에 대한 Multibarrel 전극을 제조 및 꽃돼지 - 다시 사용 생체에 약리 노는

본 절차는 신경 활동을 동시에 기록하면서 뇌의 미세 회로에 약물을 이온 도포법(iontophoresis)으로 적용하는 것을 목표로 합니다. 먼저, 단일 세포 기록을 위한 단일 배럴 유리 전극을 뽑아 팁 부분을 구부립니다. 또한, 멀티 배럴 유리 전극을 뽑고 팁을 원하는 직경으로 파쇄합니다.

이제 두 전극을 조립하십시오. 최종적으로 제작된 전극은 세포 외 in vivo 기록에 사용되며, 필요에 따라 약물을 직접 투여하여 신경 미세 회로를 조절할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Achim Klu 박사이며, 오늘 저희 연구실에서는 피기백 멀티 배럴 전극(piggyback multi barrel electrodes)의 제작 방법을 보여드리겠습니다.

이 전극들은 이오노포어를 통해 신경 작용제와 길항제를 뉴런의 미세환경으로 전달함으로써, 생체 내(in vivo)에서 뉴런의 신경 회로를 조절하는 데 사용될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Dr. Ah him Crow 실험실의 박사후 연구원 Dr. An Zillow입니다. 오늘은 해당 절차를 시연하겠습니다. 단일 배럴 전극의 경우, 필라멘트가 포함된 단일 배럴 유리 모세관을 사용하여 팁 직경은 약 1~2 µm, 샤프트 길이는 10~12 mm가 되도록 뽑아냅니다.

추출한 전극을 3 M 염화나트륨으로 채운 후, 0.9% 식염수에서 표준 Ω 메터로 저항을 간헐적으로 확인하십시오. 전극을 염 용액으로 채우면 용액이 빠르게 건조되어 전극을 사용할 수 없게 되므로, 이 테스트만 수행하시기 바랍니다.

피기백(piggyback) 제작에 사용되지 않을 전극들을 준비합니다. 완전한 멀티 배럴 전극을 만들려면, 유리관을 당겨 전체 직경이 약 10 µm 이하인 피펫 팁을 형성하십시오. 팁이 정확하게 당겨진 전극을 사용하는 것이 성공의 핵심입니다.

팁은 길고 가늘어야 할 뿐만 아니라, 원하는 팁 직경으로 쉽게 부러질 수 있도록 여전히 단단해야 합니다. 팁은 다음 단계에서 정확한 직경으로 부러뜨리게 됩니다. 따라서 풀링 과정에서는 정확한 팁 크기보다 전극 팁의 전체적인 모양이 길고 상대적으로 가느다란지가 더 중요합니다.

이제 단일 배럴 전극을 약 45도 각도로 유지하고 팁이 아래를 향하게 한 뒤, 화염 속으로 비교적 빠르게 통과시킵니다. 전극 팁에서 약 10mm 떨어진 전이 영역의 유리가 화염에 녹아 약 20도 정도 굽혀지도록 조절하십시오. 멀티 배럴 전극을 유리 슬라이드 위의 모델링 클레이 위에 놓고, 이를 현미경 스테이지에 삽입합니다.

슬라이드 홀더 현미경 스테이지의 XY 조절기를 사용하여 전극 팁을 플렉시글라스 조각 쪽으로 조심스럽게 이동시킵니다. 현미경 접안렌즈를 통해 팁이 부러지는 것을 관찰하십시오. 전극 조립 설정이 여기에 표시되어 있습니다.

다중 배럴 전극은 현미경 테이블 위의 유리 슬라이드 위에 고정됩니다. 반면, 단일 배럴 전극은 사용자가 단일 배럴 피펫을 다중 배럴 피펫 위로 매우 정밀하게 내릴 수 있도록 하는 수동 다축 매니퓰레이터에 의해 고정됩니다. 단일 배럴 전극을 다중 배럴 전극의 5개 배럴 배열로 형성된 홈 속으로 직접 내리며, 이때 단일 배럴의 팁이 다중 배럴 팁보다 약 5~10 µm 정도 더 돌출되게 합니다.

시아노아크릴레이트를 사용하여 두 전극의 샤프트를 서로 접착합니다. 팁에서 가장 먼 위치부터 시작하여, 접착제 한 방울을 묻힌 이쑤시개를 전극 샤프트를 따라 전극 팁 방향으로 천천히 이동시킵니다. 전극 팁에 너무 가까이 접착제를 바르면 팁이 막혀 전극의 기능이 완전히 또는 부분적으로 상실될 수 있습니다.

소량의 치과용 시멘트를 혼합합니다. 약 15분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 완성된 피기백 전극(piggyback electrode)을 조심스럽게 제거합니다.

먼저 마이크로 매니퓰레이터 홀더에서 분리한 다음, 유리 슬라이드에서 떼어냅니다. 전극을 사용하기 직전에 각 배럴을 해당 약물로 백필(backfill)할 준비를 합니다. 5개 배럴 구성 중 4개의 외부 배럴에는 선택한 4가지 약물을 채우고, 중앙 배럴에는 균형 배럴로서 3 M sodium chloride를 채웁니다.

그런 다음 단일 배럴 기록 전극을 3 M sodium chloride로 채웁니다. 이제 이온 영동 펌프 모듈을 켜고 모든 배럴을 테스트합니다. 각 펌프 모듈의 전극 테스트 기능을 통해 전극 배럴이 심부 뇌 기록에 적합한 기능 상태인지 확인할 수 있습니다.

단일 배럴 기록 전극과 함께 조립된 완성된 5배럴 전극은 약 7mm의 긴 샤프트를 가집니다. 이온토포레시스(iontophoresis)와 함께 여러 시냅스 작용제 및 길항제가 흔히 사용되며, 글라이신 수용체 길항제와 같은 약물을 사용하여 글라이신 억제를 차단합니다. Trick nine hydrochloride는 일반적으로 뉴런의 발화(firing)를 증가시킵니다.

이 샘플 데이터는 청각 뉴런의 방전율 대 강도 함수를 측정하며, 동물의 귀에 전달된 강도가 증가하는 정현파 소리 자극에 대한 반응을 보여줍니다. 엄격한 나인(nine)을 적용하기 전에는 소리가 클수록 더 높은 스파이크 발생률을 보였습니다. 해당 뉴런의율-강도 함수는 낮은 스파이크 발생률을 나타냅니다.

15 nA의 초기 이온영동 전류를 가하면 배출 전류가 약간 증가합니다. 배출 전류가 점진적으로 높아짐에 따라 뉴런의 글리신 수용체가 점차 더 많이 차단되어 발화율이 점차 높아집니다. 45 nA의 전류에서는 스트리크닌 염산염에 의해 해당 뉴런의 모든 글리신 수용체가 차단된 것으로 보입니다.

방출 전류를 추가로 증가시키고 더 엄격한 나인(nine)을 방출하더라도 추가적인 변화는 나타나지 않았습니다. 이온토포레시스 종료 후 뉴런의 방전율 수준 함수를 살펴보면, 약 25분 후에 신경 반응이 기저선으로 완전히 회복됩니다. 이러한 회복 과정은 방출된 약물의 종류와 양에 따라 달라집니다.

약물이 기록 부위 주변으로 확산되어 인접한 뉴런의 수용체까지 차단할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는, 기록 전극과 멀티 배럴 약물 전극을 결합하여 저잡음 심부 뇌 기록을 수행하는 방법과 최대 4가지 약물 제제의 시간 제어 투여 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.