Name: T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 Pseudomonas aeruginosa의 T6SS를 활용한 세균 경쟁 시각적 분석법을 통해 Escherichia coli 표적 세포 생존을 평가하는 방법을. 이 기술은 세균 살해 활성을 신속하게 분석하여 만성 감염 치료 전략 수립에 기여합니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트 부여 WT091939MA로 운영되었습니다. 알랭 Filloux는 로얄 협회가 지원됩니다.

1. 박테리아 변종과 문화 <ol><li> (표준 CaCl 2 치료 electroporation을 사용하여) 15 E.를 변형하여 대장균받는 셀을 (먹이, P) 엔지니어 lacZ 유전자 (표 1)의-complementation을 허용하는 플라스미드와 대장균 DH5α 세포를. 판 Luria-Bertani 한천 플레이트에 변형 세포 (LBA, 1.5 %의 한천)가 포함 된 5 - 브로 모-4 - 클로로 인돌 릴-β-D-galactopyranoside (X-여자) 40 MG / ML 최종 농도 및 적절한 항생제. ° C 하룻밤 다음과 같은 아침 (§ 1.3 참조) 푸른 transformants에 대해 선택한 37 품다. </li><li> T6SS - 활성 녹농균 기증자 세포 성장 (D +) 또는 T6SS - 비활성 (D-) (표 1) 밤 LBA에 37 번 ° C. 예제에서 우리는 P.를 사용 여기에 제시된 aeruginosa의 retS가 소유 변형constitutively 활성화 H1-T6SS 16 H1-T6SS 유전자 클러스터 (표 1)의 삭제와 isogenic 돌연변이. </li><li> 다음 날, E. 사이에 밝은 파란색 복제를 inoculating하여 aerated 플라스크에 밤새 액체 문화를 준비 판에서 대장균의 transformants (P)은 적절한 항생제로 보충 tryptic 간장 국물 (TSB)의 5 ML에 § 1.1에 설명되어 있습니다. 37 교반에 따라 성장 ° C. § 1.2에 설명 된 판에서 - (D) (D +) 및의 단일 식민지와 동일하게 진행합니다. </li></ol> 2. 경쟁 분석 <ol><li> 다음 날 실험에 대한 LBA 판을 준비합니다. 이 플레이트가 제대로 (분젠 버너 근처 또는 층류 캐비닛에 표시) 건조되어 있는지 확인하십시오. (D -) 긴장 (D +)에 대해 &quot;분석 - 입력&quot;(A-입력) 판을 준비하고, (P </strong&gt;). &quot;검정 출력&quot;(A-출력) 변종에 대한 판을 준비 (D - + P)와 (D + + P). 분할하고 이에 따라 번호판을 레이블을 붙입니다. </li><li> 하루 아침에 성장 후 (§ 1.3 참조), 입력 세균성 문화 (D - D +와 P)의 광학 밀도 (OD 600nm)를 측정하고 각 변형의 1 단위 OD 600nm에 세포 밀도에 상응를 얻을하는 데 필요한 볼륨을 계산 . 각 &quot;입력&quot;세포 배양 (D - D +와 P) 처음 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브에 수집됩니다. </li><li> 상온에서 1 분 동안 13,000 rpm으로 세균 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> D의 알약을 Resuspend -, D +, 및 P의 부드러운 pipetting하여 신선한 TSB의 100 μl의 문화, 그리고 각 이리와! 빨리 10 ML의 예방&quot;A-입력&quot;플레이트 (§ 2.1 작성)의 한 곳으로 부담을 sponding. </li><li> &quot;A-출력&quot;판을 (§ 2.1 작성) 예방. 더 정확하게, 30 μl (P)과의 30 μl로 (D +)의 부드럽게 30 μl를 혼합 (D -) 두 개의 Eppendorf 튜브 (사용 된 문화가 § 2.4에 설명되어있는 것을주의) 30 ML (P)과 . 믹스 (D + / P)의 20 μl의 예방 및 (D - / P)의 &quot;A-출력&quot;판에 개별적 있습니다. 장소 근처에 분젠 버너를 건조하고 박테리아 살해가 진행되는 동안 시간의 적절한 기간 동안 37 ° C에서 보육의 판을 게재 할 수 있습니다. P.의 경우 aeruginosa는 ​​효율적인 세균 살해은 5 시간의 부화 후 T6SS 결함이있는 변형과 활성 T6SS를 비교했을 때 관찰된다. </li></ol> 3. t의 질적 전망대그 세균 살인 <ol><li> 40 μg / ML 분석의 판독을위한 X-여자를 포함 LBA 판을 준비합니다. 플레이트는 &quot;판독 입력&quot;또는 격리 된 박테리아 또는 &quot;판독 출력&quot;또는 &quot;R-출력&quot;혼합 박테리아 문화를 파악하고 따라서 죽이는 성능을 읽을를 발견하려면 &quot;R-입력&quot;라고합니다. 이 번호판은 제대로 건조도 필요합니다. 그 뒤에 다른 네 동일한 부분에 금속판을 나눈다 0, 10 -1, 10 -2, 10 -3이 부분을 주석 (§ 3.3 참조) 한천 플레이트에 탐지하는 박테리아 문화의 dilutions을 지정. 희석 같은 곳에서 흰색 / 파란색 박테리아 비율의 반 정량 평가를 할 수 있습니다. </li><li> &quot;A-입력&quot;플레이트 (§ 2.4 참조)에서 멸균 루프 개인 세균 명소와 &quot;A-출력&quot;플레이트 (§ 2.5 참조) 수집 및 TSB 1 ML을 포함하는 별개의 1.5 ML Eppendorf 튜브의 각 자리를 resuspend. 효율적으로 resuspend 30 분 동안 Eppendorf 흔드는 블록에 배치세균. </li><li> TSB 900 μl를 포함하는 5 회 3 Eppendorf 튜브 일련의 준비와 10 -3 ~ 10 배 시리얼 dilutions까지 각 resuspended 곳으로 진행합니다. 피펫 팁을 변경하고 각 희석 단계 사이의 소용돌이 5 초에해야합니다. </li><li> , undiluted 정지에 가장 희석로 시작하여 40 μg / ML X-여자를 포함 잘 말린 LBA 판에 § 3.3에서 조리하여 세균 dilutions의 야생 &quot;A에 대한 다음의&quot;R-​​입력 &#39;판을 만들기 위해 진행 - 입력 &quot;장소와&quot;A-출력 &quot;부분 (그림 2) R-출력&quot;에 대한 판 &quot;. 동질적인 세균 현탁액을 유지 야생로 이동하기 전에 잠시 소용돌이 각 관. 구역 내에 결과, 세중의에 자리 20 μl (그림 2)의 재현성하십시오. 장소는 개별적으로 접시에 분리 된 상태로 유지하고 서로를 향해 활강하지 않아도 돼 이후 판의 상대적 건조는이 단계에서 중요합니다. 경쟁 분석의 정량화는 실험이 단계에서도 가능합니다. 단계 3.3에 이어, 40 μg / ML X-여자를 포함 LBA 플레이트에 희석 10 -3 100 μl을 알리십시오. 결과의 재현성를 들어, &#39;A-출력 &quot;판의 각 지점에 대한 세중의에 도금을 수행합니다. ° C 배양기 박 (16 시간의 배양에 해당) 37 년에 희석 판을 놓습니다. 푸른 식민지 (살아 남은 P 세포)의 계산을 수행합니다. 경쟁의 5 시간 후 얻은 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. </li><li> 각 지점에서 초과 액체의 흡수를 허용하도록 무균 지대 내의 플레이트 개방 (NO 뚜껑)를 둡니다. </li><li> 밤에는 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. 이 부화 시간 동안 살인은 여전히 두 변종 접촉에 아직도 있기 때문에 (D + / P) 혼합에서 발생합니다. </li><li> 사진을 찍으또는 출력 분석 (그림 2)에 대한 번호판을 검사합니다. 장소는 주로 파란색으로 남아 어디서 나타냅니다 E. 대장균은 P.에 의해 살해되지 않았습니다 aeruginosa. 그게 사건 때 E. 대장균은 T6SS - 결함이있는 P.과 혼합되어 aeruginosa 변형 (D-) (그림 2, 오른쪽 하단에있는 판). </li></ol>

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<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

이 문서에서 제시하는 방법은 T6SS로 인한 bactericidal / bacteriostasis 활동의 시각적 관찰 할 수 있습니다. 검정은 한천 플레이트의 표면에 수행됩니다. 그것은 이전에 혼합 박테리아 액체 문화와 수행 T6SS에 의존 살해 분석 때문에 두 박테리아 팔 사이에 꾸준한 접촉의 부족의 가능성이 효율적 아니라는 것을 보여왔다. T6SS는 대상 셀 17에 DNA를 주입하는 bacteriophages에서 사용하는 것과 유사한 메커니즘으로 작동하도록 생각됩니다. 액체 문화에서 T6SS의 튜브와 같은 구조가 더 쉽게 손상 될 수 있으므로, 간 세균 연락이 손실 될 수 있으며, 독소는 효율적으로 전달되지 않습니다. 부화 시간의 측면에서, 우리는 기증자 변형과 먹이 사이에 설명하는 접촉 5 초기 시간은 P. 사이에 박테리아 살인을 관찰 할 충분 aeruginosa와 E. 그림 3에 도시 대장균, </strong&gt;. 그럼에도 불구하고,이 실험 조건을 최적화하기 위해 운동을 수행하여 부화 시간을 조정하는 것이 좋습니다. 이 방법은 색상 기반 기술이기 때문에, 출력 결과는 기증 스트레인의 착색에 의해 손상 될 수 있습니다. 예를 들어, P.의 경우 aeruginosa, 일부 변종은 먹이의 구별이 상대적으로 어렵게, 검정 판독을 방해 할 수 등 pyocyanin 및 pyoverdine과 같은 색의 안료 높은 수준을 생산하고 있습니다. 예 마젠타 - 여자 또는 붉은 여자와 같은 다른 chromogenic β-갈 락토의 기판은, X-갤런 (표 1) 대신 사용할 수 있습니다. 경쟁 분석은 표시 장치에 대한 다른 기자 유전자를 이용하실 수 있습니다. 예를 들어, 유사한 분석은 또한 녹색 형광 단백질이라는 수수께끼할까요? 12을 사용하여 수행되었습니다. 우리 분석은 양적되지 않고, 좋은 표시를 제공합니다T6SS 활동은 생존 또는 기자 먹이의 살해를 기반으로하기 때문입니다. 이 기술은 쉽게 모든 세균 종에서 T6SSs의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 것이 편리라는 장점을 제공합니다. 지금까지 T6SS의 활동은 그람 음성 박테리아와 T6SS에 민감한 그람 양성 세균의 알 수없는 예에 대해 표시되었습니다 아직 12 신고되었습니다. 이 테스트 할 수있는 다른 박테리아 종의 문화에 비 호환성 (예 성장 온도, 산소, 특정 미디어)으로 간주 할 것을 또한 분명합니다. 우리 검정도 분비 독소도 흔적이 먹이를 죽일 수있는 충분한 될 수 있기 때문에 T6SS 구성 요소의 어떤 절대적으로 필수적입니다 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 표면에 뜨는과 서양 얼룩를 사용하여 표준 절차 테스트 T6SS에 따라 달라 분비에 비해 T6SS의 약한 활동은 다음 명확하게 분석에 의해 감지 될 수분석. 그러나, 적절한 집락 형성 단위 (CFU) 계산은 여전히​​이 T6SS 활동의 정확한 정량화가 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa의 PAKΔ retS (D +) (활성 T6SS) </td><td> 연구실 변형 </td><td></td><td> 참조 16에 설명 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ retS Δ H1-T6SS (D -) (비활성 T6SS) </td><td> 이 연구 </td><td></td><td> H1-T6SS 클러스터는 (유전자에게 PA0070에 PA0095을 포함한) 참조 18에 설명 된 절차에 따라 allelic 교환에 의해 삭제되었습니다. 최대 조각 프리 머 : mutator 조각은 프리 머의 다음 세트 생성되었습니다 : 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;및 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. 다운 조각 프리 머 : 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39; <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 락 ZΔM15 Δ (LAC ZYA-ARG F) U169 오락 A1 끝 A1 hsd R17 (R K - m K +) 검사하고 사진을 한모금 E44 λ-생 -1 gyr A96 상대 A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> 애질런트 </td><td> 212205 </td><td> 이 벡터는 α-complementation에 사용되는 β-갈 락토의 α 펩타이드을 표현한다. </td></tr><tr><td> X-여자 </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> 40 μg / ML에서 사용 </td></tr><tr><td> Luria Bertani 한천 </td><td> 머크 - 화학 물질 </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (카세인 콩 국물) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 와류 흔드는 천재 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> 스캐너 </td><td> 엡손 </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 셀 밀도 측정기 </td><td></td></tr><tr><td> 자홍색 - 여자 </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> 붉은 여자 </td><td> 연구 유기물 </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 사용 스트레인, 플라스미드, 재료 및 시약. </td></tr></tbody></table>

t6ss로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

유형 VI의 분비 시스템 (T6SSs)는 그람 음성 박테리아 타겟 세포의 1,2 다양한으로 단백질을 운반하고 주입 할 수 있도록 분자 nanomachines 있습니다. T6SS은 13 핵심 구성 요소로 구성하고 bacteriophages 3의 꼬리 - 관과 구조 유사성을 표시합니다. 파지는 튜브 및 대상 세균의 세포 봉투에 침투 DNA를 삽입 할 수있는 펑 쳐링 장치를 사용합니다. 그것은 T6SS는 표면에 effectors과 독소를 운전 세균 세포 봉투에서 특정 경로를 만드는 역 박테리오파지 장치입니다 제안합니다. 과정은 더 촬영 할 수 있으며 T6SS 장치는 따라서 이러한 목표에 effectors를 주입, 박테리아가 접촉하는 다른 세포를 구멍 수 있습니다. 꼬리 관과 T6SS의 펑 쳐링 장치 부품은 각각 4,5, HCP와 VgrG 단백질로 만들어집니다. T6SS의 기능성이 제품을 통해 입증되었습니다다양한 세균 병원균을 사용하여 tudies. 비브리오 cholerae의 T6SS는 C-터미널 고를 가교 도메인 6,7를 갖고 &quot;발전&quot;VgrG을 주입하여 진핵 숙주 세포의 세포 골격을 개조 할 수 있습니다. 또 다른 인상적인 예를 들어 최근 따라서 특정 미생물 틈새 시장 및 경쟁 환경 8,9,10에서 박테리아의 설립을 촉진, T6SS에 의존 방식으로 박테리아를 타겟으로하고 죽일 수 있습니다 녹농균을 사용하여 문서화되었습니다. 후자의 경우, 즉 세 T6SS - 분비 단백질, Tse1, Tse2 및 Tse3이 대상 세균 (그림 1)에 주입 독소로 확인되었습니다. 기증자 세포는 Tsi1, Tsi2 및 Tsi3 면역 단백질 8,9,10에 의해 중재 해독제 메커니즘을 통해 이러한 effectors의 해로운 영향으로부터 보호됩니다. T6SS - 실력 박테리아가 S에 공동으로 재배하는 경우이 항균 활성을 모니터링 할 수 있습니다다른 박테리아 종으로 또는 같은 종 8,11,12,13의 T6SS - 비활성 박테리아와 경쟁에서 olid 표면. 사용할 수있는 데이터는 항생제 제조사에 크게 의존 시간이 소요 CFU 계산을 포함하여 세균 경쟁 분석에 숫자 접근 방식을 강조했다. P. 같은 항생제 내성 변종의 경우 aeruginosa,이 방법이 부적절 할 수 있습니다. 또한, 100 개 이상의 박테리아 genomes 14 200 다른 T6SS loci의 식별과 편리한 검사 도구는 매우 바람직하다. 우리는 사용하기 쉬우 및 표준 실험실 자료와 시약을 필요로하는 검정을 개발했습니다. 방법은 lacZ 유전자의-complementation을 허용하는 먹이 (이 경우에는 대장균이 DH5α)로 기자 스트레인을 사용하여 T6SS에 의존 bactericidal / bacteriostasis 활동을 모니터링 할 수있는 신속하고 질적 기술을 제공합니다. 전반적으로,이 방법은 grap입니다혼성 집적 회로 및 한천 플레이트에 T6SS 관련 phenotypes의 빠른 식별 할 수 있습니다. 이 실험 프로토콜은 계정으로 이러한 성장 미디어, 온도 나 접촉 시간 등 특정 조건을 복용 다른 변종이나 세균 종에 적용 할 수 있습니다.

전형적인 결과는 표 1에 설명 된 긴장과 시약과 그림 1에 표시됩니다. 이 그림에 표시된 플레이트는 하루 아침에 부화 한 후 스캔했다. &quot;판독 - 입력&quot;접시는이 분석에서 사용되는 변종에 대한 일련 희석 패턴을 보여줍니다. 예상대로, E. 대장균하는 동안 기증자 P., overexpressing는 lacZ 유전자가 X-여자에 보충 미디어에 파란색 표시 부분 (P)를 먹이로 aeruginosa의 긴장 (D +, T6SS 활성화) 및 (D - T6SS 비활성) 흰색 남아 있습니다. 먹이와 T6SS 활성 스트레인 (D + / P) 사이의 혼합은 푸른 색의 실종을 보여 발견 된있는 &quot;판독 출력&quot;접시 따라서이 살해 당했다는 표시 먹이. 이것은 먹이를 outcompete 할 수있는 기증자의 능력을 보여줍니다. (에 푸른 색의 지속성D - / P) 판은 푸른 먹이를 죽이려는 비활성 T6SS 기증자의 무능력을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. E.의 죽이는 T6SS - 실력 P.에 의해 대장균 aeruginosa. P. aeruginosa는 ​​E.에 독소를 주입 T6SS 종속적 인 방식으로 대장균은 대상 셀 (흰색 화살표로 표시). 두 독소 Tse1 및 Tse3은 (황색 및 적색 원) E.에 주입 아르 대장균의 periplasm과 peptidoglycan 9 저하. Tse2 독소 (노란색 원)가 E.에 주입되는 대장균 세포질 및 정균 활동주세요 8,10 있습니다. 독소의 결합 작업은 대상 세포를 (번개와 두개골의 플래시) 살인. 대상 셀의 생존은 (그림 2 참조) 생산 β-갈 락토의 활동을 모니터링하여 감지 할 수 있습니다. P.는eruginosa은 면역 단백질 Tsi1, Tsi2 및 Tsi3 (각각 오렌지색, 노란색과 붉은 광장) 8,9,10에 의한 독소의 활동에 대해 보호됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> 그림 2. 한천 플레이트 분석은 T6SS 종속적 인 박테리아 살인을 모니터링하는 방법이 그림에서 상부 D의 일련 dilutions 구성된 &quot;판독 - 입력 &#39;접시에 표시됩니다 -., D +, 및 P 입력 세포. P 입력 셀은 lacZ 유전자의 α-complementation로 인해 파란색이고 따라서 생산 β-갈 락토 cleaves는 X-여자 것을. 하단 부분에 활성 (D + / P) 사이의 세균 믹스의 일련 dilutions으로 구성된 &quot;판독 출력&quot;번호판을 표시됩니다 </str긴 사연&gt;, 또는 비활성 (D - / P), T6SS 기증자 P. E.로 aeruginosa 스트레인 대장균은 먹이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. E.의 살인 정량화 P.에 의해 대장균 5 시간의 부화 후 aeruginosa이 있습니다. 그래프는 E.의 CFU 계산을 제시 대장균은 3.4 단계에 설명되어 있습니다. 결과는 살해의 대부분은 접촉 5 초기 시간 동안 진행되는 제안, T6SS +와 T6SS - 변종 사이에 3 배 차이를 보여 여기 소개했다.

우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을 설명<em&gt; 녹농균</em&gt; 유형 VI의 분비 시스템 (T6SS). 검정은을 가진 대장균 대상 세포의 생존 / 살인에 의존<em&gt; lacZ</em&gt; - 기자. 이 기술은 T6SS - 숙련 된 미생물의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 조절합니다.

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

다음 실험의 전반적인 목적은 동일한 틈새 시장에서 번성할 때 서로 경쟁할 수 있는 두 박테리아 종의 능력을 평가하는 것입니다. 특히, 우리는 이 경쟁 과정에서 6형 분비 시스템 또는 6형 분비의 역할을 평가할 것입니다. 이는 활성 6형 기증자 세포 또는 피식 세포가 있는 분석 입력 플레이트를 준비하여 달성되며, 이는 파란색 OnX 스케일 플레이트가 됩니다.그런 다음 donor와 praise 균주가 결합된 분석 출력 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 플레이트를 배양하여 6형 활성이 발생할 수 있도록 합니다. 그런 다음 입력 및 출력 플레이트에서 연속 희석을 준비하고 희석된 배양물을 판독 입력 및 출력 플레이트에서 발견합니다.각 사례에서 먹이 세포의 생존을 나타내는 간단한 육안 관찰을 기반으로 각 지점에서 파란색의 우성 차이를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 파란색이 많을수록 먹이 생존율이 높아 공여자 세포의 살해 활동이 저하됩니다. 군체 형성 단위를 세는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 쉽고 시간이 많이 걸리지 않으며 주어진 먹이에 대한 유형 6 활동을 직접 평가할 수 있다는 것입니다.따라서 이 기술은 혼합 배양에서 박테리아 밀봉 활성을 평가하므로 낭포성 섬유증 환자의 폐에 있는 슈도모나 정강이의 경우와 같이 일부 만성 다미생물 감염이 궁극적으로 단일 박테리아 종에 의해 지배되는 이유를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우선, 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 LB 한천 또는 LBA 플레이트에서 6형 활성 D 양성 또는 6형 비활성 D 음성인 총 슈도모나스 에어로겐 기증자 세포. 여기에 제시된 예에서, 우리는 구조적으로 활성인 H one type six를 가진 슈도모나스 에어로겐 RET S 균주와 H one type six 유전자 클러스터 엔지니어, E 대장균 수용 세포 또는 먹이가 결실된 동종 돌연변이를 사용하여 DH 5 알파를 플라스미드로 형질전환시켜 결핍된 유전자의 알파 보완을 가능하게 했습니다.XGL과 적절한 항생제로 LB의 글리세롤 스톡에서 박테리아를 분리하고 다음 날 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 청색 형질전환체를 선택하고 항생제가 함유된 TSB의 5밀리리터에서 하룻밤 배양을 준비하고, 항생제가 함유된 TSB를 다음날 실험을 위해 섭씨 37도에서 교반하여 성장하고, 균주, D 양성, D, 음성 및 P에 대한 분석 입력으로 표시된 LBA 플레이트를 준비하고, D 음성, P 및 D 양성 및 P에 대한 분석 출력을 준비합니다. 각 입력 세포 배양에 대해, 광학 밀도를 측정하고 하나의 단위 OD 600에 해당하는 셀 밀도를 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다. 멸균 1.5ml 마이크로 튜브에 각 배양물을 수집합니다.박테리아 샘플을 13, 000RPM에서 1분 동안 파일럿하고 Resus를 100마이크로리터의 새로운 TSB에 펠릿을 현탁시킨 후 각 균주 10마이크로리터를 A 입력 플레이트의 단일 지점으로 접종합니다. 다음으로, 부드럽게 P 30 마이크로 리터와 D 긍정의 30 마이크로 리터를 혼합하고 두 번째 튜브에서, P 30 마이크로 리터와 D 네거티브의 30 마이크로 리터를 혼합 한 다음 각 혼합물의 20 마이크로 리터 스폿으로 플레이트의 A 출력을 접종합니다. 반점이 아버스와 버너 근처에서 건조되도록 한 후 접시를 섭씨 37도에서 배양하여 박테리아 사멸이 일어나도록 합니다.박테리아 사멸 성능을 분석하려면 xal 밀리리터당 40마이크로그램을 함유한 LBA 플레이트를 준비합니다. 분석 판독의 경우, 분리된 박테리아를 발견하기 위해 플레이트 판독 입력에 레이블을 지정하거나 4개의 동일한 부분으로 나누어진 각 플레이트 뒷면에서 혼합 박테리아 배양을 발견하기 위해 출력 출력에 레이블을 지정하고, 섹션 0 10을 마이너스 1로, 10을 마이너스 2로, 10을 마이너스 3으로 표시합니다. 각 희석을 통해 동일한 지점 내에서 청백색 박테리아 비율에 대한 반정량적 평가가 가능합니다.멸균 루프를 사용하여 A 입력 플레이트와 A 출력 플레이트에서 개별 박테리아 스팟을 수집하고 각 스팟을 1ml의 TSB가 포함된 별도의 1.5ml 마이크로 튜브에 다시 부유시킵니다. 배양물이 흔들리는 동안 박테리아를 다시 부유시키기 위해 튜브를 30분 동안 흔듭니다. 각각 900마이크로리터의 TSB를 포함하는 3개의 마이크로 튜브로 구성된 5세트를 준비합니다.그런 다음 각 현탁 지점에서 시작하여 새로운 팁을 사용하여 10배 연속 희석을 준비하고 가장 희석된 샘플부터 시작하여 희석되지 않은 샘플로 끝나는 LVA xal 플레이트의 각 희석 지점 사이에서 잠시 와류를 수행합니다. R 입력 플레이트의 A 입력 튜브와 R 출력 플레이트의 A 출력 희석을 재현성 스폿당 도금하면 각 사분면 내에서 20마이크로리터를 3배로 정렬합니다. 이 단계에서 경쟁 에세이를 정량화하기 위해, 100 마이크로 리터의 플레이트, 10에서 A 출력에서 3 희석액을 뺀 값, LBA xga 플레이트에서 샘플을 세 번 배양하고, 섭씨 37도에서 밤새 배양하고, 멸균 영역에서 파란색 식민지를 세고, 여분의 액체가 섭씨 37도에서 밤새 흡수하고 인큐베이터가 얻을 수 있도록 플레이트를 열어 둡니다. 이 시기에도 살인은 여전히 일어나고 있다.두 균주 모두 출력 분석 이미지 또는 플레이트 스캔을 위해 여전히 접촉하고 있기 때문입니다. 대체로 파란색으로 남아 있는 반점은 대장균이 죽지 않았음을 나타냅니다. 표시된 type six defective posis strain으로 배양할 때 일반적으로 나타나는 것처럼, 이 분석에 사용된 균주에 대한 판독 입력 플레이트에 대한 연속 희석은 다음과 같습니다.예상대로, 결핍된 유전자를 발현하는 대장균 프리스폿 P는 XGL이 보충된 매체에서 파란색으로 나타나는 반면, 공여체 p 에어로겐 코는 D 양성 6형 활성 및 D 음성 6형 비활성 상태로 흰색으로 유지됩니다. 먹이와 6형 활성 균주 D 양성 P 사이의 혼합이 발견된 판독 출력판은 푸른 먹이가 사라졌음을 보여주며, 따라서 먹이가 죽었음을 나타냅니다. 이것은 기증자가 먹이를 능가할 수 있는 능력을 보여줍니다.D 네거티브 P 플레이트의 파란색 지속성은 비활성 유형 6 기증자가 파란색 먹이를 죽일 수 없음을 보여줍니다. 따라서 이 절차를 시도하는 동안 성장 또는 유형 6 분비 활성에 대한 요구 사항이 박테리아 종마다 다를 수 있으므로 실험 설정을 약간 조정해야 할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 한 단일 종에서 6형 분비 활성을 평가하려면 가능할 때마다 6형 분비 돌연변이의 활성을 부모 균주와 엄격하게 비교하는 것이 매우 중요하다는 것을 기억해야 합니다.이 비디오를 시청한 후에는 6형 능숙 또는 6형 결함 균주와 접촉한 후 사전 세포의 생존을 평가하기 위해 시각적 에세이를 설정하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Speare, L., et al. Vibrio fischeri 분리주 간의 경쟁적 상호 작용을 정량화하기 위한 공동 큐베이션 분석. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 박테리아 균주가 공유 환경에서 어떻게 경쟁하는지 연구하는 데 사용되는 공동 배양 분석을 보여줍니다. 이러한 상호 작용을 유도하는 접촉 의존적 또는 접촉 독립적 사멸과 같은 메커니즘을 식별하기 위해 미생물학에 널리 적용됩니다.

박테리아 균주 간의 경쟁적 상호 작용을 연구하기 위한 공동 배양 분석

출처: 페린밤, K., 시리아폰, A. 아메바를 이용한 신속 영상 기반 박테리아 병원성 분석. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 아메바를 표면에 부착된 박테리아나 플랑크톤성 박테리아와 함께 배양하고, 칼세인-아세톡메틸 에스터(칼세인-AM) 아가로스 패드를 적용하며, 형광 영상을 이용해 숙주 세포 손상을 감지하는 빠른 이미지 기반 탐지 방법을 시연합니다.

표면에서 유도된 박테리아 병원성 스크리닝을 위한 신속한 영상 기반 분석

이 동영상은 단세포 수준에서 박테리아 경쟁을 연구하는 형광 현미경 기반 방법을 보여줍니다. 이 방법은 박테리아 군집의 구조와 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.

Bacterial Co-Incubation Assay: 단일 세포 수준에서 특이성 내 박테리아 경쟁을 시각화하기 위한 형광 현미경 기반 기술

이 동영상은 혈청에 존재하는 항체의 보체 매개 살균 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 이 접근법은 분리된 혈청과 병원성 박테리아 및 외인성 보체 단백질을 결합합니다. 배양 시, 박테리아는 한천 플레이트에서 성장하고, 생산된 콜로니는 혈청 살균 역가를 측정하기 위해 정량화됩니다.

항체의 보체 매개 박테리아 활성을 위한 혈청 박테리아 분석

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자에 대한 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 위한 두 가지 분석이 설명됩니다. 진입 분석은 Brucella 진입에 필요한 숙주 인자를 검출하고 종말점 분석은 세포 내 복제에 필요한 숙주 인자를 검출합니다. 대체 접근법에 적용할 수 있지만, HeLa 세포의 siRNA 스크리닝은 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

지연 성장 억제 분석법은 한 박테리아 분리물이 다른 박테리아에 미치는 경쟁 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 억제는 억제제를 생산하는 분리물 주변의 정화 영역을 측정하여 정량화하거나 가시적인 억제 정도를 결정하여 정성적으로 평가합니다.

이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기

세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

이 원고는 단일 세포 형광 현미경 검사를 사용하여 공동 문화에서 세균 경쟁을 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

배우세요 Pseudomonas aeruginosa의 T6SS를 활용한 세균 경쟁 시각적 분석법을 통해 Escherichia coli 표적 세포 생존을 평가하는 방법을. 이 기술은 세균 살해 활성을 신속하게 분석하여 만성 감염 치료 전략 수립에 기여합니다.

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

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