Name: 이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 배우세요 pHluorin 태그를 이용하여 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 도파민 D2 수용체 삽입을 실시간 이미징하는 방법입니다. TIRF 현미경으로 수용체 역학을 관찰하여 신경 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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1. Neuronal 문화 컨디셔닝을 위해 마우스 Glia 문화 준비 <ol><li> T75 플라스크는 콜라겐 솔루션 (ddH 2 O의 Purecol의 1시 3분 희석)로 코팅되어 있습니다. 플라스크는 수직으로 설정하고 조직 문화 후드에서 하룻밤 건조 남아 있습니다. </li><li> 해부 버퍼 (aCSF : 119 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM MgCl 2, 30 MM 덱스 트로 오스, 25 밀리미터 HEPES, 칼슘없이 산도 7.4)과 glia 미디어 (DMEM 10 % FBS, 10 단위 / ML 페니실린, 10과 보충 μg / ML의 스트렙토 마이신, 그리고 Glutamax)는 ° C 사용을위한 준비가 될 때까지 준비 및 4에 저장됩니다. </li><li> glia 문화의 날, glia 미디어는 마우스 뇌의 해부하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 최소 30 분 동안 데워 있습니다. 배아 또는 신생아 쥐들이 빠른 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 뇌성 cortexes은 해부 현미경 아래에서 해부하고 있습니다. </li><li> 해부하는 뇌 조직은 37 papain 솔루션 (100 ML papain, 2 ML의 해부 버퍼 20 μl 1% DNase I)에 소화 ° C 구경R 20 분. </li><li> papain을 소화 따라, 뇌 조직은 10 ML 미리 예열 glia 미디어로 헹구어 있습니다. 신선한 glia 미디어 (2 ML)은 다음 소화 뇌 조직에 추가되고, 조직은 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 triturated 있습니다. </li><li> 신선한 glia 미디어 (8 ML)는 dissociated 조직에 추가됩니다. 70 μm 셀 스트레이너는 dissociated 조직 정지를 필터링하는 데 사용됩니다. 셀은 다음 T75 플라스크 (보통 2-3 배아 수있는 씨앗이 한 T75 플라스크)에 놓는과 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에 배치됩니다. </li><li> 다음 날은 T75 플라스크에서 미디어가 흡입된다. 플라스크는 10 ML PBS로 헹구어 있습니다. 신선한 glia 미디어 (10-15 ML)는 다음 각 플라스크에 추가됩니다. </li><li> 10-12일 내에 T75 플라스크에 glia이 합류해야합니다. Glial 세포는 PBS로 헹구어되며, 0.05 % 트립신의 5 ML은 각 T75 플라스크에 추가됩니다. </li><li> 5 분에 대한 ° C 37 번 트립신의 부화 후, glial 세포가 각각 T75 플라스크에서 dissociated와 glial 세포가 두 개로 분할 아르다른 콜라겐 - 코팅 T75 플라스크. </li><li> 문화 삽입 (Millipore PICM03050)는 6 잘 접시, 콜라겐 코팅을하고, 하루 아침에 공기 건조에 붙여 넣어 준비가되어 있습니다. Glia 미디어 (2 ML 각) 각 문화 삽입 아래에 배치됩니다. </li><li> 합류 T75 플라스크에서 Glia는 trypsinized (6 - 잘 접시 당 하나의 T75 플라스크, 2 ML 각 삽입) 문화 삽입에 놓는 있습니다. 이 glia 문화 삽입은 조건 neuronal 문화를하는 데 사용됩니다. </li></ol> 2. Neuronal 문화 <ol><li> neuronal 문화 유리 coverslips은 70 %에 최소 하루 아침에 HNO 3 몸을 담글 수에 의해 청소됩니다. Coverslips 그 다음 ddH 2 O 적어도 3 번과 세척, 그리고 (&gt; 200 ° C) 밤 Isotemp 오븐에서 건조됩니다. </li><li> 청소 coverslips는 6 잘 플레이트, 잘 당 하나의 coverslip에 배치됩니다. Coverslips는 폴리-L-라이신 솔루션 (100 MM 붕산 2 ML, 0.1 %, 산도 = 8.5) 37 ° C 배양기에서 하룻밤으로 코팅되어 있습니다. </li><li>폴리-L-라이신 솔루션은 coverslips에서 제거되고 coverslips는 autoclaved ddH 2 O.으로 3 번 씻어 아르 Coverslips 그런 다음 37 incubated 아르 (Neurobasal 5 % 열 inactivated 말 혈청, 10 단위 / ML 페니실린, 10 μg / ML 스트렙토 마이신, Glutamax로 보​​충 도금 미디어에서 밤새 ° C 배양기, 도금 매체에 추가됩니다 2퍼센트 B27 보충 하루에)이 사용됩니다. </li><li> B-27와 다음 날, 도금 미디어가 제거되고 신선한 도금 매체 2 ML은 유리 coverslip이 각 잘에 추가됩니다. </li><li> 임산부 마우스 (E15-18)은 CO 2 euthanized되며, 배아 쥐들이 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 해마 나 striatum은 뇌 조직에서 해부하는 각각 hippocampal 뉴런 또는 striatal 중간 가시의 뉴런의 문화 얼음처럼 차가운 분해 버퍼와 15 ML 원뿔 튜브에 배치됩니다. </li><li> 단계 1.4) 및 1.5)에 설명 된대로 해부하는 뇌 조직은 papain과 dissociated 있습니다. </li><li> 에프해리 따르게 각 neuronal 정지 세포의 수는 hemocytometer로 계산됩니다. 뉴런은 다음 6 잘 접시의 당 잘 0.4 X 10 6 세포의 밀도 각 coverslip에 놓는, 그리고 37 ° C 배양기 새벽에 배양합니다 (뉴런이 DIV 0아르). </li><li> 에어컨 neuronal 문화에 대한 glia 문화 삽입을 준비하려면, glia 미디어는 glia 문화 삽입에서 제거하고 신선한 도금 매체는 (삽입 아래에 삽입 2 ML 2 ML) 추가됩니다. </li><li> 다음 날 (DIV 1), 뉴런과 coverslips는 glia 문화 삽입, 각도에 한 coverslip 아래에 배치됩니다. </li><li> 그들은 transfection 및 이미징 실험을위한 준비가 될 때까지 뉴런은 신선한 미리 데워 먹이 미디어 (B-27 포함) 모든 3~4일의 절반 볼륨으로 공급하고 있습니다. </li></ol> 3. Transfection <ol><li> Neuronal transfection은 Lipofectamine 2000을 사용하여 수행됩니다. 각 neuronal 문화 (coverslip 당 하나의 문화), 2 μlLipofectamine 2000 및 DNA 1 μg이 사용됩니다. 더 보충과 신선한 Neurobasal 매체가 Lipofectamine와 DNA를 희석하는 데 사용됩니다. </li><li> DNA와 Lipofectamine은 혼합 후 실온에서 20 분에 incubated 수 있습니다. </li><li> 각 삽입 내에서 각 glia 문화 삽입 아래에서 미디어 1 ML, 1 ML을 저장하고 원추형 튜브로 미디어를 전송합니다. 37 번 저장 매체와 배양 ° C.에 먹이 미디어의 같은 볼륨 + B27를 추가합니다 이 매체는 transfection 후 neuronal 문화에 사용됩니다. </li><li> 20 분 Lipofectamine / DNA 부화 후, glia 문화 삽입은 6 잘 플레이트에서 일시적으로 제거됩니다. 200 μl Lipofectamine / DNA 혼합물은 뉴런 각 coverslip에 추가됩니다. glia 문화 삽입은 다음 뉴런 위의 각도에 반환됩니다. 문화 삽입의 멤브레인에 따라 거품의 생성은 피해야합니다. 뉴런은 2-4 시간에 37 ° C에서 Lipofectamine / DNA 혼합물에 incubated 수 있습니다. </li><li> 일 후전자 2-4 시간의 잠복기는 glia 삽입 다시 제거됩니다. Lipofectamine / DNA을 담은 문화 미디어는 각도에서 제거됩니다. 단계 3.3)에 저장된 미디어는 뉴런 (2 ML 잘 당)에 추가됩니다. Glia 문화 삽입은 각도에 반환되며, 각각의 삽입에서 glia 미디어가 제거되며, 단계 3.3)에서 미디어의 2 ML은 각 삽입에 추가됩니다. </li><li> 뉴런은 TIRF 영상 전에 transfected cDNA의 표현은 이러한 뉴런에 수행 수 있도록 추가 24-72 시간에 배양되어 있습니다. </li></ol> 4. TIRF 영상 <ol><li> 인공 뇌척수 (aCSF : 119 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 30 MM 포도당, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 25 MM HEPES, = 7.4 산도)는 실시간 영상 실험에 사용됩니다. 우리 TIRF 영상 시스템은 여기에 100 MW 청록색 레이저로 맞춤 설정이며, 전자 배가 요금은 검출기에 대한 장치 (EMCCD) 카메라를 결합. </li><li> 이미징 실험에 앞서, aCSF은 37 &amp; D에 경고합니다예를 들어, 최소 30 분을위한 C 물 목욕. 라이브 영상에 대한 가열 삽입은 현미경 스테이지에 배치되며, 가열 삽입, 레이저, 카메라가 이미징 실험을 시작하기 전에 최소 30 분 동안 따뜻하게합니다. </li><li> transfected 뉴런과 coverslip은 라이브 이미징 챔버로 조립된다. 챔버가 조립 한 후 미리 예열 aCSF은 챔버에 배치됩니다,이 단계는 가능한 한 빨리 완료해야합니다. </li><li> 챔버는 현미경 무대에서 가열 삽입에 배치되면, transfected 뉴런은 시각적으로 에피 형광 이미징 모드에서 확인할 수 있습니다. </li><li> 건강 transfected 뉴런은 (그림 1과 2 참조) 확인 후 플라즈마 막에 pHluorin - 수용체가 매우 높은 형광 수준의 때를 같이, 우리는 일반적으로 플라즈마 막에 기존 pHluorin의 형광을 제거하는 사진 표백제의 1 분을 수행 TIRF 영상이 처음 시작되어있는 개별 기능의 시각화를 방해ertion 이벤트. </li><li> photobleach 후, EMCCD 카메라의 전자 증 배기의 게인 설정이 최대로 설정되어 있으며, 녹화 10 Hz에서 1 분을 위해 수행됩니다. </li><li> 각 기록은 600 이미지가 포함됩니다. 개인 삽입 이벤트는 ImageJ를 사용하여 녹화를 다시 재생하여 확인할 수 있습니다. 개인 삽입 이벤트가 수동으로 ImageJ를 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 일관성 neuronal 문화는 성공적으로 라이브 영상 실험의 핵심입니다. 그림 1은 마우스 hippocampal 뉴런이 18 사업부하기 위해 DIV 11 일부터 우리의 프로토콜을 사용하여 배양 보여줍니다. 그것은 뉴런이 광범위한 프로세스를 개발하고 있다는 한 이미지에서 수지상 프로세스가 수지상 쪽이 뉴런이 문화에 건강하다고 징후와 밀도가 덮여 분명하다. 우리의 문화 프로토콜은 뇌의 뉴런의 다른 유형을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 최근의 문화에이 프로토콜을 사용교양 마우스 striatal 중간 가시의 뉴런 9 도파민 D2 수용체 (DRD2) 삽입을 시험하는 연구 striatal 중간 가시의 뉴런. 그림 2는 마우스 striatal 매체 가시의 뉴런이 DIV 8시에 우리의 프로토콜을 사용하여 배양 보여줍니다. 또한, 우리는 성공적으로 신경이 유형의 superecliptic pHluorin 태그 DRD2s의 TIRF 영상을 수행했습니다. 그림 3의 표현을 보여줍니다 pHluorin 태그이 신경 세포에서 산도 - DRD2 삽입 중간 가시의 뉴런 및 시각화에 DRD2 (산도 - DRD2). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> 인터페이스의 문화 방법을 사용하여 그림 1. 마우스를 hippocampal 문화. DIV : 체외의 일, 문화의 날은 DIV 0으로 간주됩니다. 이미지에서, 그것은 분명입니다 DIV 11 DIV 15 일까지 문화의 유형의 성숙한 hippocampal 뉴런. DIV 11 13, neuronal 수석은 filipodia와 미숙 한 쪽으로 덮여 있습니다. DIV 15시18, neuronal 수석은 큰 쪽과보다 성숙한 뉴런의 표시를 적용하고 있습니다. 왼쪽 패널 : 낮은 배율 다른 연령대에 마우스를 hippocampal 뉴런의 이미지. 오른쪽 패널 : 높은 배율의 이미지 (왼쪽 패널의 neuronal 수석을 확대) 다른 연령대에서 수지상 쪽과 neuronal 수지상 프로세스. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> 인터페이스의 문화 방법을 사용하여 그림 2. 마우스 striatal 중간 가시 뉴런 문화. 이미지의 뉴런은 DIV 8 이용하실 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> 그림 3. 슈퍼 황도 pHluorin 태그 도파민 D2 수용체 (산도 - DRD2)와 transfected 마우스 striatal 중간 가시의 뉴런. 왼쪽의 이미지는 시간 경과 기록의 최대 강도 투사 (600 이미지, 이미지 당 100 밀리 초)입니다. 화이트 화살촉은 산도-D의 개별 기공을 갖는 삽입을 나타냅니다RD2. 이 이미지는 XY 치수에 삽입 정보를 유지하지만 시간 정보를 잃는다. 오른쪽 이미지는 xyt 스택이 y 축 중심으로 회전 90도이며, 각각의 X 축 라인의 최대 픽셀이 하나의 y 축 픽셀에 투영되는, YT 최대 강도 투영을 보여줍니다. 이 이미지는 YT 축을 따라 삽입 정보를 유지하지만 X 축 정보를 잃는다.

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

알 수없는 이유로, 마우스 뉴런은 항상 쥐 뉴런보다 문화에 더 어렵습니다. 우리의 경험에서, 뉴런과 glia의 혼합 문화는 기본 교양 마우스 뉴런에 적합합니다. neuronal somata 및 TIRF 현미경의 범위 이외의 수지상 프로세스를 situating, glia 세포의 상단에 성장하는 경향이 문화 뉴런과 프로세스의이 유형에서와 같이 그러나, 이러한 혼합 문화, TIRF 영상 실험에 적합하지 않습니다. 따라서 coverslip에 몇 glia과 낮은 밀도 neuronal 문화는 TIRF 영상에 이상적입니다. 배양 접시의 바닥이 glia에 놓는 있으며, 뉴런이 coverslip에 놓는되고 문화 접시에 거꾸로 배치하는 20 일, 우리는 먼저 은행원 방법 19 테스트. coverslip과 glia 층은 coverslip에 왁스의 세 작은 물방울로 구분됩니다. 이 방법은 작은 크기의 coverslips (예 : 15 mm 또는 18 mm coverslips)에 대해 잘 작동하지만, 우리는 2...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 정화 소 콜라겐 솔루션 (Purecol)</td&gt;<td&gt; 고급 Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 나트륨 pyruvate</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM 높은 혈당</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 태아 소 혈청 (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; papain</td&gt;<td&gt; 워싱턴 생물 화학 주식회사</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td소 췌장에서&gt; Deoxyribonuclease I (DNase I)</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco의 인산은 (DPBS) 식염 버퍼</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0.05 % 트립신</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 폴리-L-라이신의 브롬화 수소산</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 붕산</td&gt;<td&gt; 피셔 - 과학</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal 중</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 세럼 - 무료 보충</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 열 비활성 말 혈청</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11,668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; 피셔 - 과학</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 문화 삽입</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 phluorin 태그

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

플라즈마 막 (PM)와 세포 내 구획 사이의 수용체 거래에 관한 메커니즘의 이해 뛰어난 공간과 시간적 해상도와 실험 방법이 필요합니다. 또한, 이러한 접근은 또한 세포 내 구획에있는 사람들의 PM에 지역화 수용체를 구별 할 수있는 능력이 있어야합니다. 각 소포는 수용체 만 소수를 운반 때문에 가장 중요한 것은, 하나의 소포에 수용체를 감지하는 것은, 뛰어난 감지 감도를 필요로합니다. 와 세포의 화학적 고정을 필요로 immunolabeled 표면 수용체의 형광 현미경 검사, 따라서 충분한 시간적 해상도 1-6 부족, 수용체 거래를 검사에 대한 표준 접근 방식은 필요한 공간과 시간적 해상도를 모두 부족 생화학 감지, 다음 표면 biotinylation이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리와 다른 사람들은 개발하고 새로운 stra을 고용했습니다7-17 뛰어난 공간과 시간적 해상도 PM에 수용체의 동적 삽입 시각화 수 있습니다 tegy 그. 방법은 수용체의 N-터미널 세포 도메인에 산도에 민감한 GFP, superecliptic pHluorin 18의 태그를 포함하고 있습니다. Superecliptic pHluorin은 산성의 pH를 중성 산도의 비 형광 (산도 &lt;6.0)에서 형광 것의 고유 한 속성이 있습니다. 따라서 태그 수용체가 아닌 형광 때 세포 거래 소포 나 endosomal 구획의 산성 루멘 내에 있으며, 그들은 PM의 외부 표면에 세포 중성 pH의 환경에 노출 한 경우에만 쉽게 시각화된다. 우리의 전략은 결과적으로 우리는 세포 거래 소포 내에 이러한에서 PM 표면 수용체를 구별 할 수 있습니다. 충분한 공간과 시간적 해상도뿐만 아니라 수용체의 동적 인신 매매를 연구하는 데 필요한 감도를 달성하기 위해, 우리는 고용 반영 내부 전체우리는 광학 이미징 (~ 170 nm 정도)의 최적의 공간 해상도를 달성하기 위해 활성화 이온 형광 현미경 (TIRFM)는, 비디오 속도 현미경 (30 프레임 / 초), 그리고 감도의 시간 해상도는 단일 GFP의 형광 검출 방법 분자. 영상으로 TIRFM에 따라 수용체, 우리가 직접 각각의 수용체 삽입 행사 교양 뉴런의 PM에를 시각화 할 수 있었다 pHluorin는 태그. 이 영상 접근법은 잠재적으로 superecliptic pHluorin로 표시 될 수 세포 도메인으로 모든 막 단백질에 적용 할 수 있으며, 다른 막 단백질 (수용체, 이온 채널, 운반 등)의 삽입을 위해 운영 주요 자세한 메커니즘 절개를 수 PM.

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

세포막(PM)과 세포 내 소기관 사이의 수용체 트래픽킹을 조절하는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 ...

다음 실험의 전반적인 목표는 배양된 일차 마우스 뉴런의 세포막에 뉴런 수용체가 삽입되는 과정을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 배아 또는 신생 마우스의 대뇌 피질에서 마우스 GL을 얻어 반투과성 콜라겐 코팅 배양 인서트에서 배양합니다. 글리아 배양물은 커버슬립 위의 일차 배아 해마 뉴런 상단에 부유 시킵니다.그 후 7일간의 컨디셔닝을 거쳐, 뉴런에 super ecliptic fluorine이 태그된 dopamine D two receptor를 트랜스펙션합니다. 태그된 수용체는 세포 내 소포에 국소화되지만, 소포 내부의 산성 환경에서는 형광을 나타내지 않습니다. 그러나 소포가 세포막과 융합되면, Fluorin이 세포 외 환경의 중성 pH에 노출되어 밝게 형광을 발하며, 이를 통해 전반사 형광 현미경으로 검출이 가능해집니다.이 방법은 막 단백질 수송 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 글루탐산 수용체 및 G 단백질 결합 수용체와 같이 불소로 표지할 수 있는 모든 막 단백질의 수송을 시각화할 수 있게 해줍니다. 오늘 저와 함께 이 절차를 시연할 사람은 breeding dry와 and, 그리고 저희 연구 그룹의 다른 두 구성원입니다. 해부 절차 전날, 콜라겐 용액이 담긴 T 75 플라스크를 똑바로 세워 밤새 건조시킵니다. 글리아 배양 당일, 37 °C 항온수조에서 글리아 배양액을 최소 30분 동안 데웁니다. 안락사 후, 해부 현미경 하에서 배아 또는 신생 마우스의 대뇌 피질을 해부합니다.제거한 피질을 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(A CSF)이 채워진 15 milliliter 원심분리관에 넣습니다. 그다음, A CSF를 2 milliliter만 남기고 모두 제거한 후, pepane 용액 100 microliters와 1%DNAs.One 20 microliters를 첨가합니다. 튜브를 37 degrees Celsius 항온수조에 넣고 조직이 20분 동안 소화되도록 둡니다.소화 과정 후, 프로판 용액을 조심스럽게 제거하고 미리 데워둔 glial medium 10 milliliters를 첨가하여 뇌 조직을 세심하게 세척합니다. 그다음 조직이 손상되지 않도록 주의하며, glial medium을 가능한 한 많이 제거합니다.신선한 glial medium 2 mL를 첨가하고, 화염 연마된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직이 더 이상 보이지 않을 때까지 삼차례 트리트(triturate)합니다. 조직이 완전히 해리된 후에는 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 신선한 glial medium 8 mL를 추가로 첨가하고, 현탁액을 70 micron 셀 스트레이너(cell strainer)로 피펫팅하여 거릅니다.통과액을 50 mL 원추형 튜브에 수집합니다. 2~3개의 배아에서 분리된 세포를 콜라겐 코팅된 T 75 플라스크로 옮기고 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 배지를 흡입하여 제거합니다. PBS 10 mL로 세포를 한 번 헹굽니다.그 다음 각 플라스크에 신선한 glial medium 10 to 15 milliliters를 추가합니다. 3~4일마다 배지를 교체하며 배양물을 10 to 12 days 동안 배양합니다. 세포가 confluent 상태가 되면, glial cell을 PBS로 헹굽니다.그런 다음 0.05% trypsin 5 mL를 플라스크에 넣고 37 °C에서 5분 동안 세포가 분리되도록 둡니다. 짧은 배양 후, glial medium을 추가하고 피펫팅하여 플라스크 바닥에서 GL을 분리합니다. 분리된 세포를 콜라겐이 코팅된 새로운 T 75 플라스크 두 개에 나누어 담습니다.세포가 합류 상태에 도달하면 이전과 동일하게 트립신 처리하고, 각 플라스크의 내용을 콜라겐이 코팅된 배양 인서트가 포함된 6-웰 플레이트에 분주합니다. 2 mL의 글리아 배양액 위에 배치하여 세포를 1~7일 동안 배양합니다. 이 글리아 배양 인서트는 신경세포 배양액을 조건화하는 데 사용됩니다.세척된 polylysine 코팅 커버슬립이 들어 있는 6-well 플레이트의 각 웰에 4 mL의 도말 배지를 넣고, 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 보관합니다. 이 단계는 다음 날 잔류 polylysine을 제거함으로써 뉴런의 생존 가능성을 높여줍니다. 도말 배지를 제거하고 2 mL의 신선한 도말 배지로 교체합니다.해마 뉴런 배양을 위한 2% Supplement B 27이 포함된 배지. 해부 현미경 하에서 E 15~18 배아 마우스 4마리의 뇌 조직으로부터 해마를 적출하십시오. 적출한 해마를 얼음처럼 차가운 해부 버퍼가 들어있는 15 milliliter 원심분리관에 넣으십시오.다음으로, E 15에서 18 사이의 배아 생쥐 3마리의 뇌 조직에서 선조체를 분리하여 얼음처럼 차가운 분리 완충액이 담긴 별도의 15 milliliter 원추형 튜브에 넣습니다. 이전과 동일하게 pepane을 사용하여 조직을 소화시킵니다. 그런 다음 혈구계수기를 사용합니다.각 신경세포 현탁액 내의 세포 수를 결정하고 분주합니다. 커버슬립당 0.4 × 10⁶개의 세포를 분주하고 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 신경세포 배양액의 컨디셔닝을 위한 글리아 세포 배양 인서트를 준비하려면, 글리아 세포 배양 인서트와 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거하고 각각 2 mL의 신선한 플레이팅 배지로 교체합니다.다음 날, 뉴런이 포함된 커버슬립을 글리아 배양 인서트 아래의 디쉬 내 각 웰에 배치합니다. 37 °C에서 배양을 계속합니다. transfection 및 이미징 실험 준비가 될 때까지 3~4일마다 배지의 절반을 B 27이 포함된 미리 데워진 신선한 피딩 배지로 교체합니다.뉴런은 배양 7일 차에 트랜스펙션을 수행하고 8일 차에 이미징합니다. 일관된 뉴런 배양은 성공적인 라이브 이미징 실험의 핵심입니다. 이 그림은 본 프로토콜을 사용하여 in vitro 11일 차부터 18일 차까지 배양한 마우스 해마 뉴런을 보여줍니다.이미지를 통해 뉴런이 광범위한 돌기를 발달시켰으며, 수지상 돌기가 수지상 돌기 가시로 조밀하게 덮여 있음을 명확히 알 수 있습니다. 이는 각 뉴런 배양에서 뉴런이 배양액 내에서 건강하다는 지표입니다. 2001 µg의 DNA와 super ecliptic Florin이 태그된 dopamine D2 수용체를 코딩하는 lipectomy 2 µL를 혼합하였습니다.혼합한 후 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 각 glial culture insert의 하단에서 1 mL, 내부에서 1 mL의 배지를 각각 취하여 동일한 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 보관된 배지에 동일한 부피의 B 27가 포함된 feeding medium을 첨가하고 37 °C에서 배양합니다.이 배지는 20분간의 lipofectamine DNA 배양 후, 트랜스펙션 이후의 뉴런 배양에 사용됩니다. 6웰 플레이트에서 글리아 배양 인서트를 제거하십시오. 뉴런이 있는 각 커버스립에 200 µL의 lipofectamine DNA 혼합물을 첨가하십시오.배양 막 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 글리아 배양 인서트를 교체하고 37 °C에서 2~4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 글리아 인서트를 다시 제거하고 각 웰에서 트랜스펙션 용액을 흡입하여 제거한 다음, 이전에 보관해 두었던 배지 2 mL를 뉴런에 첨가하고 글리아 배양 인서트를 다시 넣습니다.마지막으로, 각 인서트에서 글리아 배지를 제거하고 보관해 둔 배지 2 mL를 각 배양액에 추가합니다. 형질전환된 CD NA가 발현될 수 있도록 세포를 24~72시간 동안 추가로 배양합니다. 이 비디오에 사용된 TIRF 이미징 시스템은 여기를 위한 100 mW 시안 레이저와 검출기로서의 전자 증배 전하결합소자(EMCCD) 카메라로 구성된 맞춤형 설정입니다. 이미징 시작 30분 전에 수조에서 aCSF를 37 °C로 가온합니다. 또한, 레이저와 카메라, 가온 인서트를 켜고 가온 인서트를 현미경 스테이지 위에 배치합니다.형질전환된 뉴런이 있는 커버슬립을 라이브 이미징 챔버에 넣고, 미리 데워둔 A CSF를 빠르게 첨가합니다. 에피 형광 이미징 모드에서 챔버를 현미경 스테이지의 가열 인서트 위에 놓고 형질전환된 뉴런을 확인합니다. 그 다음 TIRF 이미징 모드에서, 세포막에 기존에 존재하던 형광을 제거하기 위해 뉴런을 1분 동안 광퇴색시킵니다.다음으로, E-M-C-C-D 카메라의 전자 증배기(electron multiplier) 게인 설정을 최대로 설정하고, 10 Hz의 속도로 1분 동안 이미지 촬영을 시작합니다. 촬영이 완료되면 각 기록에는 총 600장의 이미지가 포함됩니다. Image J를 사용하여 데이터를 분석함으로써 도파민 D2 수용체의 막 삽입(membrane insertion) 정도를 결정합니다.마우스 선조체 중간 가시 뉴런에 super ecliptic fluorophore가 태그된 도파민 D2 수용체(pHluorin-tagged dopamine D2 receptor, pH D2)를 트랜스펙션하였습니다. 이후 100ms마다 한 장씩 총 600장의 이미지를 촬영하는 실시간 TIRF 이미징을 수행하였습니다. 본 이미지는 타임랩스 기록의 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 결과이며, 흰색 화살표는 pH D2를 함유한 개별 소포가 세포막과 융합된 지점을 나타냅니다.이 이미지는 XYT 스택을 Y축을 중심으로 90도 회전시킨 후, 각 X축 라인에서 최대 픽셀 값을 단일 Y축 픽셀에 투영한 YT 최대 강도 투영(maximum intensity projection)을 보여줍니다. 삽입 시점에 대한 정보를 제공하기 위해, 이 데이터는 이 방법이 개발 이후 배양된 마우스 뉴런에서 수용체의 세포막 삽입 조절을 조사하는 데 성공적으로 활용될 수 있음을 입증합니다. 이 기술은 뉴런 수용체 트래픽킹 분야의 연구자들이 다른 뉴런 세포막 수용체, 채널 및 운반체의 조절 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 electroporation과 문화 마우스 hippocampal 및 대뇌 피질의 뉴런을 통해 transfect, 해부하다하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 장기 문화가 synaptogenesis 및 돌기 척추 분석 연구에 사용할 수 있지만 단기 문화는 축삭의 파생물과지도의 연구에 사용할 수 있습니다.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

출처: Lacin, E., et al. 생체 내 신경 전달 물질의 광학 검출을 위한 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)의 구성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 피질에 사전 주입된 특수 리포터 세포인 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)를 사용하여 생체 내 신경 전달 물질 방출을 이미징하는 기술을 보여줍니다. 2광자 현미경 아래에 위치한 마우스는 형광 방출을 통해 신경 전달 물질 유도 칼슘 신호를 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 CNiFER의 G-단백질 결합 수용체에 대한 신경 전달 물질 결합을 활용하여 칼슘 방출 및 형광을 유발하여 신경 전달 물질 활성을 실시간으로 감지합니다.

세포 기반 신경 전달 물질 형광 조작 리포터를 사용한 이미징 신경 전달 물질 방출

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

여기 아 밀 로이드 β (Aβ)는 뇌에서의 초기 효과 조사 하기 위해 프로토콜 제공 됩니다.  이것은 clathrin 중재 된 endocytosis 및 axonal 성장 콘의 붕괴 유도 하는 Aβ 보여준다. 프로토콜 axonal 성장 콘에 Aβ의 초기 효과 공부에 유용 하 고 알 츠 하이 머 병의 예방을 촉진 수 있습니다.

시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

여기에서 우리는 시험관 외 Ca에서 측정 하는 프로토콜을 제시2+ 중간 뇌 뉴런에서 플럭스와 1 차 마우스 중간 두뇌 문화를 사용 하 여 caspase-3에 그들의 다운 스트림 효과. 이 모델은 중뇌 뉴런에서 비정상적인 Ca2+ 활동과 관련된 병리학적 변화를 연구하고, 세포세포 항세포 특성에 대한 새로운 치료법을 선별하기 위해 사용될 수 있다.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

배우세요 pHluorin 태그를 이용하여 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 도파민 D2 수용체 삽입을 실시간 이미징하는 방법입니다. TIRF 현미경으로 수용체 역학을 관찰하여 신경 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

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