이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

다음 실험의 전반적인 목표는 배양된 1차 마우스 뉴런의 원형질막에 삽입되는 뉴런 수용체를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 마우스 GL을 배아 또는 신생아 마우스의 대뇌 피질에서 얻고 반투과성 콜라겐 코팅 배양 삽입물에서 성장시킵니다. 신경교 배양은 커버 슬립의 1 차 배아 해마 뉴런에 매달려 있습니다.

그런 다음 7일간의 조건화 후, 뉴런은 도파민 D 2 수용체로 분류된 초황도 불소로 형질주입됩니다. 태그가 지정된 수용체는 세포 내 소포에 국한되지만 소포의 산성 환경 내에서 형광성이 없는 상태로 남아 있습니다. 그러나 소포가 원형질막과 합쳐지면 플로린은 세포외 환경의 중성 pH에 노출되고 밝게 형광을 발하여 전반사 형광 현미경으로 검출할 수 있습니다.

이 방법은 멤브레인 단백질 트래픽 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 글루타메이트 수용체 및 gpro 결합 수용체와 같이 불소로 표지할 수 있는 모든 멤브레인 단백질의 트래픽을 시각화할 수 있습니다. 오늘 저와 함께 절차를 시연하는 것은 건조하게 번식할 것이며, 우리 연구 그룹의 다른 두 구성원은 해부 절차 전날 콜라겐 용액이 든 T 75 플라스크를 플라스크를 똑바로 세우고 밤새 건조시킵니다. 신경교 배양 당일에는 안락사 후 섭씨 30도의 수조에서 최소 37분 동안 신경교 배지를 데우고 해부 현미경으로 배아 또는 신생아 마우스의 대뇌 피질을 해부합니다.

제거된 피질을 얼음, 차가운 인공 뇌척수액 또는 A CSF로 채워진 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 다음으로, A CSF의 2 밀리리터를 제외한 모든 것을 제거하고 100 마이크로 리터의 페판 용액과 20 마이크로 리터의 1 % DNAs.One을 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 조직이 20분 동안 소화되도록 합니다.

소화 후 프로판 용액을 조심스럽게 제거하고 10ml의 예열 신경교 배지를 추가하여 뇌 조직을 조심스럽게 씻습니다. 그런 다음 조직을 방해하지 않도록주의하십시오. 가능한 한 많은 신경교 매체를 제거하십시오.

2ml의 신선한 신경교세포(glial) 배지를 첨가하고 조직이 더 이상 보이지 않을 때까지 피펫 트라이 레이트를 지나 화염 광택 유리를 사용합니다. 조직이 완전히 해리되면 기포가 형성되지 않도록 합니다. 8ml의 새로운 신경교세포(glial medium)를 추가로 첨가하고 70미크론 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 피펫팅합니다.

50ml 원추형 튜브에 흐름을 수집합니다. 2-3개의 배아에서 해리된 세포를 콜라겐으로 코팅된 T 75 플라스크로 옮기고 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 배양에서 다음날 밤새 배지를 흡인합니다. PBS 10ml로 세포를 한 번 헹굽니다.

그런 다음 각 플라스크에 10-15 밀리리터의 신선한 신경교 매체를 추가합니다. 10-12일 동안 배양물을 배양하고 3-4일마다 배지를 교체합니다. 일단 합류하면 PBS로 신경교세포를 헹굽니다.

그런 다음 플라스크에 5mm의 0.05% 트립을 넣고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 분리합니다. 짧은 배양 후 glial 배지와 피펫을 추가하여 플라스크 바닥에서 GL을 분리합니다. 세포를 두 개의 새로운 콜라겐 코팅된 T 75 플라스크로 분할합니다.

이러한 도달 컨플루언스 트립은 이전과 같이 아니화하고 각 플라스크의 내용물을 콜라겐으로 코팅된 배양 삽입물을 포함하는 6개의 웰 플레이트에 파종합니다. 2 밀리리터 이상의 신경교 배양 배지를 1 일에서 7 일 동안 세포에 배치. 이러한 신경교배양 삽입물은 신경세포 배양을 조절하는 데 사용됩니다.

세척된 폴리리신으로 코팅된 커버 슬립이 들어 있는 6웰 플레이트의 각 웰에 4밀리리터의 도금 매체를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 이 단계는 신경세포의 생존 가능성을 높이는데, 아마도 다음 날 잔류 폴리리신을 제거함으로써 가능합니다. 도금 매체를 제거하고 2ml의 새 도금으로 교체하십시오.

배지의 2%를 포함하는 배지. 해마 뉴런의 배양에 대한 보충 B 27 해부 현미경으로, 4 개의 E 15-18 배아 마우스의 뇌 조직에서 하마 campi를 해부합니다. 하마 캄피를 얼음 냉간 해부 완충액이 있는 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.

다음으로, E 15-18 배아 마우스 3마리의 뇌 조직에서 선조체를 해부하고 얼음처럼 차가운 해부 완충액이 있는 별도의 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 이전과 같이 페판으로 조직을 소화하십시오. 그런 다음 혈류 세포 분석기를 사용합니다.

각 신경 세포 현탁액과 시드에 있는 세포의 수를 결정합니다. 각 커버는 0.4 곱하기 10에서 여섯 번째 세포로 미끄러지고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 신경 세포 배양을 조절하기 위해 신경교 배양 삽입물을 준비하려면 신경교 배양 삽입물 및 플레이트에서 배지를 흡인하고 각각을 2ml의 새 도금으로 교체합니다.

다음날 매체 : 신경교 배양 삽입 아래의 접시의 각 우물에있는 뉴런과 함께 덮개 슬립을 놓습니다. 3-4일에 한 번씩 섭씨 37도에서 계속 배양합니다. 배지의 절반을 transfection 및 이미징 실험을 위해 준비될 때까지 B 27을 함유한 신선한 사전 예열 공급으로 교체합니다.

뉴런은 배양 7일째에 형질주입되고 배양 8일째에 이미지화됩니다. 일관된 신경 세포 배양은 성공적인 라이브 이미징 실험의 핵심입니다. 이 그림은 시험관 내 11일에서 시험관 내 18일까지 이 프로토콜을 사용하여 배양된 쥐 해마 뉴런을 보여줍니다.

이미지를 통해 뉴런이 광범위한 과정을 발달시켰고 수지상 돌기가 수지상 가시로 빽빽하게 덮여 있다는 것이 분명합니다. 이러한 뉴런이 각 뉴런 배양에 대한 배양에서 건강하다는 표시. 2001 년 DNA의 마이크로 그램에 지방 절제술의 두 마이크로 리터를 결합하고 슈퍼 황도 플로린으로 태그된 도파민 D 두 수용체를 암호화합니다.

섞어서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 아래에서 1ml의 배지를 제거하고 각 glial 배양 인서트 내부에서 1ml를 동일한 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 B 27과 동일한 부피의 공급 매체를 저장된 배지에 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다.

이 배지는 20분 립 효과 평균 DNA 배양 후 형질주입 후 뉴런 배양에 사용됩니다. 6개의 웰 플레이트에서 신경교배양 삽입물을 제거합니다. 200마이크로리터의 지방 절제술 DNA 혼합물을 뉴런이 있는 각 커버 슬립에 추가합니다.

배양막의 아래에 기포가 생성되지 않도록 하십시오. 신경교배양 삽입물을 교체하고 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 배양합니다. 배양 후, glial inserts를 다시 제거하고 각 well에서 transfection solution을 흡인시킨 다음 이전에 neuron에 저장된 2ml의 배지를 추가하고 glial 배양 insert를 교체합니다.

마지막으로, 각 삽입물에서 신경교세포(glial medium)를 제거하고 저장된 배지 2ml를 각 배양물에 추가합니다. transfection된 CD NA의 발현을 허용하기 위해 추가로 24 - 72시간 동안 세포를 유지했습니다. 이 비디오에 사용된 TIRF 이미징 시스템은 여기(excitation)를 위한 100밀리와트 시안(cyan) 레이저와 검출기를 위한 전자 증식 전하 결합 소자 카메라(electron multiplying charge coupled device camera)를 갖춘 맞춤형 설정으로, 이미징 시작 30분 전에 수조에서 A CSF를 섭씨 37도까지 데웁니다. 또한 레이저와 카메라, 발열체를 켜고 발열체를 현미경 스테이지에 올려놓는다.

transfection된 뉴런이 있는 커버 슬립을 라이브 이미징 챔버에 놓고 사전 예열된 A CSF를 빠르게 추가합니다. epi 형광 이미징 모드에서 현미경 스테이지의 가열 인서트에 챔버를 놓고 형질 주입된 뉴런을 식별합니다. 그런 다음 TIRF 이미징 모드에서 1분 동안 뉴런을 광표백하여 원형질막에 이미 존재하는 불소 형광을 제거합니다.

그런 다음 E-M-C-C-D 카메라의 전자 증배관 게인 설정을 최대로 설정하고 10헤르츠에서 1분 동안 이미지 촬영을 시작합니다. 모든 이미징이 완료되면 각 녹화에는 600개의 이미지가 포함됩니다. 이미지 J를 사용하여 데이터를 분석하여 도파민 D 두 수용체의 막 삽입을 확인합니다.

생쥐 샐 매체 가시 뉴런은 초황도로 형질주입되었다. 그런 다음 플로린에 도파민 D, 2개의 수용체, PDR D, 2개의 라이브 TIRF 이미징을 수행하여 100밀리초마다 하나의 이미지 비율로 600개의 이미지를 촬영했습니다. 이 이미지는 타임 랩스 기록의 최대 강도 투영을 보여주며, 흰색 화살촉은 pH DD 2를 포함하는 개별 소포가 원형질막과 융합된 위치를 나타냅니다.

이 이미지는 XYT 스택이 Y축을 중심으로 90도 회전하고 각 X축 선의 최대 픽셀이 단일 y축 픽셀에 투영되는 YT 최대 강도 투영을 보여줍니다. 삽입 타임라인에 대한 정보를 제공하기 위해, 이러한 데이터는 이 방법이 발달 후 배양된 마우스 뉴런에서 수용체의 원형질막 삽입 조절을 조사하는 데 성공적으로 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 뉴런 수용체 밀매 분야의 연구자들이 다른 뉴로노 원형질막 수용체, 채널 및 수송체의 규정을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.