成像检测到。给药后，将活体且已麻醉的小鼠置于IVIS的37摄氏度成像室内进行生物发光成像。根据需要，可同时对多只小鼠进行成像。使用冷却CCD相机，在设定的软件参数下采集照片图像和生物发光图像。根据成像设备的不同，可进行二维或三维分析。肿瘤内细菌数量与所产生的光强度之间具有稳定且线性的关系，从而实现对体内细菌数量的可靠估计。表达LX的细菌也可从体内深层被检测到。表达荧光素酶的肠道定植共生菌可被可视化观察数周。通过灌胃给药后，进一步证明了生物发光成像在研究动物体内对表达荧光素酶的细菌进行分析的应用价值。

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

生物发光细菌成像<em在体内</em

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

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本文描述了在转移性乳腺癌细胞生长和转移过程中，对其表达的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的生物发光反应进行构建、可视化及定量的方法。 体内.

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来源： Valentine, M. E. 等人，框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

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来源：Wang, Y., 等. 利用生物发光成像技术对耐多药Acinetobacter baumannii烧伤感染进行蓝光抗菌治疗的体内研究。J. Vis. Exp. (2017)本视频展示了对感染携带生物发光操纵子的Acinetobacter...

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在骨科植入物感染的小鼠模型中，结合光学成像与显微计算机断层扫描（μCT）成像，并利用一种经基因工程改造的发光葡萄球菌（Staphylococcus...

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揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

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活体生物发光细菌成像 In Vivo

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