임상 신청

이 프로토콜은 T 세포를 유전적으로 변형하여 종양 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체를 도입한 다음 디자이너 인공 항원 제시 세포에 임상적으로 유의미한 수를 전파합니다. 잠자는 숲속의 미녀의 전기 전송으로 시작하십시오. A DNA 플라스미드를 말초 또는 제대혈에서 분리된 정지된 단핵 세포로 전치하고 전치합니다.

그런 다음 유세포 분석을 사용하여 transfection 효율을 측정합니다. 다음으로 공동 배양으로, K5 62에서 7일 동안 형질주입된 T 세포를 유도하여 4주간의 자극에서 외인성 사이토카인을 첨가한 인공 항원을 제시했습니다. 증식 주기는 cryopreserve 분석을 진행하고 전기천공 및 증식된 car positive T cell을 인체 적용을 위해 방출합니다.

잠자는 숲속의 미녀 전치 시스템은 선택한 세포에 유전자를 안정적으로 도입하기 위한 바이러스 기반 유전자 전달 접근 방식의 대안을 제공합니다. 잠자는 미용 시스템의 주요 장점 중 하나는 불법 비상동 재조합을 통해 통합되는 DNA 플라스미드에 비해 실제로 저렴한 비용으로 유전자를 통합할 수 있다는 것입니다. 따라서, 장점은 잠자는 미용 시스템을 사용하여 저렴한 비용과 높은 효율로 유전자를 발현할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 처음에 인공 항원 제시 세포에서 자동차 양성 T 세포의 선택적 증식에서 전기 T 세포의 효율성을 극복해야 합니다. 두 단계 모두 공동 문화의 필요성 때문에 마스터하기가 어렵습니다. 인공 항원 제시 세포에 유전자 변형 T 세포.

이 방법은 양자 면역 요법 분야, 특히 효과적인 유전자 전달 및 임상적으로 유의미한 수의 T 세포 제조업체에 유용합니다. 면역 체계의 T 세포는 종양 특이적으로 변형될 수 있기 때문에 더 광범위한 응용 분야는 암 치료로 확장됩니다. 이 절차를 시연하는 사람은 마가렛 도슨(Margaret Dawson)과 매튜 피올라(Matthew Fiola)입니다.

내 실험실의 기술자는 먼저 말초 혈액을 같은 부피의 P-B-S-E-D-T-A로 희석하고 탯줄 혈액을 4 부피의 P-B-S-E-D-T-A로 희석하여 50 밀리리터 원심 분리기 튜브의 12 밀리리터의 피알에 희석 된 혈액 25 밀리리터를 천천히 층을 이룹니다. 500Gs에서 휴식 없이 30-40분 동안 5쪽 구배를 원심분리합니다. 이제 단핵 세포 분획을 P-B-S-E-D-T-A가 있는 새로운 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

부피를 50 밀리리터로 늘리고 원심분리로 세포를 수확합니다. 50ml의 완전 배양액, 배지 및 원심분리기에 한 번 400Gs에서 10분 동안 세포를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 CCM에서 세포 펠릿을 풀링하여 세포 계수를 수행합니다.

트라이암 블루 제외 방법을 사용합니다. 단핵 전지는 이제 전기천공에 사용하거나 향후 사용을 위해 동결 보존할 수 있습니다. 냉동 보존된 MNC를 사용하여 본격적인 전기천공을 위해 10에서 8번째 세포까지 두 번 빠르게 해동하는 경우, 세포를 예열이 포함된 적절한 크기의 원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다.

페놀이없는 RPMI 배양 배지를 완성하고 원심 분리로 세포를 펠렛화하고 단핵 세포를 재현탁시킵니다 P-F-R-P-M-I에서 세포 계수를 수행하고 세포를 밀리리터당 6 개 세포 중 10 개의 농도로 적절한 크기의 세포 배양 용기로 옮깁니다. 가습된 인큐베이터에서 2시간 동안 세포를 평형화합니다. 원심분리로 MNC를 수확한 다음 P-F-R-P-M-I의 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁 및 결합하고 세포를 열거합니다.이제 여덟 번째 MNC로 10번 두 번 이동하여 멸균 50ml 원심분리기 튜브로 이동하고 200Gs에서 10분 동안 중단 없이 원심분리합니다.

세포 펠릿 주변에 잔류 매체가 남아 있지 않도록 상등액을 흡입합니다. 4ml의 따뜻한 P-F-R-P-M-I가 포함된 10개의 웰이 있는 멸균 12웰 플레이트를 준비하고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 플레이트를 5%의 이산화탄소로 평형을 이룹니다. 그런 다음 각 반응에 대한 제조업체의 지침에 따라 인간 T 세포 키트에서 Lonzo Nucleo effector 용액을 재구성합니다.

Q Vet은 보충된 NU 핵 효과기 용액을 함유한 DNA 마스터 믹스 100마이크로그램을 준비합니다. 플라스미드에 전치된 15마이크로그램과 전치된 플라스미드 5마이크로그램. 다음으로, T 세포의 펠릿을 분산시키고 NU 핵 영향 용액 DNA 마스터 믹스를 100마이크로리터당 7번째 세포의 10분의 2의 최종 세포 농도로 재현탁합니다.

100마이크로리터의 세포 현탁액을 10개의 lonza nucleo 애정 큐벳 각각에 조심스럽게 옮기고 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 이제 qve를 한 번 탭하고 자극되지 않은 T 세포에 대해 U 0 1 4 프로그램을 사용하여 전기를 사용합니다. 해당 웰에서 각 베트로 예열 배양 배지 500마이크로리터에서 미세한 팁 이송 피펫의 아목스를 사용하여 큐벳과 Equilibrating 12 웰 플레이트를 배양 후드로 옮깁니다.

전기천공된 세포를 플레이트로 옮기고 세포가 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 회복될 수 있도록 합니다. 그런 다음 모든 웰의 세포를 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고 한 번 세척한 후 세포를 펠릿화하고 세포 펠렛을 부드럽게 분산시키고 CCM에서 현탁액을 재생하여 단일 세포 현탁액을 달성합니다. 세포 계수를 수행한 후 CCM에서 밀리리터당 6개의 세포가 되도록 세포 농도를 조정합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 배양 플라스크로 옮기고 하룻밤 동안 인큐베이터에 넣어 EGFP 형질 주입된 세포를 생성합니다. 5마이크로그램의 아목스 제어 EGFP 플라스미드와 함께 정맥당 6개의 세포 중 5배 10을 사용하여 전기천공법 프로토콜을 반복합니다. 전기천공된 세포를 채취한 다음 trien blue exclusion 방법을 사용하여 세포 계수를 수행합니다.

그런 다음 6개 세포 중 1-2배 10을 CD 3, CD 4, CD 8 및 인간 IgG FC 감마에 특이적인 항체로 염색하여 자동차 발현을 측정합니다. 팩스 구경에서 셀을 획득합니다. FCS 익스프레스 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여 자동차의 표현을 결정합니다.

그런 다음 배양에서 자동차 양성 세포를 계산하십시오. A PC 클론 번호 4는 K 5 62 세포에서 공동 발현된 원하는 T 세포 공동 자극 분자로 유도되어 섭씨 37도의 수조에서 조사된 냉동 분취액, A A PC를 해동합니다. 그런 다음 세포를 세척하고 CCM은 트립 블루 배제에 의해 생존 가능한 세포를 열거하고 자극에 필요한 생존 가능한 A, PC의 수를 계산합니다.

자동차를 발현하는 전기천공된 세포와 감마선이 조사된 A A PC를 멸균 용기에 1:2의 비율로 혼합합니다. 전기천공법 다음날 유세포 분석을 기반으로 자동차 발현에 대한 A PC 비율을 조정하고 IL 21 밀리리터당 30나노그램을 세포 현탁액에 추가합니다. 그런 다음 Eloqua는 T 75 플라스크 또는 생명 배양 백에서 밀리리터당 6개의 세포를 돌보고 배양 인큐베이터로 돌아가 DNA 플라스미드의 전기 전달 및 감마선 조사에서 T 세포의 증식을 수행했습니다.

A: PC는 말초 혈액 및 제대혈에서 유래한 임상적으로 매력적인 수의 T 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 자극 주기의 0일차에 EGFP의 말초 혈액 발현에서 유전적으로 변형된 T 세포의 이러한 특성화에서, CD 19 특정 자동차의 유전자 전달 발현의 효율성에 대한 제어는 전기천공 후 약 24시간에 CD 3 양성, CD 8 양성 및 CD 4 양성 T 세포에 대한 유세포 분석으로 평가됩니다. 그리고 나서 28일 후에 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 성장한 T 세포에 대한 자동차 발현의 A PC 동역학에 대한 공동 배양 후.

시간이 지남에 따라 말초 혈액에서 유래한 자동차 양성 T 세포의 증식은 자동차를 안정적으로 발현하는 임상적으로 매력적인 수의 T 세포를 생성할 수 있습니다. A PC에서 4주간의 공동 배양 후, CD 3개의 양성 T 세포의 평균 fold expansion은 약 19,800이며 90%의 car 발현이 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원하는 자동차를 발현하는 T 세포를 선택하고 전파하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

NK 세포의 과다 증식을 모니터링하는 것을 잊지 마십시오. T 세포의 전기천공과 증식은 일반적으로 7일 동안 4번의 자극 주기에 걸쳐 이루어집니다. 사이토카인 방출 및 세포 독성 분석과 같은 추가 조사를 수행하여 양자 면역 요법 분야에서 유전적으로 변형된 T 세포의 리디렉션된 특이성을 평가할 수 있습니다.

이 기술은 인간에게 주입되는 T 세포의 치료 잠재력을 이해하는 데 도움이 됩니다.