선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여 C. elegans
2013년 2월 13일
우리는에서 대상 유전자와 점수 몸 크기 표현형을 노크 RNAi 먹이 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다 C. elegans. 이 방법은 같은 DBL-1/TGF-β 신호의 몸 크기 조절에 관여 것과 같은 관심의 잠재적 유전자 구성 요소를 식별하기 위해 대규모 화면에 사용 될 수 있습니다.
이 비디오는 엘간 성장과 신체 크기를 조절하는 유전자를 식별하는 절차를 보여줍니다. RNA 간섭 또는 RNA 눈을 사용하여 후보 유전자를 비활성화하면 관심 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA를 발현하는 박테리아를 포함하는 첫 번째 플레이트가 준비됩니다. 네 번째 유충 단계 자웅동체는 RNAi 플레이트로 옮겨집니다.
일단 성체 단계에 도달하면, 그들은 알을 낳기 위해 새로운 RNAI 플레이트로 옮겨집니다. 몇 시간이 지나면, 배아가 동기화된 개체군을 남기고 제거됩니다. 원하는 발달 단계에서 자손은 슬라이드를 수집하여 장착했습니다.
마지막으로, 벌레의 현미경 이미지를 획득합니다. 이미지 분석은 유전자 불활성화로 인한 신체 크기의 변화를 보여줍니다. 이 방법은 TGF 베타 신호 경로의 조절자를 식별하는 데 사용할 수 있지만, 인슐린 신호 경로와 같은 바다 우아함에서 배아 후 발달을 조절하는 다른 경로에도 적용할 수 있습니다.
이 절차를 시작하려면 타겟 유전자 염기서열을 벡터 L 4 4 4 0 일반적으로 사용되는 웜 RNAi 플라스미드로 복제하여 재조합 플라스미드를 박테리아 균주로 변환합니다. HT 1 15 DE 3 문화. 탄산 밀리리터당 25마이크로그램과 테트라사이클린 밀리리터당 12.5마이크로그램을 함유한 LB 한천 플레이트의 형질전환된 박테리아는 향후 사용을 위해 단일 클론을 선택합니다.
한편, 빈 벡터 L 4 4 4 0을 박테리아 균주로 변환합니다. HT 하나 15. 실험 배양을 위한 대조군으로 사용하기 위해, 1밀리리터의 LB 육수에 있는 형질전환된 박테리아를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램과 함께
투입했습니다.테트라사이클린은 RNAI 효율을 감소시키기 때문에 첨가되지 않습니다. 암피실린 100마이크로그램과 함께 LB 육수 5ml를 하룻밤 배양에 추가한 다음 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 더 배양합니다. 배양이 준비되면 0.5ml의 실험 또는 대조 박테리아를 적절한 클론 이름이 표시된 RNAI 웜 플레이트에 파종합니다.
각 조건에 대해 적어도 두 개의 플레이트를 준비해야 합니다. 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날.
표적 유전자 염기서열의 유무에 관계없이 RNAi를 발현하는 박테리아의 잔디밭이 존재해야 합니다. 동물들은 박테리아를 식량 공급원으로 사용할 것입니다. RNAI 공급 플레이트가 준비되면 화염이 백금 와이어의 끝을 살균합니다.
그런 다음 백금 와이어를 사용하여 6-10개의 4번째 유충 단계 또는 L 4개의 C 엘간 자웅동체를 각 RNAi 플레이트로 이동합니다. 자웅동체가 하룻밤 사이에 섭씨 20도에서 자라게 하십시오. 다음 날, 동물들은 어린 성인이 될 것입니다.
적절하게 라벨링되고 준비된 새 RNAI 플레이트로 옮깁니다. 성체가 알을 낳을 수 있도록 섭씨 20도에서 4-6시간 동안 접시를 부화시킵니다. 부화 후 플레이트에서 모든 성인을 제거하여 자손을 동기화합니다.
성충이 제거되면 시간을 세기 시작합니다. 이것은 시간 0입니다. 섭씨 20도에서 플레이트를 배양하여 동물이 관심 있는 발달 단계로 성장할 수 있도록 합니다.
여기에서 표현형 분석을 위해 젊은 성인이 선택됩니다. 정상적인 속도로 발생하는 넉다운의 경우 72시간의 배양이 필요합니다. 다양한 유전자가 동물 발달에 다르게 영향을 미치므로 부화 시간을 조정해야 할 수도 있습니다.
RNAi가 동물을 다른 속도로 성장시키는 경우, 젊은 성인은 여기에서 볼 수 있듯이 VUL 발달이 완료된 L 4 이후 24시간 이내의 배아와 자궁 내 2-6개의 배아로 식별될 수 있습니다. 다른 발달 단계를 식별하기 위해 연구자는 생식선 및 VUL 발달을 지침으로 사용해야 합니다. 동물이 적절한 단계로 성장하면 RNAi 처리된 벌레의 신체 크기 표현형을 점수화할 준비를 합니다.
그런 다음 그림과 같이 1mm 두께의 시편 슬라이드를 유리에 두 겹의 컬러 라벨 테이프를 놓습니다. 이 유리 슬라이드 중 두 개를 만드십시오. 그런 다음 테이프를 사용하여 두 슬라이드 사이에 새 유리 슬라이드를 놓고 물에 녹인 2% Agros를 한 방울 떨어뜨립니다.
새 유리 슬라이드의 중앙으로 위에 있는 두 번째 유리 슬라이드를 눌러 얇은 아그로스 패드를 만듭니다. 아그로스가 굳으면 상단 유리를 제거합니다. 아그로스 패드가 웜을 로드할 준비가 된 상태로 슬라이드를 밉니다.
클론 이름으로 슬라이드에 레이블을 지정합니다. 10마이크로리터의 25밀리몰 아지드나트륨을 아로스 패드에 추가합니다. 그런 다음 이전과 같이 백금 와이어를 사용하여 30-40 마리의 동물을 나트륨 아지 용액으로 옮깁니다.
그들을 움직이지 못하게 하려면 상단에 커버 슬립을 끼우십시오. RNAi 처리 동물을 운반하는 재조합 및 빈 L 4 4 4 0 모두에 대해 이 작업을 수행합니다. 다음으로, 2.5 x 대물 렌즈를 사용하여 마이크로미터 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
Q Capture 또는 이와 유사한 소프트웨어를 사용하여 마이크로미터 눈금자의 이미지를 캡처하고 저장합니다. 그런 다음 웜을 스코프 아래에 놓고 이미지를 캡처합니다. 먼저 몸 길이를 측정하려면 Image Pro 소프트웨어에서 마이크로미터 눈금자의 이미지를 엽니다.
그런 다음 측정을 클릭하고 보정을 선택합니다. 그런 다음 선택한 활성 이미지를 보정한 상태에서 spatial Calibration wizard를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
보정의 이름을 입력하고 공간 참조 단위가 미크론으로 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 Create a reference calibration(참조 보정 생성) 버튼을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. draw reference line을 클릭합니다.
참조 축척 막대가 나타납니다. 마이크로미터의 끝과 일치하도록 축척 막대의 위치를 변경합니다. 그런 다음 참조가 1000 단위를 나타낸다고 나타냅니다.
확인을 클릭합니다. 다음으로 마칩니다. 소프트웨어가 보정되면 웜 이미지를 엽니다.
그런 다음 측정 메뉴에서 보정을 선택한 다음 공간 선택을 클릭합니다. 풀다운 메뉴에서 마이크로미터 보정을 위해 생성된 파일 이름을 선택합니다. 그런 다음 측정 메뉴 아래의 열리는 창에서 측정을 선택합니다.
무료 그리기 도구를 선택하고 컴퓨터 마우스를 사용하여 머리에서 꼬리까지 동물의 몸체 중심을 통과하는 선을 그립니다. 길이는 창에 보고됩니다. 들판에 있는 모든 동물에 대해 이 과정을 반복합니다.
길이 측정값을 Microsoft Excel 파일 또는 기타 적절한 통계 소프트웨어로 내보냅니다. 각 표본에 대한 평균과 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석합니다. 그런 다음 학생의 T-검정을 사용하여 각 그룹의 결과를 비교합니다.
형질전환 성장 인자 beta 또는 TGF beta SUPERFAMILY protein DBL one은 TGF 베타 경로의 활성화에 필요합니다. 신호 활성화에 대한 반응으로 세포 내 smad 신호 변환기는 핵으로 전위하고 유전자 전사를 시작합니다. TGF 베타 경로가 파괴되는 우아함은 야생형 동물보다 몸 길이가 짧다는 것을 포함하여 몸 크기가 더 작습니다.
따라서 바다의 우아함을 스크린합니다. 신체 크기 돌연변이는 TGF 베타 신호 성분 및 변형자를 식별하여 신체 크기 돌연변이의 식별을 위해 먹이를 공급하여 RNAi의 효과를 테스트할 수 있습니다. RNAi는 DBL 1 경로 구성 요소 SMA 3 at SMA 6 4 가지 바다의 우아함을 녹다운하는 데 사용되었습니다.
테스트된 C 엘레강스 균주에는 RN AI 과민성 A 1, Lin 15 B 및 RF 3인 2개, 표준 야생형 균주 N 2 및 RNAi 민감도가 N 2와 유사한 LIN 36 균주가 포함되었습니다. SMA 3 또는 SMA 6 발현이 중단되었을 때, 동물은 Lin 36에서 SMA 6 RNAi를 제외하고는 대조 동물보다 현저히 작은 신체 크기를 나타냈습니다. RF 3의 배경.
RNAi 처리 후 젊은 성인의 배경 신체 길이는 벡터 단독의 84-95%였습니다. A에서 RNAi 후 젊은 성인의 15 B 배경 몸 길이는 대조 동물의 68-86%였습니다. 그러나, A one lin 15 B 변형은 view 자손을 생산합니다.
이로 인해 대규모 상영에 적합하지 않습니다. 따라서 이러한 기술에 대해 RF 3 변형률의 사용이 제안됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RNI 간섭 기술을 사용하여 성장과 신체 크기를 조절하는 유전자를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 비디오는 RNA 간섭(RNAi)을 사용하여 C. elegans의 성장 및 체형을 조절하는 유전자를 식별하는 절차를 시연합니다. 이 방법은 DBL-1/TGF-β 신호전달을 통해 체형 조절에 관련된 유전자 성분을 밝히기 위한 대규모 선별을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전학
- 발생 생물학
배경
- C. elegans는 유전자 조절을 연구하기 위한 모델 유기체입니다.
- RNA 간섭은 유전자 노크다운을 위한 강력한 도구입니다.
- 체형 조절은 다양한 유전자 요인에 의해 영향을 받습니다.
- DBL-1/TGF-β 신호전달은 성장 및 발달에 역할을 합니다.
연구 목적
- RNAi 먹이 기법을 시연합니다.
- C. elegans의 체형에 영향을 주는 유전자를 식별합니다.
- 대규모 유전자 선별을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 이중 가닥 RNA를 발현하는 박테리아로 RNAi 플레이트를 준비합니다.
- 4번째 유충 단계의 쌍성체를 RNAi 플레이트로 이동합니다.
- 난 낳기 후 동기화된 배아 집단을 수집합니다.
- 관찰을 위해 후손을 슬라이드에 장착합니다.
주요 결과
- RNAi를 사용하여 표적 유전자의 성공적인 노크다운.
- C. elegans의 체형 현상 관찰.
- 성장 조절에 관련된 잠재적 유전자 성분 식별.
- 발달 맥락에서 RNAi의 효과성 시연.
결론
- RNAi 먹이 기법은 C. elegans의 유전자 노크다운에 효과적입니다.
- 이 방법은 대규모 유전자 선별에 활용될 수 있습니다.
- 연구 결과는 체형의 유전자 조절에 대한 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by knocking down candidate genes to assess body size phenotypes.
- Operational Value: Uses RNAi hypersensitive strains like rrf-3 to enhance knockdown sensitivity and reduce false negatives.
- Predictive Value: Identifies TGF-β pathway components such as sma-3 and sma-6, supporting target confidence in growth regulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized worm populations for consistent developmental staging and phenotypic scoring.
- Quantitative Output: Enables body length measurement via microscopy and image analysis, generating continuous data for statistical comparison.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and bacterial feeding systems for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with conserved TGF-β signaling pathways implicated in fibrosis, oncology, and metabolic disorders.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit to preclinical validation by confirming phenotypic impact in a whole-organism context.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on body size penetrance and expressivity across genetic backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in body size regulation through loss-of-function phenotyping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative body size readouts essential for assay standardization and hit confirmation.
- Analytics: Generates length measurements analyzed via mean, standard deviation, and Student’s T-test to evaluate statistical significance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating hits in conserved pathways like TGF-β, which have mammalian orthologs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi feeding platform applicable to other phenotypes such as motility, lifespan, or stress resistance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking gene knockdown to defined phenotypic outcomes in a genetically tractable model.
- Operational Value: Standardizes worm handling, RNAi feeding, and imaging protocols across users and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage target triage using low-cost, high-information-content assays.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic strength and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi techniques, and microscopic imaging.
- Depends on bacterial culture systems, RNAi plasmids, and temperature-controlled incubators.
- Necessitates standardization of worm staging, feeding duration, and phenotypic scoring across teams.
- Must account for variable RNAi efficiency across genetic backgrounds, as seen in lin-36 and rrf-3 strains.
- Limited to phenotypes observable in whole worms; not suitable for subcellular or biochemical readouts without adaptation.
