Name: 면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 종양 면역요법을 위한 임상 등급 수지상 세포 준비 방법을. 단핵구에서 GM-CSF와 IL-4로 5일간 분화시키고 TLR3 작용제로 성숙시킨 후 항원을 적재합니다. 이 기술은 자가 세포 기반 암 치료 효능을 높입니다.

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저자는 폴리 ICLC의 선물 안드레스 살라을 (Oncovir, 주식 회사) 감사드립니다.

1. 말초 혈액 4의 분리 및 냉동 <ol><li> 무균 스파이크 플라즈마 전송 집합을 사용하여 leukapheresis 부대에있는 액세스 포트 중 하나입니다. 60 ML의 주사기를 사용하여 멸균 500 ML 병에 환자로부터 얻은 leukapheresis를 전송합니다. </li><li> 상온 RPMI를 사용하여 원래 볼륨을 2 배 leukapheresis의 볼륨을 조정합니다. 철저하게 섞는다. </li><li> 부드럽게 Ficoll-Paque PLUS의 병을 섞는다. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 12 ML Ficoll-Paque PLUS를 추가합니다. </li><li> Ficoll을 포함하는 각 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 희석 leukapheresis 제품의 부드럽게 층 30 ML. Ficoll과 세포 현탁액 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> leukapheresis의 모든 계층 될 때까지 단계 1.3 및 1.4를 반복합니다. </li><li> 없이 브레이크와 실온에서 20 분간 1,000 × g에서 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브 및 transfe에서 말초 혈액의 흐림 층을 수확새로운 멸균 50 ML 튜브에 대한 연구. </li><li> 50 ML의 최종 볼륨에 각 튜브에 RPMI를 추가합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> 4 10 분 ° C 풀 브레이크를 위해 500 × g에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 각 튜브에서 상층 액을 제거합니다. 각 튜브에서 세포 펠렛을 Resuspend하고 50 ML의 최종 볼륨에 RPMI를 추가합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> 4시 6 분 ° C.에 대한 500 × g에서 세포를 원심 분리 </li><li> 각 튜브에서 상층 액을 제거합니다. 를 Resuspend 한 50 ML 원뿔 튜브에 함께 풀 세포 현탁액. </li><li> 위로 더 RPMI 50 ML에 풀 말초 혈액의 양을 가져옵니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> 4시 6 분 ° C.에 대한 300 × g에서 세포를 원심 분리 </li><li> 상층 액을 제거합니다. 50 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend. 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 부드럽게 섞는다. </li><li> 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다. </li><li> 300에서 세포를 원심 분리4시 6 분 × g ° C. 냉동 매체를 준비합니다. 인간 AB 혈청 (밸리 생명)에서, 냉동 매체는 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO있는 Miltenyi Biotec은)으로 구성되어 있습니다. </li><li> 상층 액을 제거합니다. 2 × 10 8 세포 / 차가운 냉동 미디어 ML의 최종 농도에서 세포를 resuspend을. </li><li> 1.8 ML의 cryovials 1 ML의 aliquots을 확인합니다. </li><li> 제어 속도 냉동실에 cryovials를 전송하고 동결 실행, 프로그램 시작 1. 실행의 끝에, 즉시 액체 질소 냉동고의 기상에 냉동 cryovials를 전송합니다. </li></ol> 2. 일 0 단핵구에서 수지상 세포의 분화 <ol><li> 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 30 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에서 교반하여 냉동 말초 혈액의 해동 분주. 완전히 해동 할 때, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 튜브의 내용을 전송합니다. 철저하게 섞는다. </li><li> 6 분 동안 세포를 원심 분리상온에서 500 × g에서. 상층 액을 제거하고 RPMI / 1 %자가 혈장의 작은 볼륨 펠렛 세포를 resuspend을. 다음 50 ML의 최종 볼륨에 더 RPMI / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 철저하게 섞는다. </li><li> 500 6 분 × g, 실온에서 다시 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 50 ML RPMI / 1 %자가 혈장 펠렛을 resuspend을. 철저하게 섞는다. </li><li> 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다. </li><li> 판 1.40 40 RPMI의 ML / 225cm 2 EasyFlask 위에 1 %자가 혈장에서 x 10 8 세포. 모든 세포가 도금 될 때까지 반복합니다. </li><li> 1 옆으로 납작 EasyFlasks 품다 - 37 2 시간을 ° C 조직 문화 인큐베이터는 단핵구가 술병을 준수 할 수 있도록 5 % CO 2를 포함합니다. </li><li> 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 EasyFlask을 제거하고 비 부착 세포에게 USI 제거를 두 번 세척prewarmed RPMI의 NG 30 ML. </li><li> 두 번째 세척 후, 400-1,000 IU / ML IL-4, 100-1,000 IU / ㎖ GM-CSF 5-8 40 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 이 프로토콜에 대한, 우리는 400 IU / ML IL-4, 100 IU / ㎖ GM-CSF를 사용하고 있습니다. </li><li> 37 2 일간 EasyFlasks을 품어 ° 조직 문화 인큐베이터에서 C가 5 % CO 2를 포함. </li></ol> 3. 주 2 : IL-4, GM-CSF와 수지상 세포의 먹이 <ol><li> 각 EasyFlask에 400-1,000 IU / ML IL-4, 100-1,000 IU / ㎖ GM-CSF와 4 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 소용돌이 옆으로 흔들어 섞는다. </li><li> 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 5 % CO 2를 포함에서 더보기 3 일 EasyFlasks을 (5 일까지) 품어. </li></ol> 4. 5 일 : 미성숙 수지상 세포의 수확 <ol><li> 적극적 플라스크 소용돌이에 의해 비 부착 느슨하게 자기편 세포를 resuspend을하고 위아래로 pipetting하여 문화를 수확. 를 전송새로운 50 ML 원뿔 튜브에 수확 세포. </li><li> 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ML RPMI / 1 %자가 혈장에있는 세포 펠렛을 resuspend. 철저하게 섞는다. </li><li> 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다. </li><li> 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 플레이트 1-2 × 10 400 IU / ML IL-4 및 6 - 잘 조직 배양 플레이트에 100 IU / ㎖ GM-CSF 3 ML RPMI / 1 %자가 혈장에서 잘 당 6 셀. </li><li> 37 접시를 품어 ° C는 조직 문화 인큐베이터 2 밤새 5 % CO를 포함. </li></ol> 5. 6 일 : 수지상 세포의 성숙과 항원 로딩 중 <ol><li> 10 ㎍ / ㎖ KLH에 6 자 문화 접시에있는 우물의 1 / 3 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 판 섞어. KLH는 첫 번째 DC 백신에 사용되기 때문에 KLH는 우물의 1 / 3에 추가됩니다. 이후 DC 백신 콘만 종양 항원 펩티드를 테인. </li><li> 수지상 세포는 다양한 자극을 사용하여 성숙 자극 할 수 있습니다. 임상 연구에 사용 된 가장 일반적인 성숙 자극 크린 시토 킨의 칵테일 (TNFα, IL-1 β, 및 IL-6)과 프로스타글란딘 E2 (PGE 2) 9,10왔다. 더 최근에, 수신자 같은 수용체 (TLR) 작용제의 사용은 인기 11,12를 얻고있다. 이 프로토콜에서는, 우물 2 MG / ML Polyinosinic-Polycytidylic 산성 폴리-L-라이신 카르복시 메틸 (폴리 ICLC)를 추가하고 잘 섞는다. 폴리 ICLC 폴리-L-*-라이신 및 카르복시 메틸 셀룰로오스 (Oncovir, 주식 회사에 의해 제조)로 안정화 폴리 IC의 임상 등급 정립이다. </li><li> 각 잘 간 경쟁 13을 피하기 위해 단일 펩티드를 받고, 그 지정 우물에 100 ㎍ / ㎖ 긴 펩티드 항원 (NY-ESO-1 및 / 또는 Melan-A/MART-1)를 추가합니다. </li><li> 37 접시를 품어 조직 문화 인큐베이터는 5 % CO를 포함 10 ° C &lt;서브&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. 7 일 : 수지상 세포의 냉동 보존 <ol><li> 자가 혈장과 10 % DMSO를 사용하여 DC 냉동 솔루션을 준비합니다. 모든 미립자 물질을 제거하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 2,000 DC 냉동 솔루션 × g의 원심 분리기. 새로운 라벨 15 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다. 4에서 보관 ° 사용까지 C. </li><li> 하룻밤 배양이 완료되면, 수확 및 수영장 50 ML 원뿔 튜브에 펩타이드와 펄스 DC가 포함 된 모든 우물. </li><li> 6 분 동안 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거합니다. 5 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장에있는 세포 펠렛을 resuspend. 최대 RPMI / 1 %자가 플라즈마 50ml로 전체 볼륨을 가져와. 철저하게 섞는다. </li><li> 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다. </li><li> 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 5 ML steri의 각 펠렛을 resuspend을르 0.9 % 염화나트륨, USP 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송. 더 멸균 0.9 % 염화나트륨, USP와 함께 14 ML 각 세포 현탁액을 가져옵니다. 반전에 의한 모자 및 섞는다. </li><li> 이전 단계를 두 번 반복합니다. 마지막으로 원심 분리 한 후 펠렛을 방해하지 않고 최대한 가까이 세포 펠렛을 받고, 상층 액을 제거하십시오. </li><li> 4시에 DC 냉동 용액에 세포 펠렛을 Resuspend - 20 X 10 6 세포 / 각 1.8 ML의 CryoTube 유리 병에 ML 및 나누어지는 1 ML. </li><li> DC 백신의 분주을 동결하고 장기 저장을위한 액체 질소 냉동고의 기상으로 즉시 전송, 제어 속도 냉장고, 프로그램 사용 1. </li></ol> 7. 많은 릴리스 테스트 <ol><li> DC 백신의 각 배치를 평가하고 일반적으로 5~6주 백신 준비 후 연구에서 환자에 주입 해제되기 전에 특정 로트 출하 기준 (표 1)을 만족해야합니다. </li><li> 생존 :자동 셀 카운터를 사용하여 DC 백신의 가능성을 평가한다. 최소 허용 가능성 사양&gt; 70 %이다. </li><li> 식별 : 유동 세포 계측법에 의해 성숙 수지상 세포 (CD11c + CD14-CD83 +)의 신원을 평가합니다. CD11c의 + 세포의 비율&gt; 75 %이어야한다. CD11c + 및 CD14 + 세포의 비율이되어야합니다 &lt;30 % CD11c의 비율 +, CD14-, 및 CD83 + 세포가 있어야한다&gt; 75 %. </li><li> 불임 : 직접 문화 그램 얼룩에 의한 혐기성과 호기성 세균과 곰팡이의 존재에 대한 테스트 DC 백신. 직접 배양 시스템 및 지표 세포주 DNA 형광 염색 분석을 사용하여 마이코 플라스마의 존재를 평가한다. 이러한 테스트의 최소 사양 집합은 성장이 모든 문화에서 관찰되는 것입니다. </li><li> 독소 : 운동-QCL 운동 발색 LAL 분석을 사용하여 독소의 내용을 평가하고 최소한의 기준을 충족 &lt;50 EU / ML해야합니다. </li><lI&gt; 기능 : 동종 T 세포와 함께 배양하여 혼합 림프구 반응 DC 기능을 평가합니다. 자극받지 않은 수지상 세포에 비해 증식의 존재는 (그림 3)보고됩니다. </li></ol>

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저자는 다음에서 재정 지원을받은 : NIH (AI061684, AI071078, AI044628, 및 K08 AI084578 (밀러)), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 도리스 듀크 자선 재단, 암 연구소, 루퍼스 연구를위한 동맹, 그리고 에메랄드 재단. 니나 Bhardwaj는 자료 및 내성을 조작하는 수지상 세포의 사용과 관련된 특허에 coinventor입니다. 저자는 다른 관련 제휴 나 금융 관심이나 떨어져 개시된에서 원고에서 논의 된 주제 나 자료와 재무 충돌 어떤 조직이나 기업과 금융 참여가 없습니다.

단계 I 및 II는 단핵구 유래 수지상 세포의 임상 시험은 환자 그러나 임상 적 성공은 1 제한되었습니다에 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 종양 immunotherapeutic 사용을위한 최적의 수지상 세포를 생성하는 방법에 대한 합의의 부족으로 인해 부분적으로 할 수 있습니다. 임상 등급 수지상 세포를 생성하는 여러 가지 방법이 있지만,이 방법은 단핵 세포 성숙을 유도하는 데 자극 항원 로딩하는 방법을 구분하는 데 사용되는 사이토 카인의 사용 조건에 따라 다릅니다. 최적의 수지상 세포를 생성하는 수식은 여전히 2 정의 할 수 남아 있습니다. 체외 연구에서 최근의 수지상 세포는 임상 시험의 대부분에 사용 된 염증성 사이토 카인 (10)의 칵테일 성숙 특히 PGE2의 존재가, 규제 T 세포와 Th2 사이토 응답 17, 급행 IDO의 분화를 유도 할 수있는 것으로 나타났습...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 배지, L-글루타민</td><td>포함 BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES 완충 식염수</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>인간 알부민, 25% 용액 USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>멸균 식염수 USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 sq cm EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6웰 조직 배양 플레이트</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml CryoTube 바이알</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

임상 연구는 항원 -로드 DC 백신은 안전하고 종양 1 유망한 치료 것을 설치하는 동안, 그들의 임상 효능은 확립되어야 남아있다. 이 방법은, 좋은 제조 공정 (GMP) 지침에 따라 준비, 아래에 설명 된 임상 연구 2 수지상 세포의 큰 숫자를 생성하기위한 가장 일반적인 전직 생체 제조 방법의 최적화입니다. 우리의 방법은 합성 TLR 3 작용제 수지상 세포를 자극하는 Polyinosinic-Polycytidylic 산성 폴리-L-라이신 카복시 메틸 셀룰로오스를 (폴리 ICLC)를 사용합니다. 우리의 이전 연구는 CD83과 CD86, 인터루킨-12의 유도 (IL-12), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 유도의 상향 조절에 의해 평가로 폴리 ICLC 인간 DC에 대한 가장 강력한 개인의 성숙 자극이다 설립 단백질 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) 및 유형 I 인터페론 (IFN), 그리고 최소한의 인터루킨 10 (IL-10) 생산. </p&gt; 수지상 세포는 채집 술에 의해 얻어진 림프구가 냉동 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액)에서 차별화된다. 말초 혈액을 Ficoll 기울기 원심 분리하여 분리 및 분취에 고정되어 있습니다. 1 일에서 말초 혈액을 해동하고 ° C에서 조직 문화 인큐베이터 37 1-2 시간 배양 한 후 플라스틱 표면에 부착 단핵구를 위해 선택하는 조직 문화 플라스크에 도금. 배양 후 림프구는 씻어하고 부착 단핵 세포는 인터루킨-4의 존재 (IL-4)와 미성숙 수지상 세포로 분화하는 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 5 일 동안 배양한다. 6 일에, 미성숙 수지상 세포는 백신의 품질에 대한 관리 역할 및 백신 3의 면역 원성을 높일 수있는 열쇠 구멍 삿갓 조개 헤 모시 아닌 (KLH) 단백질과 펄스 있습니다. 수지상 세포는 성숙 자극 펩티드 항원로드 하룻밤 배양한다. 7 일에 세포를 세척하고 포함 1 ML의 분주에 냉동4 - 제어 속도 냉동고를 사용하여 20 X 10 6 세포. 수지상 세포의 배치를위한 방출 시험이 수행되고 그들이 환자에 주입되기 전에 최소 사양을 충족해야합니다.

10 사이 - 시작 말초 혈액의 20 %는 문화 시대의 끝에서 수지상 세포로 분화. 성숙 수지상 세포는 CD11c 있습니다 +, CD14-, CD83 +, CD40 +, 및 CCR7 + (그림 1). 그들은 MHC 클래스 I 및 II 분자와 보조 자극 분자 CD80 및 CD86의 높은 수준을 표현한다. 다른 TLR 길항제 (14)에 비해 폴리 ICLC는 PDL-1의 낮은 수준을 유도. 또한 이러한 폴리 IC-성숙 수지상 세포 분비 큰 IL-12의 양의 (그림 2, 15,16)과 동종 T 세포 (그림 3)의 확산을 유도. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50085/50085fig1highres.jpg"...

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

본 절차의 전반적인 목적은 면역요법을 위한 임상 등급 수지상 세포의 제조 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성분채집술로 분리한 말초혈액 단핵세포를 동결합니다. 두 번째 단계에서는 동결된 pbmc 분주액을 해동하고, G-M-C-S-F와 IL 4 존재 하에 5일 동안 단핵구를 수지상 세포로 분화시킵니다.다음으로, 수지상 세포를 수확하고 펩타이드로 펄싱한 후, TLR3 작용제인 poly ICLC를 사용하여 하룻밤 동안 성숙시킵니다. 마지막 단계에서는 성숙한 수지상 세포를 수확하여 여러 분량으로 나누어 냉동 보관합니다. 이렇게 냉동된 성숙 수지상 세포 분주액은 해동 후 주사기에 옮겨 담아 환자의 면역 치료의 일환으로 다시 주입할 수 있습니다.본 절차의 시연은 저희 실험실의 연구 기술원인 Sedia와 Farra Hassan이 담당하겠습니다. 혈장 전송 세트를 사용하여 백혈구 성분 채집백의 액세스 포트 하나를 무균적으로 천자합니다. 그다음 60 mL 주사기를 사용하여 백혈구 성분 채집액을 멸균된 500 mL 병으로 옮깁니다. 이어서 상온의 RPMI를 사용하여 백혈구 성분 채집액의 부피를 원래 부피의 2배로 조절하고 충분히 혼합합니다. Fial pack plus 한 병을 부드럽게 섞은 후, 이 용액 12 mL를 멸균된 50 mL 원추형 튜브에 넣고, 희석된 백혈구 성분 채집물 30 mL를 각 Fial 튜브 위에 조심스럽게 층을 이루도록 쌓습니다.FI call과 세포 현탁액 사이의 계면이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 브레이크 없이 상온에서 1000 GS로 20분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 각 튜브에서 뿌연 층의 pbmc를 조심스럽게 수확하여 새로운 멸균 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.다음으로, 각 튜브에 RPMI를 추가하여 최종 부피를 50 milliliters로 맞춘 후, 튜브를 가볍게 뒤집어 세포 현탁액을 혼합합니다. 500 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 튜브에서 상청액을 제거하고 각 튜브의 세포 펠릿을 RPMI에 재현탁하여 최종 부피를 50 milliliters로 맞춥니다. 튜브를 가볍게 뒤집어 혼합한 후, 세포 수와 생존율을 측정합니다.다음으로, 세포를 원심분리하고 펠릿을 갓 제조한 동결 배지에 2 × 10⁸ cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. 세포 용액 1 mL를 1.8 mL 크라이오 바이알에 옮깁니다. 그런 다음 크라이오 바이알을 제어 냉각 냉동고(controlled rate freezer)에 넣고 동결 과정을 시작합니다. 과정이 끝나면 동결된 크라이오 바이알을 즉시 액체 질소 냉동고의 기상(vapor phase)으로 옮깁니다.다음 날, 냉동된 p BMCs 분주액을 37 °C 항온수조에서 가볍게 흔들어 해동합니다. 완전히 해동되면, 바이알의 내용물을 30 mL의 RPMI와 자가 혈장(autologous plasma)이 들어 있는 멸균된 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 조심스럽게 원심 분리합니다. 세포 펠릿을 소량의 RPMI 및 자가 혈장 혼합액으로 다시 현탁합니다.그다음 RPMI와 자가 혈장을 추가하여 최종 부피를 50 milliliters로 맞춥니다. 현탁액을 충분히 혼합한 후, RPMI와 자가 혈장 40 milliliters에 1.4 × 10⁸개의 세포를 225 centimeter squared Easy flask에 분주합니다. 단핵구가 플라스크에 부착될 수 있도록 5% carbon dioxide가 포함된 조직 배양 인큐베이터에서 Easy flask를 수평으로 눕힌 상태로 37 °C에서 1~2시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 비부착 세포를 제거하기 위해 미리 가온한 RPMI 30 milliliters로 Easy flask를 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후, IL-4와 G-M-CSF가 포함된 자가 혈장 혼합 RPMI 40 milliliters를 세포에 첨가하고, EASI 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양합니다. 5일 후 플라스크를 세게 흔들고 피펫팅하여 재부유시킵니다. 부착되지 않았거나 느슨하게 부착된 세포들을 수집하여 새로운 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다.세포를 원심 분리한 후, 세포 펠렛을 50 milliliters의 RPMI 및 자가 혈장 혼합액에 현탁합니다. 세포 현탁액을 혼합 및 세척한 후, IL-4와 G-M-CSF가 포함된 3 milliliters의 RPMI 및 자가 혈장 혼합액과 함께 6-well 조직 배양 플레이트의 웰당 1~2 × 10⁶개의 세포를 분주합니다. 그 다음, 5% carbon dioxide가 포함된 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 6-well 배양 플레이트의 웰 중 1/3에 10 micrograms/milliliter의 KLH를 첨가하고 플레이트를 소용돌이 형태로 흔들어 섞어줍니다.그런 다음 각 웰에 2 µg/mL의 poly ICLC를 첨가하고 잘 섞어줍니다. 다음으로, 지정된 웰에 100 µg/mL의 롱 펩타이드 항원을 첨가하며, 교차 경쟁을 방지하기 위해 각 웰에는 단 한 종류의 펩타이드만 넣습니다. 그 후 5% CO2가 포함된 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 7일째에 수지상 세포가 포함된 모든 웰을 수확하여 한데 모읍니다.6일째에 펩타이드를 펄스 처리한 후 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 흡입된 세포 펠릿을 5 milliliter의 RPMI 및 자가 혈장으로 재현탁하고, RPMI 및 자가 혈장을 추가하여 총 부피를 50 milliliter로 맞춘 다음 세포 현탁액을 충분히 혼합합니다. 생존 세포의 총 수를 계산한 후, 튜브를 원심 분리하여 각 펠릿을 5 milliliter의 멸균 염화나트륨으로 재현탁하고, 14 milliliter의 멸균 염화나트륨으로 각 세포 현탁액을 두 번 더 세척합니다.각 세척 단계 후, 두 번째 세척 후에 튜브를 섞어줍니다. 세포 펠릿을 밀리리터당 4~20 × 10⁶개의 세포 농도가 되도록 수지상 세포 동결액에 재현탁하고, 각 세포 현탁액 1 mL를 1.8 mL 크라이오 튜브 바이알에 분주합니다. 마지막으로, 제어 냉각 장치를 사용하여 수지상 세포 백신 분주액을 동결시킨 후, 장기 보관을 위해 즉시 액체 질소 냉동기의 기상 영역으로 옮깁니다.배양 기간이 종료될 때 초기 p BMC의 10~20%가 수지상 세포로 분화합니다. 굵은 선으로 표시된 poly ICLC에 반응한 수지상 세포의 성숙도는 CD 83, CD 40 및 CCR 7의 발현을 기반으로 평가되었으며, 이 막대 그래프에 나타난 것과 같이 회색 음영으로 표시된 비자극 수지상 세포와 비교되었습니다. 본 실험에서 세 명의 건강한 공여체로부터 분화되어 poly IIC로 성숙된 수지상 세포는 다량의 IL 6, IL 8, IL 12 및 TNF alpha를 분비합니다. 이러한 poly ICLC 성숙 세포는 CFSE 발현으로 입증된 동종 T세포 증식뿐만 아니라 개발 후 인터페론 감마 생성을 유도합니다.이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 암 및 감염성 질환의 면역 요법을 위해 수지상 세포의 활용 방안을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

합성 면역 능력 호스트에서 평가, 암 줄기 세포 (CSC) 기반 수지상 세포 (DC) 백신은 이질 적인 대량 종양 세포와 펄스 전통적인 DC 백신 보다 상당히 높은 항 종양 면역을 입증.

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

미성숙 수지상 세포는 내성과 내성 사이의 균형을 조절하기 위해 내성 또는 성숙 수지상 세포로 선택적으로 분화될 수 있습니다. 이 연구는 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(moDC), 체외 내성 및 성숙한 moDC(대사 표현형이 다른 moDC)를 생성하는 방법을 제시합니다.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

시알리다아제 처리를 사용하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 탈시알릴화된 인간 단핵구 유래 수지상 세포(mo-DC)를 생성하는 독특하고 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 또한, mo-DC의 표현형 및 기능적 특성을 평가하고, 시알리다아제 처리가 mo-DC의 성숙 수준을 어떻게 향상시키는지를 평가하는 방법이 기재되어 있다.

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

이 프로토콜은 전사 인자 PU.1, IRF8 및 BATF3의 강제 발현을 통해 마우스 암세포를 종양 미세 환경 내에서 유형 1 수지상 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 것을 설명합니다.

종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

학습하세요 종양 면역요법을 위한 임상 등급 수지상 세포 준비 방법을. 단핵구에서 GM-CSF와 IL-4로 5일간 분화시키고 TLR3 작용제로 성숙시킨 후 항원을 적재합니다. 이 기술은 자가 세포 기반 암 치료 효능을 높입니다.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

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