Name: 실험 인간 폐렴의 운송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 학습하세요 실험적 인간 폐렴구균 보균 모델 수립 방법을 Streptococcus pneumoniae 비강 내 접종과 비강 세척을 통해. 이 기술은 백신 개발 및 면역 보호 상관관계 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (SBG에 그랜드 챌린지 탐험 상), 건강 연구 (NIHR), 미생물 질병의 바이오 메디컬 연구 센터, NIHR 종합 지역 연구 네트워크의 국립 연구소에 의해 자금을 지원했다. 우리는 infrastructural 지원 NWDA을 인정합니다. 우리는 폐렴 분리에 대한 교수 J. N 버드 바이져, 펜실베니아 대학 교수 P Hermans, 네이 메헨 대학 감사드립니다. 사진을 찍을 대한 참여를위한 모든 자원 봉사자와 매튜 Bangert에 대한 그들의 지원과 조언 EHPC 안전위원회에 감사합니다.

1. 선택과 검진을 자원 봉사 <ol><li> 건강한 자원 봉사자는 NHS 연구 및 윤리위원회 안내에 따라 포스터 광고 통해 대학 웹 사이트에서 모집하고 있습니다. </li><li> 참가 포함 기준은 다음과 같습니다 <ol><li> 18-60년 세 성인. </li><li> 유창한 영어를 구사하고 휴대 전화 및 문자 메시지를 모두 쉽게 의사 소통을 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 참여에 대한 제외 기준은 다음과 같습니다 <ol><li> 위험 개인 (어린이, immunosuppressed 성인, 노인, 만성 질환)에 연락을 닫습니다. </li><li> 현재 흡연자 또는 중대한 흡연의 역사 (&gt; 10 팩 년). </li><li> 천식이나 기타 호흡기 질환. </li><li> 임신. </li><li> 페니실린 또는 amoxicillin에 대한 알레르기. </li><li> 관측하지 않는 한 또는 비 interventional 단계에서 또 다른 임상 시험의 현재 참여. </li><li> 완전 정보​​ 동의 할 수 없습니다. </li></ol></li><li>초기 검사 방문, 약 일주일 접종 전에 초점을 맞춘 임상 역사와 대상 임상 시험이 포함되어 있습니다. </li><li> 이전에 인식 할 수없는 이상이 발견되는 경우, 자원은 연구에서 제외되며 적절한 조사가 일차 의료를 통해 이용하실 수 있습니다. </li><li> 초기 심사하는 동안 화이트 셀 수가 접종 방문하기 전에 정상 범위 내에 있는지 확인하기 위해 취득하는 전체 혈액 카운트를 방문하십시오. 코 세척은 (6.1 참조) 자연 폐렴 사업자를 제외하도록 수행됩니다. </li><li> 접종에 앞서, 자원 봉사자들은 연구에 참여에 수반되는 위험 부담에 대한 교육하고 응급 환자 전단지, 디지털 온도계, 긴급 전화 번호, amoxicillin 3 일 코스를 제공합니다. </li></ol> 2. 접종 주식의 작성 <ol><li> 접종 주식의 준비는 깨끗한 환경에서 수행되어야합니다. 사용 피펫은 사용되어야한다inoculum 준비를위한 D. 모든 유리와 플라스틱 도자기는 살균해야합니다. 우리는 접종 주식은 전용 fumehood과 보육을 사용하여 전용 객실에 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 폐렴 긴장은 혈액 한천 플레이트에 주사합니다. 접시 5 % CO 2 박에 37 ° C에서 incubated 수 있습니다. 다음 날은 모든 박테리아는 혈액 한천 플레이트에서 긁어와 구슬 재고 보존 시스템으로 주사된다. 이 구슬 주식은 접종 재고 준비에 사용됩니다. 접종 주식을 준비하기 전에 오염 및 식민지 균일의 구슬 주식을 테스트합니다. </li><li> 접종 주식을 준비하려면 전체 판을 충당하기 위해 좋겠어, 원하는 폐렴의 혈청 형 비드 재고에서 두 구슬과 혈액 한천 플레이트의 예방. 2 박 5 % CO에서 37 ° C에서 접시를 품다. 모든 자세한 incubations이 동일한 조건을 사용합니다. 또한 불임을 보장하기 하루 아침에 Vegitone 미디어를 품다. </li><li> 다음날 아침에 면봉반 판은 돌보는 것은 모든 혈액 한천을 제거하고 미리 예열 Vegitone의 국물 12 ML에 추가 할 수 없습니다. 접시의 나머지 절반을 사용하여 반복합니다. 탁도의 변화가 명백한 될 때까지 2 시간 또는 37 ° C에서 두 개의 12 ML 튜브를 남겨, 이때 둘 중 빠른 날짜가 적용됩니다. </li><li> 사전 예열 Vegitone의 국물의 40 ML에 12 ML을 추가하고 철저하게 섞는다. 다른 12 ML의 유리 병에 반복합니다. 이 시점 = 0입니다. 600 나노 미터에서 광학 밀도 (OD)를 읽을 수 100 μl를 제거합니다. 마일과 Misra (M &amp; M) 7에 의해 방법의 변형을 사용하여 식민지 형성 단위 (CFU) 수에 의해 박테리아의 정량화 20 μl를 제거합니다. 두 병을 품다. <ol><li> M &amp; M의 경우, 여섯 부분에 혈액 한천 플레이트를 나눕니다. 96 잘 플레이트 여섯 우물 (U-하단)에 멸균 PBS 180 μl를 추가합니다. 톱을 잘 믹스로 국물을 20 μl를 추가합니다. 순차적으로 샘플 1시 10분 6 번 희석하고 여섯째 잘에서 20 μl를 폐기하십시오. 의 첫 번째 섹션에 가기도 곳에서 세 10 μl 물방울혈액 한천 플레이트. 다섯 다른 우물을 위해 반복합니다. 이 반전과 incubated되기 전에 플레이트는 건조 확인하십시오. </li><li> 다음 날은 각 희석 섹션과 기록에 보이는 콜로니의 수를 계산합니다. 30 300 사이의 수와 희석 섹션을 사용하여이 평균을 세 가지에 의해 눈에 보이는 콜로니의 수를 나눕니다. </li><li> 희석 요소를 기준으로 식민지의 평균 수를 곱 후 10 일 (10 μl 방울의 양)에 의해 나눕니다. 이 μl / CFU 수 있습니다. </li><li> CFU / ML을 1,000으로이 숫자를 곱합니다. </li></ol></li><li> 초 중순 로그 단계가 0.25 OD에 도달 할 때까지 M &amp; M 방법 매 시간으로 OD 600 판독하고 박테리아의 정량화를 수행합니다. </li><li> 이 OD에 도달하면 한 병에 살균 10 % 글리세롤을 추가하고 1 ML의 aliquots를 준비합니다. -80에서 저장 aliquots ° C. </li><li> 더 농축 주식, 15 분에 3,345 XG에서 다른 병을 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거합니다. Vegiton의 22.5 ML에서 펠렛을 Resuspend전자 매체와 10 %의 글리세롤을 추가합니다. -80에서 1 ML aliquots 및 매장을 준비 ° C. </li><li> 해동 및 정량화하기 전에 최소 48 시간에 -80 ° C에서 주식을 둡니다. </li><li> M &amp; M 방식으로 얼어 붙은 세균 주식을 수량화. 재현성을 보장하기 위해 개별적으로 삼 재고 튜브를 테스트합니다. 아래에 설명 된대로, 생리에서 원하는 inoculum 농도에 주식을 희석하기 위해 얻은 값을 사용합니다. </li><li> 접종를 들어, inoculum의 pneumococci의 양이 접종 전후 계산됩니다. M &amp; M 방식에 의한 세균의 정량화는이 모든 절차를 완료하는 데 걸리는 시간에 대한 계정 inoculum의 pneumococci의 평균 수를 결정하는 데 사용됩니다. <ol><li> , inoculum을 준비하여 원하는 농도로 diluting하고 &quot;사전 접종&quot;카운트에 대한 M &amp; M 방법으로 정량화를 수행합니다. </li><li> 우리의 임상 연구 시설에서이 전체 접종 절차를 완료하려면 팀 30 분 정도 소요됩니다. PN생리에 eumococcal 중지는 보통이 간격의 감소 카운트를 표시합니다. 이거 설명하기 위해, 우리는 30 분 동안 실온에서 희석 inoculum의 태어난하게하고 M &amp; M 방법으로 박테리아의 &quot;후 접종&quot;정량화를 수행합니다. </li><li> 최종 주사 농도를 결정하기 위해 전후의 평균보십시오. 귀하의 임상 프로토콜에 따라 &quot;휴식&quot;시간을 조절하지만, 가능한 한 짧은으로 간격을 유지. </li></ol></li><li> 모든 신규 주식은 주식 순도과 정체성의 확인을 참조 실험실로 전송 될 것입니다. </li></ol> 3. Inoculum 준비 <ol><li> inoculum의 준비는 예정 자원 봉사 접종을 예약하기 전에 30 분을 시작해야합니다. </li><li> -80 ° C의 냉동고의 이전에 만든 재고 튜브 중 하나를 받아, 해동, 3 분에 17,000 XG에서 microcentrifuge에 튜브를 스핀. </li><li> 37 ° C 배양기에서 따뜻한 혈액 한천 플레이트. 준비96도 M &amp; M 방식으로 세균 정량화를위한​​ 판하고 원하는 용량에 따라 희석 튜브를 준비합니다. </li><li> centrifuged 관에서 국물의 표면에 뜨는을 제거하고 생리 1 ML에 펠렛을 resuspend. 이 단계는 inoculum에서 국물을 제거합니다. </li><li> 원심 분리 단계를 반복합니다. </li><li> 생리 표면에 뜨는을 제거하고 생리 1 ML에 펠렛을 resuspend. </li><li> 원하는 inoculum 농도에 희석 집합을 수행하고 M &amp; M 방법으로 정량화. </li><li> 자원 예약에 inoculum를 타고 자원 봉사자 inoculating 후, 실험실에서 정량화를 반복합니다. -80에서 날짜와 inoculum 선량 및 매장과 관의 레이블을 ° C. </li><li> 접종의 접종에 대한 일관성을 보장하기 위해,이 같은 피펫 및 전용 실험실 장비마다 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 4. 접종 <ol><li> 자원 봉사자는 반 가로 누운 위치에 편안하게 앉아해야합니다. </li><li&gt; P200 피펫을 사용하여 살균 필터 팁 inoculum 100 μl를 이끌어 그냥 비강 내부에 팁을 삽입합니다. </li><li> 천천히 원형 운동을 사용하여 코 점막 위에 inoculum을 배출. </li><li> 이 피펫 팁은 혈류를 입력 박테리아 될 수있는 상피의 무결성의 혼란으로 코 점막과 접촉하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 이 inoculum가 뒤로 너무 많이 배치되지 않았거나이 목구멍으로 넘어 것 또한 매우 중요합니다, 그것은 비강 내부에 거주해야합니다. </li><li> 다른 naris에 대해 반복합니다. </li><li> 지원자는 코를 킁킁 대는 나 날려 버리지 않고 10 분 동안 반 가로 누운 위치에 남아 있습니다. 이 박테리아 시간이 점막에 걸쳐 분산 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 모니터링 <ol><li> 자원 봉사자 접종 후 매일 모니터링하고 있습니다. 이가 오후 2 시부 전에 수사관 자원 봉사자가 보낸 매일 문자 메시지가 포함되어 있습니다. </li><li> 만약 텍스트 내가s는 자원 봉사가 그 / 그녀의 안녕을 보장하기 위해 연락을드립니다 오후 2시받은 수 없습니다. 그 / 그녀가 응답하지 않는 경우, 동족의 할당 다음은 자원 봉사자의 안녕을 보장하기 위해 연락을드립니다. </li><li> 자원 봉사자는 모든 약속을에있는 모든 상부 호흡기 증상을보고하여 주시기 바랍니다. 임상 직원은 그 / 그녀의 증상을 설명하기 위해 자원을 요청하고 불만을 따를 것이다. </li><li> 자원 봉사자에게 항생제는 세 상황에서주의 할 만이다;들은 월경이며 또한 연구의 끝에서 pneumococcus을 들고하거나 몸이 편치 않은 경우하는 경우, 연구 팀에 의해 그들에게 알려야하는 경우에 및 연구 팀에 문의 할 수 없습니다. 자원은 연구 기간 동안 항상 그들과 응급 팩을 유지하도록 권장되고 다음 7 일 동안 매일 연구 팀에 문의를 요청합니다. </li><li> 우리 팀은 호의 운동 시간 동안 간호사 연락처와 7분의 24 사용할 수 있습니다 두 의사 가능우르스. 모든 검색어는 전화 통화 및 / 또는 즉시 검토하여 처리하고 있습니다. 필요한 경우 조항은 전염병 병동에 즉시, 직접 입학이 가능합니다. </li></ol> 6. 코 워시 (NW) 절차 <ol><li> 코 세차 (NW)는 초기 심사 방문뿐만 아니라, 48 시간, 7, 14 일 이후의 접종에서 수행됩니다. 사용 NW 방법이 Naclerio 외에서 가져옵니다. 8 자원 봉사자 자연스럽게 S.에 의해 식민지 pneumoniae는 접종 대상에서 제외하고 추후 있습니다. </li><li> 자원 봉사은 편안하게 장착되고 머리는 수직에서 다시 30 °를 기울입니다. </li><li> 에서 숨을 깊이 가지고 입의 지붕에 대해 거꾸로 자신의 혀를 밀어하고하면서 숨을 보유하는 자원 봉사를 물어보십시오. 이 위치에서하는 동안, 자원 봉사자들은 준비가되었다는 신호를하도록 요청하고 있습니다. </li><li> 20 ML의 식염수에 가득 찬 주사기는 앞 코 공간에 삽입되어 염분의 5 ML 퇴학입니다. volunteeR은 다음 즉시 앞으로 포수와 호일 그릇에 자신의 코를 통해 빠르게 exhaling하여 유체를 퇴학 시켜도. </li><li> 이 절차 때마다 naris가 두 번 세척되어 전체 20 ML을 사용했습니다 있도록 3 번 반복합니다. </li><li> 원심 분리기 튜브에 함께 풀 모든 샘플을 및 처리를 위해 실온에서 실험실로 보내 주시기 바랍니다. </li></ol> 7. 코 워시 처리 <ol><li> 3345 X g에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기. </li><li> -80에서 표시 Eppendorf 튜브 1 ML aliquots로 표면에 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. </li><li> 펠렛에 미디어 9 STGG 100 μl를 추가하고 철저하게 섞는다. 이 시점에서 관 전체 볼륨이 결정되어 있는지 확인합니다. 이 희석은 운송 긍정적 인 NW의 CFU을 계산에 사용됩니다. </li><li> 판 gentamicin과 탄력 전체 플레이트를 포함하는 혈액 한천 플레이트에 resuspended 펠릿을 포함 STGG의 20 μl 드롭합니다. <ol><li> NW는 이후 접종하는 경우, resuspended 펠렛 및 M &amp; M 방식으로 세균 정량화의 사용을 포함하는 STGG에서 10 μl를 제거합니다. </li></ol></li><li> NW 튜브에 STGG의 또 다른 800 μl를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 전체 판을 좋겠어 혈액 한천 플레이트와 초콜릿 한천 플레이트로 25 μl로 판 25 μl. </li><li> -80에서 2 cryovials 및 매장에 매체를 STGG 일시 중지 나머지 금액 박테리아를 나누어 ° C. </li><li> 5% CO 2 ° C 야간 37 접시를 품다. </li><li> 접시에게 pneumococcus 및 기타 잠재적 인 호흡기 병원균의 다음 날을 검사합니다. </li><li> Pneumococci는 식민지의 형태가 접시에 식별됩니다. 기초의 형태와 알파 haemolytic 식민지는 optochin 디스크와 혈액 한천에 하위 교양하고 하룻밤 incubated. </li><li> optochin 문자를 구분 추정 폐렴 식민지는 그램 그램 긍정적 인 diplococci을 확인하기 물들과 Statens 세럼 문화원 Pneu를 사용 serotyped 아르motest - 라텍스 키트. </li></ol>

<ol><li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li>
<li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li>
<li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

EHPC 플랫폼은 점막 백신 모델과 소설 단백질 백신을 테스트하기위한 보호 대리로 사용하는 등 잠재적 인 용도 수 있습니다. 방법은 일관성 접종 기술과 고품질의 NW에 따라 달라집니다. 재현성은 inoculum에 문제가 될 수 있습니다. 냉동 세균 aliquots의 변수 특성 때문에, 그것은 원하는 용량을 복제 할 어려울 수 있습니다. 원하는 용량의 반턱이나 복제는 범위 내에서 간주됩니다. 이 박테리아 정량화가 정확하게 CFU 수에 의해 박테리아의 정량화를 결정하기 위해 접종 바로 이전 및 다음 수행 할 수 있다는 매우 중요합니다. 자원 봉사 약속이 발생하는 경우 이러한 이유로 단 한 inoculum가 준비 사전 접종과 그 후에 진행 정량화 도금이 떨어져 더 이상 30 분 발생 될 필요하는 동시에 매우 도움이 될 수 있습니다. NW 방법은 coope가 필요합니다자원 봉사 및 배급은 어린이의 이상적인 방법은되지 않습니다. 수율이 덜 5 ML 경우, 절차는 별도의 20 ML까지 사용 반복 할 수 있습니다. 착용 틀니는 NW 수율을 줄일 수 있습니다. 자원 봉사자가 차단 / 혼잡 코를 가지고 있으며 생리가 삽입 후 anteriorly에서 실행중인 경우, 코를 풀다, 다시 조금 더 주사기를 삽입하고, 다시 더 필요한 경우 머리를 기울이십시오. NW는 연습을 더 좋아 지기만하는 기법이다. 목적은 최소 10 ML의 반환하도록 일부 볼륨은 일반적으로 손실됩니다. 지원자는 NW 동안 생리를 맛볼 수 있다면 뒤 nasopharynx와 oropharynx 사이의 연결이 적절하게 자원 봉사의 혀에 의해 폐쇄되지 않았습니다. 지원자는 제비 생리의 대부분을 경우, 입의 지붕에 대한 혀의 밀어를 강조 다시 절차를 설명합니다. 그런 다음 볼륨이 반환 증가의 절차를 반복합니다. NW는 substant가 포함 된 경우점액의 ial 양, 그것은 원심 분리 전에 제거하는 것이 가장 좋습니다. 소용돌이 점액에 바인딩 가능한 약간의 염분으로 제거하는 동안 다음 가능한 큰 조각을 제거 할 수 있습니다 아무것도 느슨하게을 줄 수있는만큼의 샘플. 미국의 이전 EHPC 연구가 안전하게 완료되며 불리한 이벤트 11이 없었다. EHPC 플랫폼의 지속적인 안전을 보장하기 위해, 우리는 연구 팀 24 시간 액세스를 기반으로하는 비상 프로토콜을 설정합니다. 자원 봉사자들이 하루의 연구 팀에 24 시간 액세스 할 수 있도록, 연락처 세부 정보를 제공하고 있습니다. 필요한 모든 의료은 로얄 리버풀 대학 병원에 제공됩니다. 보호의 추가 조치로서, 임상 및 연구 그룹 외부에서 과학자로 구성된 안전위원회는 주간 안전 보고서를받습니다. 이 보고서는 각 자원 봉사자가 접수 및 증상이나 질병이보고되었는지 여부를 세균 복용이 포함되어 있습니다. 이 보고서는 일의 안전을 할 수 있습니다전자 연구는 외부 바이어스없이 critiqued 할 수 있습니다. 안전위원회는 또한 비상 사태의 가능성이 행사에서 24 시간 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 고양이 # </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0.9 %의 나트륨 염화물 </td><td> B. 브라운 </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> 분유 탈지 </td><td> Fluka </td><td> 70,166 </td></tr><tr><td> Tryptone 콩 국물 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> chocolated 말 피와 컬럼비아 한천 </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest - 라텍스 키트 </td><td> Statens 세럼 문화원 </td><td> 51,823 </td></tr></tbody></table>

실험 인간 폐렴의 운송

Experimental Human Pneumococcal Carriage

연쇄상 구균 pneumoniae의 nasopharyngeal 운송은 전송의 주요 소스 및 침입 질병의 전제 조건을 모두이기 때문에 실험 인간 폐렴 운송 (EHPC)은 과학적으로 중요합니다. 운송 모델은 보호 면역 상관 관계의 정확한 결정, 운송 immunizing 효과 nasopharyngeal 틈새에있는 병원균에 대한 호스트 압력의 영향을 수 있습니다. 또한, 백신 연구 등의 역학 연구에 유용한 운송 검출의 방법은, 비교할 수 있습니다. 목적 우리는 백신 유도 면역의 대리로 캐리지의 예방과 다운 선택 후보 소설 폐렴 백신에 사용될 수있는 안전하고 유용한 재현 방법입니다 EHPC 플랫폼을 개발하는 것을 목표로하고 있습니다. 이 EHPC와 carria에서 백신 보호의 근간이 메커니즘 후보 백신 및 설명 시험으로 작동합니다GE 1. 새로운 백신이 현재 백신이 아닌 bacteraemic 폐렴에 대한 최적의 보호를 부여하지 않는 한 긴급 필요 및 비 백신 serotypes 2-4로 혈청 형 교체의 증거가되었지만 pneumococcus에 대한 현재 켤레 백신은 침략 질병의 어린이를 보호합니다. 방법 우리는 S.와 예방 pneumoniae는 생리 100 μl에 일시 중지되었습니다. 안전 EHPC 모델의 개발에 중요한 요소이며 집중적 인 자원 봉사 검사 및 모니터링을 통해 달성된다. 임상 및 연구에서 독립적 과학자들로 구성된 안전위원회는 주 단위로 목표 피드백을 제공합니다. 세균 inoculum은 표준화되어 있으며 동물 제품은 자원 봉사자 (야채 기반 미디어 및 생리)에 주사하지 않습니다 필요합니다. 식민 (10 4 -10 5)에 필요한 복용이 훨씬 낮은 THA 아르N 그이 (10 7) 동물 모델에 5를 사용했습니다. 폐렴 운송을 검출하는 것은 무료로 상대적으로 점액이 코 세척은 (이상적으로&gt; 10 ML) 높은 볼륨에 의해 향상됩니다. 이 프로토콜은 차례 프로토콜의 가장 중요한 부분을 처리합니다. 이는 (a) 자원 봉사 선택, (B) 폐렴 inoculum 준비, (C) 접종 (D) 후속과 (E) 운송 감지합니다. 결과 현재 프로토콜은 두 개의 서로 다른 박테리아 serotypes 6을 사용하여 복용의 범위에서 100여 자원 봉사자에 안전했습니다. S.를 사용하여 용량 범위 연구 pneumoniae 6B와 23F는 현재 50 %의 운송을위한 최적의 접종 선량을 결정하기 위해 실시되고있다. 운송 예측 50 % 속도가 EHPC 모델은 작은 연구 번호가 백신 효능에 대한 높은 감도를 가지고 할 수 있습니다.

우리는 경험으로는, 35 pneumococcus를 탑재 한 중 1백59명을 inoculating 있습니다. 우리는 혈청 형 6B를 사용하여 운송을 달성 낮은 복용량은 최고 투여 량을 naris 당 313,000 CFU/100 μl이었고, naris 당 11,100 CFU/100 μl이었다. 우리는 혈청 형의 23F를 사용하여 운송을 달성 낮은 복용량은 최고 투여 량을 naris 당 84,500 CFU/100 μl이었고, naris 당 9,000 CFU/100 μl이었다. 운송 평가의 우리의 방법은 최근 연구 10 자원 봉사자의 91 %가 nasopharyngeal 면봉보다 더 편안하게 코 세척을 발견했다 때문에 선택한 코 세척입니다, 코 세척은 미생물 문화를 사용하여 병원균을 감지 할 가능성이 더 높습니다했다. NW로 주사 혈액 한천 플레이트에 복구 미생물 식물 읽기 변수 어려울 수 있습니다. Gentamicin는 pneumococcus에 대한 선택하려면 첫 번째 혈액 한천 플레이트에 사용됩니다. 초콜릿 한천 플레이트와 두 번째 혈액 한천 플레이트는 다른 잠재적 인 호흡기 경로를 검색하는 데 사용됩니다폐렴 식민지를 돕거나 방해 할 수 있습니다 ogens. 읽기 쉬운 NW와 주사 혈액 한천 플레이트의 예는 그림 1a에 표시되어, 식물의 다양한 종류를 포함하는 어려운 판은 그림 1b에 표시됩니다. 모든 일정 자원 봉사자에있는 상부 호흡기 증상을 설명하도록 요청되었다있는 경우, 그리고 통신 사업자 및 비 사업자 사이의 비교는 강조했다. 최근 pneumococcus과 주사 1백45명 중 28 증상 (표 1)의 불평을했다. 이 중 여덟 통신 사업자, 스무은 안했습니다. 가장 일반적인 증상은 비 특정 코 증상 (표 1)이었다. 발열 및 / 또는 불쾌 등의 전신 증상을가보고 된의 사건, 실시 조사 중 어느 것도 폐렴 질환 및 증상의 증거가 편도선염 중 하나 경우를 제외하고 동시 바이러스 감염과 일치했다 보여 주었다 없습니다. 두 폐렴 positiv전자 자원 봉사자는 항생제로 치료했다. 하나는 목이와 귀 통증을 호소하고, 연구 담당 의사와 만나고 후, 사전 예방 차원에서 항생제를하는 것이 좋습니다되었습니다. 다른 자원은 편도선염과 임상 진단했다. 모든 자원 봉사자 증상의 빠른 해결했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> 1 그림. 혈액 한천 플레이트는 NW에 주사. NW와 주사 혈액 한천 플레이트를 읽기 어려울 수 있습니다. 1a를 명확하게 볼 수 pneumococci과 읽기 쉬운 접시의 예입니다. 1B가 더 만들어 공동 colonizing 식물이 많은 접시입니다 pneumococci가있는 경우 감지 할 어렵다. <table border="1"><tbody><tr><td> 조짐 </td><td></td><td> 운송 (N = 32) </td><td> 어떤 운송 없음 (N = 112) </td></tr><tr><td> 모든조짐 </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> 조직 </td><td> 열 </td><td> 3퍼센트 </td><td> 4퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td> 불쾌의 * </td><td> 9퍼센트 </td><td> 4퍼센트 </td></tr><tr><td> 지방의 </td><td> 귀를 </td><td> 9퍼센트 </td><td> 3퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td> 코 </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> 목 </td><td> 12% </td><td> 3퍼센트 </td></tr></tbody></table> 표 1. 자원 봉사의 특성은 S. 다음과 같은 현상이보고 pneumoniae 6B 접종. 모든 불만이 전체 조사에 따라, 외부 안전위원회에 의해 검토되었고이 증상은 폐렴 질환에 기인 없습니다. 가장 일반적인 증상은 목이 있었다 코와 독감과 같은 질병을 박제.

실험 인간 폐렴 운송은 운송 자연 모델과 백신 개발에 사용할 수있는 잠재적 인 모델을 제공합니다. 이 기술은 가치가 아직 복잡하고 인간에 병원균을 도입하여 임상 위험을 가지고 있습니다. 우리는 자세한 프로토콜을 개발했습니다.

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

이 절차의 목적은 실험적인 인간 폐렴구균 보균을 확립하는 것입니다. 이것은 먼저 접종물에서 박테리아를 희석하고 정량화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 지원자가 폐렴 연쇄상구균을 비강 내 접종합니다.다음으로, 지원자는 접종 후 2일, 7일, 14일에 코를 씻습니다. 마지막으로, 고전적 미생물학을 사용하여 지원자가 접종된 점유를 운반하고 있는지 확인합니다. 궁극적으로, 이 안전하고 재현 가능한 방법을 사용하여 실험적인 인간 폐렴구균 보균을 얻을 수 있습니다.기존 쥐 운반 모델에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 폐렴구균의 자연 숙주인 인간에서의 운반 모델을 제공한다는 것입니다. 또한, 이 방법은 폐렴구균 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 보균의 면역 효과는 무엇이며, 비인두 틈새의 병원체에 대한 숙주 압력의 영향은 무엇입니까?이 기술의 응용 분야에는 새로운 폐렴구균 백신을 선별하는 방법으로의 사용이 포함됩니다. 우리는 백신으로 인한 면역의 대용품으로 운송 방지를 사용할 계획입니다. 임상 기법을 시연하는 사람은 앤지 라이트 수녀와 담당 간호사 데이비드 쇼가 맡을 것입니다.예정된 자원봉사 접종 약속 30분 전에 영하 80도의 냉동고에서 접종 스톡 튜브를 채취합니다. 그런 다음 마이크로 원심 분리기에서 17, 000 회에 3 분 동안 접종물을 회전시킵니다. G, 튜브가 회전하는 동안 섭씨 37도의 인큐베이터에서 혈액 한천 플레이트를 따뜻하게 합니다.그런 다음 원심분리기 접종물에서 육수 세이트를 제거하고 펠릿을 1밀리리터의 식염수로 세척합니다. 원심분리 및 세척 단계를 반복합니다. 원하는 접종물 농도에 대한 희석 설정을 수행한 다음 마일 및 미스라와 같은 방법으로 접종물에 있는 박테리아의 양을 정량화합니다.성장한 군체는 다음 날부터 볼 수 있습니다. 반쯤 누운 자세로 편안하게 앉아야 하는 자원자에게 접종물을 가져갑니다. 그런 다음 P 200 퍼프 및 제균 필터 팁을 사용합니다.퍼프 팁에 100마이크로리터의 접종물을 뽑고 팁을 비강 바로 안쪽에 삽입합니다. 원을 그리며 코 점막으로 접종물을 천천히 배출합니다. 피펫 팁을 너무 뒤쪽에 놓지 마십시오. 그렇지 않으면 접종물이 목구멍으로 흘러 들어갈 수 있습니다.박테리아가 혈류로 들어가는 것을 방지하기 위해 다른 나리스에 대해서도 접종을 반복합니다. 피펫으로 점막을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 지원자가 박테리아가 점막을 가로질러 분산될 수 있도록 10분 동안 반쯤 누운 자세를 유지하게 합니다.지원자에게 접종물을 투여한 후 실험실에서 박테리아 정량화를 반복합니다. 그런 다음 튜브에 날짜와 접종 용량을 표시하고 접종물을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 코 세척을 시작하기 전에 지원자가 머리를 수직에서 30도 뒤로 기울이고 편안하게 앉도록 합니다.그런 다음 지원자가 심호흡을 하고 숨을 참으면서 혀를 입천장에 대고 위아래로 밀어 넣게 합니다. 이 위치에 도달했을 때 자원봉사자가 신호를 보내도록 합니다. 이제 20ml의 식염수로 비강을 4번 세척하고 한 번에 5ml의 식염수를 앞쪽 비강 공간으로 배출합니다.지원자가 즉시 몸을 앞으로 숙이고 코를 통해 호일 그릇에 빠르게 숨을 내쉬어 액체를 배출하도록 합니다. 각 5ml의 식염수 세척 후. 20ml 4개로 비강을 세척한 후 수집된 모든 샘플을 원심분리기 튜브에 함께 넣습니다. 이제 자원 봉사 비강 세척 샘플을 3, 345 회 G.Remove에서 10 분 동안 원심 분리하고 섭씨 영하 80 도의 라벨이 붙은 einor 튜브에 1 밀리리터 분취량으로 보관하십시오.펠릿에 100마이크로리터의 STGG 배지를 추가하고 철저히 혼합한 다음 튜브의 총 부피를 결정합니다. 다음 플레이트, 재현탁된 펠릿을 겐타마이신이 함유된 혈액 한천 플레이트에 20마이크로리터 떨어뜨리고 전체 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 접종 후 비강 세척이 이루어지는 경우 재현탁된 펠릿이 포함된 STGG 10마이크로리터를 사용합니다.Miles and Misra 방법에 의한 박테리아 정량화의 경우, 비강 세척 튜브에 800마이크로리터의 STGG를 더 넣고 철저히 혼합합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 STGG 박테리아 세포 용액을 다른 혈액 한천 플레이트에 플레이트하고 25마이크로리터를 초콜릿 한천 플레이트에 플레이트하여 두 플레이트 전체에 줄무늬를 만듭니다. 그런 다음 나머지 박테리아를 섭씨 영하 80도에서 두 개의 극저온 바이알에 동결합니다.섭씨 37도의 플레이트를 5%의 이산화탄소에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트에 폐렴구균 및 기타 잠재적인 호흡기 병원체가 있는지 검사합니다. 비강 세척제가 접종된 혈액 한천 플레이트는 판독하기 어려울 수 있습니다.이 이미지는 폐렴구균이 명확하게 보이는 읽기 쉬운 플레이트의 예를 보여줍니다. 그러나 이 플레이트에는 많은 공동 집락 세균총이 포함되어 있어 모든 진료에 폐렴구균이 존재하는지 확인하기가 더 어렵습니다. 자원자들은 상기도 증상이 있는 경우 설명하도록 요청받았고, 보균자와 비보균자 간의 비교를 강조했습니다.최근에 폐렴구균을 접종한 145명 중 28명이 이 표에 요약된 증상을 호소했습니다. 이 지원자 중 8명은 보균자였고 20명은 보균자가 아니었습니다. 모든 불만 사항은 외부 안전 위원회에서 검토하고 완전한 조사를 거쳤습니다.폐렴구균 질환으로 인한 증상은 없었다. 가장 흔한 증상은 인후통, 코막힘, 독감과 유사한 질병이었습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 특히 자원봉사자의 안전을 위해 방법의 모든 단계를 다루는 매우 철저한 안전 계획을 수립하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 실험적인 인간 폐렴구균 보균을 확립하고 비강 세척을 사용하여 보균을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Jagau, H. et al. 일정한 흐름의 원발성 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 일정한 배지 흐름 조건에서 내피 세포의 VWF(Von Willebrand Factor) 스트링에 대한 폐렴구균 부착의 실시간 시각화를 보여줍니다. VWF 방출을 자극하고, 문자열에 라벨을 붙이고, 박테리아 결합을 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

일정한 배지 흐름 하에서 일차 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 부착 평가

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

면역 능력이 있는 설치류에서 폐 감염을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 숙련되면 이 방법을 빠르고 쉽게 수행하여 S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae 및 A. baumannii의 많은 분리물에서 안정적인 감염을 유도할 수 있습니다.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

여기에서 우리는 DNA와 자살 플라스미드를 자연적으로 획득하는 능력을 사용하여 유전자 변형될 수 있는 S. pneumoniae 혈청형 1 균주 519/43에 대해 설명합니다. 원리의 증거로서, pneumolysin (ply) 유전자의 동종 돌연변이가 만들어졌다.

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

이 문서는 인간의 암 세포 라인의 전이성 잠재력을 결정하는 데 사용되는 실험적인 전이 분석의 절차를 설명합니다.

실험 전이 분석

학습하세요 실험적 인간 폐렴구균 보균 모델 수립 방법을 Streptococcus pneumoniae 비강 내 접종과 비강 세척을 통해. 이 기술은 백신 개발 및 면역 보호 상관관계 연구에 활용됩니다.

실험 인간 폐렴의 운송

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