Name: 침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 쥐 태아 침샘 상피세포에서 아데노바이러스를 이용한 유전자 조작 기법을 통해 분기형태형성에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 복잡한 장기에서 특정 조직 구획만 유전적으로 변형할 수 있어 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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저자는 도움이 의견들과 원고의 중요한 독서 박사 드레 넬슨 감사드립니다. 이 작품은 올 버니에있는 대학 SUNY에 대한 NIH 보조금 DE019244, DE019197, 그리고 DE021841 ML까지, F32DE02098001 SJS까지, C06 RR015464로 운영되었습니다.

프로토콜은 그림 1에 설명 된 네 개의 주요 단계가 포함되어 있습니다. 모든 단계는 전체 자세히 설명되어 있습니다. 아데노 바이러스 건설 바이러스 정화는 해부하는 상피 초보의 유전 형질 도입에 사용하기 위해 장기 수확을 사전에 수행해야합니다. adenoviruses과 함께 작업 할 때 모든 표준 BSL-2 안전 조치를 준수해야합니다. 1. 마우스 배아 턱밑 분비선 (SMG) 수확 및 Microdissection <ol><li> 배아 일 13시 마우스 배아의 자궁 전위와 수확 문자열 (E13, 3-5 상피 꽃 봉오리) 기관 IACUC의 승인을 다음 절차에 이어 CO 2 마취법을 사용하여 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스 (outbred 변형 CD-1 또는 ICR)을 안락사시켜야 위원회. 질 플러그 발견의 날은 E0로 지정되어 있습니다. 갈라진 틈은 단지 시작과 하나의 주요 꽃 봉오리와 줄기가있을 때 침샘도 E12 단계에서 수확하고 배양 할 수 있습니다시작합니다. 이전 단계에 SMGs 여기에 표시된 것보다 다른 문화 조건을 필요로합니다. </li><li> 페놀 레드 (생명 기술), 100 U / ML 페니실린과 보충, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성이 부족한 DMEM / 햄의 F12 매체 (F12)의 25 ML로 가득 무균 10cm 조직 문화 요리에 배아 문자열을 전송, 생활 기술을). </li><li> 멸균 메스 (# 11 블레이드)와 집게를 (# 5, 정밀 과학 도구, 11252-20)를 사용하여, DMEM/F12 + 펜 패 혈성의 25 ML을 포함하는 별도의 10cm 접시에 주머니에서 배아를 제거합니다. </li><li> 단지 아래턱 아래의 각진 컷으로 배아 머리를 자르다. </li><li> 상단 턱 아래 컷을 사용하여 전송 라이트베이스 (니콘 SMZ645 또는 동급)와 스테레오 해부 현미경 헤드의 낮은 개미를 분리합니다. 유리의 추가 작품의 상단에보다는 직접 현미경베이스의 유리 구성 요소에 조직을 배치합니다. </li><li> DM 3 ML로 낮은 개미를 수집EM/F12 + 살균 35mm 조직 배양 접시에 펜 패 혈성. </li><li> 혀는 슬라이스의 맨 아래에 있지만 12시시 위치쪽으로 향하고되도록 해부 현미경 무대에 턱이 슬라이스를 놓습니다. </li><li> scissoring 모션에서 두 짓밟 포셉의 한면을 사용하여 제거하고 아래턱 슬라이스의 3분의 1 낮은 회를 폐기하십시오. </li><li> 포셉과 scissoring 컷을 사용하여 슬라이스 90 오른쪽에 ° (오른 손잡이 경우) 등을 돌려, 중간 슬라이스로 아래턱 슬라이스의 상단 부분을 (혀를 절단하지 않고) 절단. </li><li> 필 초과 거리에 조직과 아래 SMGs를 노출 할을 제거합니다. 혀의 기지 근처 각면에 하나가 될 것입니다. </li><li> 혀에 의해 조직을 누르고 포셉 한 쌍의를 사용하여 혀에서 SMG을 멀리 감히 다른 집게를 사용합니다. 다른 선에 대해 반복합니다. </li><li> 새로운 살균 35mm 조직에 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 3 ML에 microdissected 침샘을 수집배양 접시. 참고 : 연결된 작은 sublingual 글 랜드 (1 꽃 봉오리)와 함께 큰 턱밑 분비 (3-5 상피 꽃 봉오리)이 4 단계로 건너와 단계 4.1 4.3 수행하고, 4.4에서 그대로 배양 할 수와 같은 이전에 2,8 설명했다. </li></ol> 2. 상피 흔적 기관 분리를 SMG <ol><li> 장소 5 (이상) 행크의 균형 소금 솔루션 200 μl (HBSS는 칼슘이 부족한를 포함하는 유리 바닥, 50mm 직경 microwell 요리 (MatTek 공사, P50G-1.5-14-F)로 침샘 + + 또는 MG + +, 생명 기술) 0.4 %를 포함 (V / V) dispase (생명 기술, 고양이. 안돼. 17105-041)와 37 15 분에 품다 ° C. </li><li> 부화 후, 멸균 200 μl 피펫 팁 사용하여 조심스럽게 분비를 방해하지 않으면 서 dispase 솔루션을 기음. 즉시 BSA (DMEM/F12-BSA, 필터 0.22 μm와 사전 소독)는 dispase을 중화하는데 5 % (w / v를) 포함 DMEM/F12 미디어 200 μl를 추가합니다. </li> &lt;리&gt; 해부 현미경에서 좋은 팁 (# 5 Dumostar 좋아, 과학 도구, 11295-20)와 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 상피를 그대로 유지하도록 관리하고, SMG 상피 꽃받침과 구멍 주변에서 느슨해 mesenchyme을 분리 . </li><li> 사전 젖은 멸균 200 μl 피펫의 DMEM/F12-BSA 매체와 팁 부드럽게 DME​​M/F12 200 μl + 펜 패 혈성을 포함하는 새로운 50mm 직경 microwell 요리로 상피 초보를 피펫. 부드러운 가장자리와 높은 품질을 200 μl 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> mesenchyme 조각을 포함하는 음식에서 sublingual 분비와 분리 턱밑 글 랜드 꽃 봉오리를 포함하여 비 중간 엽 조직을 폐기합니다. </li></ol> 3. 상피 초보의 Adenoviral 감염 <ol><li> 결과 솔루션의 titer는 1x10 8 -10 9 PFUs이되도록 microcentrifuge 관 DMEM/F12 + 펜 패 혈성에 대한 관심의 아데노 바이러스를 diluting하여 바이러스 감염 미디어 200 μl를 확인합니다.다른 바이러스에 필요한 최적의 titer는 다를 수 있습니다. 이 세슘 염화물 (CsCl) - 정화 최적의 통풍 관 효율을위한 바이러스 준비를 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 다섯 상피 초보가 포함 된 음식에서 미디어를 제거합니다. 신속 항상 초보가 젖 유지, 감염 미디어 200 μl를 추가합니다. 바이러스를 처리하고 오염 pipet 팁 폐기에 필요한주의 사항을보십시오. 10 % 표백제 솔루션 바이러스 오염 된 표면을 소독. </li><li> 같이 가겠다는에서 그들을 방지하고 그들에게 접시의 바닥에 정착 할 수 있도록 집게와 멀리 떨어져 서로 상피 초보를 이동합니다. 상온에서 1 시간에 바이러스 성 미디어 초보를 품다. 사람들이 가까운 곳에 이동하면 부화하는 동안, 초보를 구분합니다. 과도한 흔들거나 운동이 선들이 함께 덩어리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 부화 후, 부드럽게 바이러스 함유 미디어를 제거하고 적절하게 폐기, 연구를 중단하지 돌봐udiments. DMEM/F12 + 펜 패 혈성 200 μl를 추가합니다. 이 세차 적어도 두 번 이상 반복하고 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 미디어 200 μl로 교체하십시오. 이 세차 강력 상피에 부착되지 않은 바이러스를 제거하고 mesenchyme의 감염을 방지하기 위해 중요합니다. </li><li> DMEM/F12 200 ML 2 %를 포함과 상피 초보를 배양 (V / V) 20 분에 Matrigel (BD Biosciences, 356231). 우리는 Matrigel이 짧은 부화가 초기 문화 기간 동안 기존의 갈라진 틈의 회귀를 최소화 발견,이 단계는 Matrigel에 노출이 원하는하지 않은 경우에 투여 할 수 있습니다. </li></ol> 재결합 SMGs 4. 예를 생체 문화 <ol><li> 노치 (작은 컷)의 상단에, 사전 젖은 200 μl 피펫 팁을 사용하여 각 퇴화 기관, 한 번에 하나를 놓고 13mm, 0.1 μm 문화 미디어 200 μl (를 떠 Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 (워트 먼지) 바닥이 유리로 microwell 판 5 초보 / 필터). 문화 미디어입니다 : DMEM/F12 + 펜 패 혈성은 50 μg / ML 트랜스페린과 150 μg / ML 아스코르브 산 등 이전에 2,8 설명을 포함. 트랜스페린은 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 침샘과 다른 장기의 explants 9 morphogenesis을 가지입니다. 아스코르브 산의 추가는 SMG 브랜칭을 촉진하기 위해 표시되었습니다. (10)는 이것은 신진 대사 경로 (예 : 콜라겐 섬유 형성 11시 프롤린 hydroxylation 등)의 많은 hydroxylation 반응에 cofactor 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 다른 장기의 explants에서 fibronectin과 laminin 생산을 자극합니다 12. </li><li> 각 상피 흔적 기관을 추가 한 후 가능한 한 필터의 상단에 많이 미디어로 제거합니다. 필터의 상단에 너무 많은 미디어가 적은 미디어 초보의 배치를 할 동안, 필터가 침몰의 원인과 훨씬 쉽게 mesenchyme 수 있습니다. 초과 미디어는 피펫 팁이나 조언의 미디어를 놓치 집게를 사용하여 하나 제거 할 수 있습니다. </li><li> 장소 mesenchyme 조각이 서있는 파생상단 및 / 또는 각 상피 흔적 기관 주위 m 3-4 분비. 멀리 초보에서 mesenchyme의 움직임을 피하기 위해이 선들을 둘러싼되는 추가 미디어를 제거합니다. 더 많은 선들에서 파생 Mesenchyme가 도움이되지 않습니다 미만 상피 흔적 기관의 성장에 해로운 수 있습니다. </li><li> 원하는대로, 48 -72 시간에 37 ° C에서 humidified 인큐베이터 (95% 공기 / 5퍼센트 CO 2)에 재결합 SMGs을 품다. </li><li> brightfield 및 / 또는 형광성 0 시간 라이브 분비의 이미지 (원하는 경우), 재결합 후 2 시간하고 4X 또는 5 배 확대 목표를 사용하여 디지털 카메라를 갖추고, 역 수직, 또는 스테레오 가벼운 현미경에 이후 모든 24 시간을 습득 보기의 단일 프레임에 전체 재결합 선을 캡처합니다. 침샘의 이미지는 빛 경로 (이 완전 자동화 된 현미경에 수 없습니다)에 부품 방법을 배치 brightfield 설정하거나 적절한 단계 링을 사용하여 최적의 대비를 보여줍니다. 표준 위상 대비는 없습니다필요 t는 선 육중하고 있기 때문에 대비를 만듭니다. </li><li> 원하는 시간 점에서 재결합 SMGs은 5 % (w / V) 자당을 (더 나은에 세포를 유지하여 내부 세포 구조를 유지하기 위해 포함 1X PBS에 2 % paraformaldehyde (PFA)로 만든 정착액 솔루션을 20 분 고정 할 수 있습니다 isosmotic 주). 정착액이 완전히 고정 후 제거하면 4% 달리 PFA, 2퍼센트 PFA는 GFP 신호의 상당한 양을 유지합니다. 선들은 4에서 어둠 속에서 1X PBS에서 일주까지에 저장할 수 있습니다 ° C 전체 마운트 immunocytochemistry 및 공 촛점 이미징이 수행 될 때까지 이전과 같이 3,6,13-15 보도했다. 이상적으로, immunocytochemistry 및 이미징은 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 고정 후 곧 수행해야합니다. 분비는 서양 blotting 분석에 이어 SDS-PAGE에 RIPA 버퍼에 lysed 될 수 있습니다. </li></ol>

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예 생체 상피 - 중간 엽 재조합 기술이 처음 1981 16 턱밑 침샘에 출판되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 재결합 선의 컨텍스트 내에서 상피 세포의 유전자 발현을 조작하는 adenoviral 감염를 사용하여 원래의 방법에 따라 확장합니다. 우리는 감염된 세포의 비율은 바이러스 발기인의 속성, 바이러스 titer 및 바이러스 순도에 따라 달라집니다 반면, 상피 세포의 비율은, 아데노 바이러스에 감염되어 있는지 보여줍니다. 우리는 효율적으로 상피 도입, 여기에 설명되지 않은의 정화를 위해 CsCl 기울기 - 정화 바이러스를 사용하는 데 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 이전에 재결합 (데이터 미도시)에 mesenchyme 세포를 감염 할 수 있었던 때문에, 중간 엽 인구의 독립적 인 유전자 조작도 가능합니다. 우리는 최근 역할을 식별하는 데이 adenoviral transfection / 조직 재조합 방법을 사용극성 단백질, PAR-1B를 들어, 침샘을 개발 상피의 지하 막의 위치의...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 페놀 레드가없는 DMEM / 햄의 F12 중 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린과 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15070-163 </td><td> 10X 주식 </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 생명 기술 </td><td> 17105-041 </td><td> 단일 사용 aliquots을 고정에서-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A2934-100G </td><td> 분수 V, 낮은 내 독소 </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> 높은 titer (1x10 10 PFU / ML) 여야합니다. CsCl 정화 바이러스는이 분석에서 바이러스를 열 정화보다 더 효과적입니다. </td></tr><tr><td> 16 % Paraformaldehyde </td><td&gt; 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 5 %의 자당 (w / V)와 PBS에서 2 %로 희석 </td></tr><tr><td> 1X 인산 버퍼 생리 (PBS) </td><td> 생명 기술 </td><td> 70011-044 </td><td> 10X 혈통 준비 </td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 솔루션 </td><td> 생명 기술 </td><td> 14175095 </td><td> 더 칼슘도없고, 마그네슘, 아니 페놀 레드 </td></tr><tr><td> 트랜스페린 </td><td> 시그마 </td><td> T8158 </td><td> 25 MG / DMEM/F12 미디어 ML 주식 솔루션입니다. 단일 사용 aliquots에서-20C를 고정 </td></tr><tr><td> L-아스코르브 산 (비타민 C) </td><td> 시그마 </td><td> A4403 </td><td> DMEM/F12 media.Freeze 단일 사용 aliquots 75 MG / ML 주식 솔루션에서-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 재결합 프로토콜을 SMG에 필요한 시약의 목록입니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10cm 멸균 플라스틱 요리 </td><td> 코닝 </td><td> 430167 </td><td> 비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 전송 라이트 기반으로 스테레오 해부 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ645 </td><td> 현미경을 해부 모든 스테레오가 전송 가벼운 기지를 가지고 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 35mm 조직 문화 요리 </td><td> 매 </td><td> 353001 </td><td> 비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 50mm 직경 microwell 요리 </td><td> MatTek 공사 </td><td> P50-G-1.5 14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 110405 </td><td> 13mm 직경, 0.1 mm 구멍 크기 </td></tr><tr><td> Widefield 형광 현미경 </td><td> 칼 Zeiss, USA </td><td> Axio 옵저버 Z1 </td><td> 모든 형광 현미경 (똑바로, 전) nverted 또는 현미경을 해부 스테레오는 첨부 된 디지털 카메라로 낮은 배율에서 GFP 발현을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> TCS SP5 </td><td> 공 촛점 현미경 자세한 세포 구조를 볼 필요가 있습니다. 모든 공 촛점 현미경을 사용하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스, 스트레인 CD-1 또는 ICR </td><td> 찰스 강 (Charles River) 연구소 </td><td></td><td> 태아는 하루에 13 일 (일 0로 지정 플러그 발견 하루)에 수확하고 있습니다. </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 11 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 핸들 # 3 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 inox 합금, 0.05mm X 0.02mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td><td> 배아에서 분비 수확에 이상적 </td></tr><tr><td&gt; 뒤몽 # 5 포셉 dumostar 합금, 0.05mm X 0.01mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-20 </td><td> 좋은 팁 상피에서 mesenchyme을 제거 필요합니다. 텅스텐 바늘도 사용하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 장비 재결합 프로토콜을 SMG에 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

morphogenesis을 분기하는 많은 기관의 개발 기간 동안 발생하며, 배아 마우스 턱밑의 선 (SMG)는 morphogenesis을 가지 연구를위한 클래식 모델입니다. - 궁극적으로 구강 하나에 각각 침을 생산 및 수정 / 전송하기 위해 사용될 acini과 관의 복잡한 분지 네트워크에 상승을 제공하기 위해 상피 봉오리 덕트 형성 단계를 반복 개발 SMG,이 과정은 포함 3. 어떻게 세포와 분자 이벤트가 제대로 이해 남아 조정 아르하지만 상피 - 관련 지하 막하고 이러한 세포에 의해 생산 mesenchyme 세포, 성장 인자와 세포 외 기질을 포함하는 중간 엽 구획의 측면은, 분기 메커니즘에 중요한 사 . 분자 메커니즘의 연구는 상피 morphogenesis 진행에게 발달 메커니즘에 대한 우리의 이해를 운전 가능한 regener에 대한 통찰력을 제공합니다ative 의학 접근. 이러한 연구는 침 상피의 유전자 조작에 대한 효과적인 방법의 부족으로 인해 방해되었습니다. 현재 adenoviral 도입은 생체 5 성인 분비에 상피 세포를 타겟팅하는 가장 효과적인 방법을 나타냅니다. 그러나 배아 explants에서 조밀 mesenchyme과 상피 세포를 둘러싸고있는 지하 막는 상피 세포에 바이러스 접근을 막는. mesenchyme가 제거되면, 상피는 adenoviruses를 사용하여 transfected 수 있고, 상피 초보는 Matrigel 또는 laminin-111 6,7의 존재에 morphogenesis을 분기 재개 할 수 있습니다. Mesenchyme 무료 상피 흔적 기관의 성장은 수용성 성장 요인으로 추가 보완이 필요하고 그대로 땀샘 8 발생할 때 완전히 분기 morphogenesis을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기 transfected 전자의 상피 세포와 문화의 adenoviral 전달을 용이하게하는 기술을 설명관련 정보 mesenchyme있는 pithelium. 배아 SMGs, mesenchyme의 제거, 그리고 GFP 함유 아데노 바이러스와 상피의 바이러스 감염의 microdissection 따라, 우리는 상피가 저절로 그대로 SMG 선의 구조를 recapitulating하고 morphogenesis을 분기, 감염되지 않은 mesenchyme과 recombines을 보여줍니다. 유전자 변형 상피 세포 인구는 쉽게 휘황 태그 경우 adenoviral 구조가 사용되는 표준 형광 현미경 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조직 재조합 방법은 현재 유전자 변형 동물의 생성을 필요로하지 않습니다 복잡한 3D 조직 구조 내에서 야생 형 또는 돌연변이 벡터와 상피 세포의 transfection을위한 가장 효과적이고 접근 방법입니다.

주요 실험 단계의 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다. 그대로 SMG 고립 된 상피 흔적 기관 및 해당 mesenchyme의 예는 그림 2에 표시됩니다. 지정된 시간에 대한 양식 예를 생체가 그림 3에 표시됩니다 때 morphogenesis을 분기 받아야 계속 재결합 SMGs의 Brightfield 이미지. 상피 GFP를 표현하는 48 시간에 성장 재결합 분비가 그림 4에 표시됩니다. 재결합 SMGs의 공 촛점 이미지는 고정 및 이미징 immunocytochemistry 다음 문화의 72 시간 후, 그림 5에 표시됩니다. 상피 마커, E-cadherin은 주변 mesenchyme에서​​ GFP-표현 상피 세포 인구를 demarcates. 상피의 주변에서 지역화 지하 막 단백질, perlecan의 검색은 재결합 분비의 지하 막 중 적...

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술<em&gt; 예 생체</em바이러스 성 유전자 전달을 사용하여&gt; 교양 배아 마우스 턱밑의 분비 (SMGs)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 상피와 자발적으로 adenoviral 벡터와 상피 초보의 분리 및 감염 후 재결합 할 수 mesenchyme을 SMG의 본래 기능을 활용합니다.

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

이 절차의 전반적인 목표는 아데노바이러스 구조를 사용하여 마우스의 상피, 배아 턱밑 타액선에서 원하는 단백질의 발현을 변경하는 것입니다. 이것은 배아 13일째에 배아를 채취하고 턱밑 타액선을 해부함으로써 달성됩니다. 다음으로, 상피 기초를 주변 중간엽에서 분리하고 바이러스를 함유한 배양액에 담근다.기초를 세척한 후 배지를 함유한 매트리겔(matrigel)에서 배양하고, 면역화학 및 표준 현미경 또는 서양 혈액 분석을 사용하여 표적 단백질 수준의 변화 및 분지 형태 형성에 미치는 영향을 생체 외 배양을 위해 3개의 중간엽과 결합했습니다. 이 기술을 사용하면 복잡한 장기에서 단 하나의 조직 구획만 유전적으로 변형할 수 있으며 형질전환 유기체를 만들지 않고도 재조립된 전체 장기 설명의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 상피 구획 내에서 야생형 또는 우성 음성 단백질의 발현을 가능하게 한다는 것입니다.표준 절차에 따라 먼저 13개의 배아를 25ml의 배지가 있는 10cm 접시에 채취합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 자루에서 배아를 꺼내고 배아를 투과광 베이스가 있는 입체경 아래에 펜 스트렙이 있는 25밀리리터의 D-M-E-M-F 12가 들어 있는 10cm 접시로 옮기고 깨끗한 유리 조각 위에 배아를 놓습니다. 이제 아래턱 또는 하악골 바로 아래에 각진 절개로 배아의 머리를 분리하고 위턱 아래의 절개를 사용하여 아래턱을 분리하십시오.그런 다음 35mm 조직 배양 접시에 펜 연쇄상구균을 사용하여 하악골을 3ml의 D-M-E-M-F 12로 옮깁니다. 이제 하악골 하나를 무대의 유리판에 다시 놓고 혀가 유리에 닿아 12시 위치를 가리키도록 배치합니다. 교차된 두 집게의 한쪽을 가위질하는 동작으로 사용하여 하악골의 아래쪽 1/3을 제거하고 버립니다.다음으로, 하악골을 주로 사용하는 손 쪽으로 90도 돌리고 가위질하는 동작으로 하악골의 윗부분을 자릅니다. 이제 여분의 조직을 벗겨내고 조직 아래에 있는 기관단총을 노출시킵니다. 양쪽의 혀 바닥 근처에 양쪽에 하나씩 있습니다.한 쌍의 집게를 사용하여 혀 옆의 조직을 누르고 다른 쌍을 사용하여 SMG를 혀에서 떼어냅니다. 이 시점에서 더 큰 SMG와 인접한 설하선은 주변 중간엽과 함께 그대로 배양될 수 있습니다. 그렇지 않으면 다음 섹션으로 진행합니다.200마이크로리터의 HBSS 플러스 디스 페이스트가 있는 유리 바닥의 50mm 마이크로웰 접시에 최소 5개의 타액샘 식물을 배치하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 땀샘을 배양합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 땀샘을 즉시 방해하지 않고 디스 페이스트 용액을 조심스럽게 aspr하십시오.BSA가 있는 D-M-E-M-F 12 배지 200마이크로리터를 추가합니다.원반을 중화하려면 끝이 가는 5번 집게를 사용하여 더 큰 턱밑샘의 상피 새싹 및 관에서 설하선으로 느슨해진 중간엽 조직을 부드럽게 분리합니다. 상피는 가능한 한 손상되지 않은 상태로 두도록 주의하십시오. 다음으로, D-M-E-M-F 12 BSA 매체의 팁에 부드러운 가장자리 프리가 있는 고품질 200마이크로리터 피펫 팁을 선택합니다.그런 다음 200마이크로리터의 D-M-E-M-F 12 플러스 펜 스트렙이 들어 있는 새로운 50mm 직경의 마이크로웰 접시에 메카이가 없는 상피 기초를 부드럽게 피펫으로 빼냅니다. 마지막으로, 중간엽 조각이 들어있는 접시에서 중간엽이 아닌 조직을 버립니다. 여기에는 설하샘과 분리된 턱밑샘 새싹이 포함됩니다.나머지 간엽은 따로 보관합니다. 먼저, 염화세슘 구배 정제 바이러스 제제로부터 최적의 역가 농도로 200마이크로리터의 감염 배지를 준비합니다. 이제 해부 현미경으로 5개의 상피 기초가 들어 있는 접시에서 매체를 제거합니다.그런 다음 200 마이크로 리터의 감염 매체를 빠르게 추가하고 집게를 사용하여 기초를 항상 적신 상태로 유지하십시오. 상피 기초를 서로 멀리 분리하여 서로 달라붙는 것을 방지하고 접시 바닥에 가라앉을 수 있도록 합니다. 그런 다음 기초 물질이 최소한의 방해로 실온에서 1시간 동안 바이러스 배지에서 배양하도록 합니다.15분마다 기초를 점검하여 서로 가까이 움직이지 않았는지 확인하십시오. 필요한 경우 집게로 분리하십시오. 해부 현미경으로 배양 후 바이러스 배지를 부드럽게 제거하고 기초를 방해하지 않도록 주의하면서 적절하게 폐기합니다.다음으로, 200 마이크로 리터의 신선한 매체로 기초를 두 번 씻으십시오. 이러한 세척은 상피에 부착된 약한 바이러스를 제거하고 중간엽의 감염을 예방하는 데 중요합니다. 200 마이크로 리터의 미디어로 두 번째 세척 후 2 % 마트리 겔을 계속하고 다시 기초가 뭉치지 않도록주의합니다.그런 다음 Prewitt 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 기초를 실온에서 20분 동안 배양하고, 바닥이 유리인 마이크로웰 플레이트의 200마이크로리터 배양 배지에 떠 있는 노치가 있는 멤브레인 필터 위에 5개의 기초를 놓습니다. 피펫 팁 또는 집게를 사용하여 필터 상단에서 과도한 매체를 제거하여 필터가 가라앉지 않고 상피 기초가 제자리에 유지되도록 합니다. 다음으로, 각 상피 기초 주위에 3-4개의 분비샘에서 파생된 모든 분비샘 조각이 직접 접촉 작용하도록 합니다.3-4개의 분비샘과 단일 바이러스로 감염된 상피 기초의 중간엽의 재조합은 재결합된 턱밑 타액선의 성장과 발달에 매우 중요합니다.그런 다음 중간엽이 기초에서 멀어지지 않도록 땀샘을 둘러싼 과도한 매체를 제거합니다. 이제 재결합된 땀샘을 가습된 인큐베이터에서 설명된 절차에 따라 2-3일 동안 배양합니다. 온전한 배아 SMG를 분리하고 DYS 페이스 처리 후 주변 중간엽에서 상피 기초를 제거했습니다.명시야 영상은 재조합된 SMG가 계속해서 분기 형태 형성을 겪는 것을 보여주었습니다. 체외에서 배양된 경우. 표시된 시간 동안, 우리는 A GFP로 치료 후 48시간 동안 성장한 땀샘을 결합했습니다.아데노바이러스는 상피에서만 GFP를 발현했습니다. 우리는 SMG를 결합하고 고정, 염색 및 이미지화했습니다. 72시간 후, 몇 가지 마커가 사용되었습니다.핵은 dpi로 염색되며, 본원에서 빨간색으로 표시된 상피 마커 eco는 상피 세포 집단을 주변 중간엽으로부터 구분합니다. 상피 세포는 아데노바이러스 GFP를 발현하고 있으며, 상피 주변에 국한된 시안색에서 기저막 단백질 페란(peran)을 검출하면 재결합된 땀샘에서 기저막의 적어도 부분적인 재구성이 있음을 보여줍니다. 파란색의 DPI와 빨간색의 베타 3 튜불린에 대한 컨포칼 돌기는 중간엽 내의 부교감신경절이 URI 성장을 겪어 재조합 배양에서 분비샘에 신경을 분포시킨다는 것을 보여줍니다.이 동영상을 시청하면 배아 턱밑 타액선 배양 기술에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 상피에서 중간엽을 제거하는 것뿐만 아니라 중간엽과 바이러스에 감염된 상피의 재결합은 모두 어려운 단계임이 입증될 수 있습니다. 그러나 이 절차는 상피 세포에 적용되는 바이러스 구조를 사용하여 단백질 발현을 변경할 수 있습니다.아데노바이러스 감염만이 구조적으로 활성화되거나 우성적인 음성 단백질을 상피에 추가하여 특정 단백질의 조작이 배아 턱밑 타액선의 성장과 발달을 어떻게 변화시키는지 결정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 침샘에서 줄기 세포의 격리를 위해 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 효소와 소화 기계를 고용하고, 줄기 세포의 특징과 세포를 포함하는 salispheres의 절연을 수 있습니다.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

이 비디오는 타액선에서 파생된 3차원 타원체인 살리스피어(salispheres)를 배양하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 살리스피어는 영향을 받은 인간 환자의 타액선에서 타액 생성에 대한 두경부암의 영향을 평가하는 데 추가로 사용할 수 있습니다.

타액선 조직에서 살리스피어 배양: 인간 타액선 유래 상피 세포에서 살리스피어를 개발하는 방법

눈물샘 (LG)는 비전과 눈 건강을 유지하기 위해 필요한 눈물의 수성 부품을 생산하는 분기 기관이다. 여기에서 우리는 LG 개발에 참여 경로 신호 해독 쥐 LG 절제술 및 체외 배양 기술에 대해 설명합니다.

쥐의 눈물샘을 조작

선물이 murine tracheostomy 등 3 개의 주요 침 샘의 침 컬렉션을 수행 하는 자세한 접근.

Pilocarpine 자극 다음 통해 murine 침 기능 평가 분류 한 방사선

3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

우리는 1 차적인 인간 타액 선 파생된 상피 세포를 격리하고 기양하는 방법을 제시합니다. 이들 세포는 침상 피유래의 유전자 발현 패턴을 나타내며 엥겔브레스-홀름-군단 종양 세포에서 유래한 지하 막 매트릭스 또는 처리된 배양 요리의 단층으로서 살리스피어로 성장될 수 있다.

침또는 단층으로 시험관 내 성장을 위한 인간 타액 선에서 타액 상피 세포의 격리

타액선은 유전자 치료를 위한 조직 표적 사이트로서, 특히 유전자 전달에 의한 예방 접종 영역에서 제안되었다. 역행 마루드 주입을 활용한 비인간 영장류 모델에서 유전자 전달을 시연합니다.

벡터 유전자 전달을 위한 비인간 영장류에서 스텐센의 덕트를 통한 역행 파로티드 글랜드 주입

면역형광 이미징은 복잡하고 시간에 따라 달라지는 생물학적 과정을 단 한 번의 스냅샷으로 관찰할 수 있는 능력에 제약을 받습니다. 이 연구는 정밀하게 절단된 쥐의 턱밑샘 절편에 대해 수행된 실시간 이미징 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 통해 항상성 중 세포-세포 상호 작용과 재생 및 복구 과정을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

모기 midgut과 침샘 주요 항목과 Plasmodium falciparum과 뎅그열 바이러스 벡터 병원균에 대한 출구 점입니다. 이 동영상은 Aedes aegypti 모기 midgut과 침샘을 제거하기위한 해부 기술을 보여줍니다.

애에서 Midgut과 침샘의 해부. aegypti 모기

PDMS 장치 제작 및 표면 변경

배우세요 쥐 태아 침샘 상피세포에서 아데노바이러스를 이용한 유전자 조작 기법을 통해 분기형태형성에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 복잡한 장기에서 특정 조직 구획만 유전적으로 변형할 수 있어 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

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