Name: Biomacromolecular 일반 의약품의 Cytosolic 전송 산도 - 응답 Endosomolytic 에이전트의 평가에 대한 예 VIVO 레드 블러드 세포 용혈 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 학습하세요 약물 전달 벡터의 막 파괴 능력을 정량적으로 평가하는 적혈구 용혈 분석법을 통해 세포질 내 약물 전달 효율성을 측정하는 방법을. 이 기술은 약물 전달 시스템의 세포 적합성과 엔도솜 용해 활성을 평가하는 데 활용됩니다.

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저자는 국방부를 통해 Congressionally 감독 의학 연구 프로그램 (# W81XWH-10-1-0445), 보건 국립 연구소 (NIH R21 HL110056)와 미국 심장 협회 (# 11SDG4890030)를 자금을 인정합니다.

1. 버퍼 및 시험 에이전트의 작성 및 살균 <ol><li> 150 MM NaCl 버퍼 : nanopure 물 500 ML에 4.383 g NaCl의 결정을 디졸브. </li><li> 산도 버퍼 : 일 염기의 및 이염 기성의 인산 나트륨의 적절한 양을 혼합하여 pH를 5.6, 6.2, 6.8 및 7.4에서 인산염 버퍼를 준비합니다. 샘플 등 구연산 버퍼로 다음 낮은 산도 값 (즉, 산도가 &lt;5.6) 더 적절한 버퍼에서 테스트 할 경우 사용되어야합니다. 버퍼 요리법은 쉽게 이용하실 수 있으며, 예를 들어 참조는 여기에서 제공되었습니다. 12 </li><li> 병 꼭대기에 진공 여과 장치를 다시 확인 버퍼 산도의를 통해 위에서 언급 한 모든 버퍼를 검사. </li><li> 20% 트리톤 X-100 (긍정적 제어) : 믹스 20 ML 순수 튼 nanopure 물 80 ML의 X-100. 힘차게 소용돌이과 분해하는 sonicate. 사용하기 전에 하룻밤 실온에서 둡니다. </li></ol> 2. 적혈구의 작성 <ol><li> 혈액 FR의 25 ML을 확보응고를 방지하기 K 2 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 코팅 Vacutainer 튜브에 직접 그려 톰 익명의 인간 공여체. </li></ol> 참고 : 모든 절차는 해당 기관 검토위원회 (IRB) 및 venipuncture, 혈액 수집하여 사전 승인을 받아야합니다는 기증자에게 위험을 최소화하기 위해 훈련 phlebotomist가 수행해야합니다. 표준 정맥 절개 절차는 다른 출판되었습니다. 13 <ol start="2"><li> 5 분, 그리고 혈소판의 마크 수준 (빨강, 낮은 층) 및 플라즈마 (노란색, 상부 층) 관에 500 XG에서 혈액을 원심 분리기. </li><li> micropipettor을 통해 부드럽게 플라즈마를 대기음, 표백제로 추가 biohazardous 폐기물로 폐기하십시오. </li><li> 150 MM NaCl 용액으로 표시된 선 (플라즈마의 원래 수준)에 혈소판 관을 입력합니다. 모자와 부드럽게 혼합 할 수있는 몇 번 반전. 5 분 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 다시 혈액 세포를 씻어 단계 2.3-2.4를 반복합니다. 그런 다음 supernat를 대기음개미와 산도 7.4에서 PBS로 교체하십시오. 혼합하는 반전. </li><li> 테스트 할 각 산도에 해당하는, 균일하게 사 튜브에 혈액을 분할. 테스트 할 각 산도 (5.6, 6.2, 6.8, 7.4)에 따라 튜브를 붙입니다. </li><li> 5 분 500 XG에서 혈액 튜브를 원심 분리기. 튜브의 레벨을 표시 한 후 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 적절한 산도 (로 2.6에 표시된)의 버퍼로 표시 줄에 각 관을 입력합니다. </li><li> 라벨 네 50 ML 원뿔 튜브 (테스트에 산도를 하나씩), 각 원추형 튜브에 적절한 산도의 PBS의 pipet 49 ML. </li><li> 1시 50분 희석에 해당하는 관으로​​ 적혈구 (동일 PH) 1 ML을 추가합니다. 시각 흐린해야하며 방해받지 왼쪽하면 해결됩니다 희석 혈액을 검사한다. 더 펠렛 형태 경우, 세포는 lysed 있습니다. </li></ol> 3. 용해 분석 96 자 판 설치 및 정량화 <ol><li> 테스트 할 20x 원하는 최종 농도에서 모든 실험 약물 투여 요원 재고 솔루션을 준비 (검정약물 전달 에이전트의 10 μl + 최종 테스트 혼합물로 원래의 약물 전달 에이전트 20분의 1 희석으로 이어지는 190 μl 희석 적혈구를)됩니다. 20, 100, 및 800 μg / ML의 주식은 각각 1, 5, 40 μg / ML의 최종 테스트 농도의 결과로, 제안합니다. </li><li> V-하단에 각각의 재고 솔루션 96 - 웰 플레이트의 Pipet 10 μl. 최적의 결과를 얻으려면, 세중의 각 샘플을로드하거나 겹. </li></ol> 참고 : 쉽게, 그것은 별도의 96 - 웰 플레이트가 판 당 N에서 = 3-4로드 (각 농도에서) 각 샘플과 함께 테스트 할 각 산도를 준비해야하는 것이 좋습니다. <ol start="3"><li> 긍정적 인 제어 우물를 들어, 20 % 트리톤 X-100의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 부정적인 제어 우물를 들어, 인산염 버퍼 10 μl를 추가합니다. 테스트 할 같은 산도에서 버퍼를 사용합니다. </li><li> 희석 적혈구의 Pipet 190 μl 각 우물 (2.10 참조), 남아 있는지 셀 재고 솔루션을전송 중에 균일. 힌트 :이 작업을 단순화하는 데 사용하는 멀티 채널 피펫. </li><li> 1 시간 (: 궤도 셰이커 또는 로커를 사용하여 선택 사항)을 37 ° C에서 접시를 품다. </li><li> 500 펠렛 그대로 적혈구에 XG에서 5 분에 대한 번호판을 원심 분리기. 참고 : 원심 분리기에서 판을 제거하고 다음 단계로 수송 할 때주의 처리하고 세포 펠렛을 방해하지 확신 할 수. </li><li> 멀티 채널 pipet 사용하여 깨끗하고 평평한 바닥 96 - 웰 플레이트에 각 우물에서 표면에 뜨는 100 μl를 전송합니다. 참고 : 셀 펠렛가 실수로 어떤 샘플 (들)에 대한 방해를하는 경우, 하나는 표면에 뜨는 이전이 진행 다음 판을 다시 원심 분리기 수 있습니다. </li><li> 플레이트 리더로 ​​supernatants의 흡광도를 측정합니다. 파장의 범위가 (- 541 nm의 400)로 사용할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 다른 판 독자들이 다른 채도 포인트와 민감한있을 수 있습니다, 그래서 나를 위해 파장의 선택asurements는 세제 치료에 의해 유도로 실험 샘플의 용혈 데이터를 안정적으로 최대 용혈에 대한 표준화 할 수 있는지 여부에 따라 달라집니다. 이 긍정적 인 컨트롤 샘플의 흡광도 값의 정확한 측정이 필요합니다. <ol start="10"><li> Microsoft Excel 또는 이와 유사한 데이터 분석 소프트웨어를 사용, 각 산도 (단계 3.4)에 대한 설정 대조군 샘플에서 배경 흡광도 판독의 평균을 찾습니다. 그 산도에서 측정 된 모든 다른 샘플에서이 배경 흡광도 값을 뺍니다. </li><li> 배경 제거 후, ​​긍정적 인 컨트롤의 평균 흡광도 세제 - 처리 샘플을 (단계 3.3)을 찾습니다. 그런 다음 100 % 용혈을 대표해야하는이 평균 흡광도 값으로 모든 실험 데이터 포인트를 정상화. 마지막으로, 세제 컨트롤도 상대적으로 각 개별에서 발생 %의 용혈을 계산하는 100 % 각각 잘 값을 곱합니다. </li></ol>

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</ol>

IRB 승인 : 인간의 과목을 포함하는 절차는 밴더빌트 대학 기관 심사위원회 (IRB, 프로토콜 # 111251)에 의해 승인되었습니다. 관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

endosomolytic 기능을 위해 설계 산도 - 응답 고분자 또는 다른 요원이 신속하게 될 효과적으로 endosome에서 발생 산도 값의 붉은 혈액 세포의 용해 (그림 1을 기준으로 검사를 할 수 있습니다, 산도 6.8 - 초기 endosome, 산도 6.2 - 늦은 endosome, pH를 5.6 - lysosome). 14-17 산도에 따라 달라 용혈은 biomacromolecular의 치료학 (예 : 펩티드, siRNA, ODNs, 단백질)의 endosomal 버전을 중재 할 사업자의 능력을 상영하는 데 사용되어,이 분석의 결과는 세포와 같은 성능을 예측 할 수 있습니다 약물 투여 차량. 따라서 3,4,8,18,19,이 분석은 산도에 따라 달라 막 방해를 기반으로 세포 내 약물 전달을 중재 할 고분자 약물 캐리어의 능력을 측정하는 효과적인 화면을 나타냅니다. 절차에 명시된 바와 같이...

세포 내부에 많은 잠재적 영향력이 치료 대상이 있지만, 대리인의 세포 내 전달에 중요한 도전을 안겨주고 있습니다. 자주, 약물, 특히 biologics는 exocytosis를 통해 세포에 의해 internalized와 소포로 인신 매매 중 엔도-lysosomal 경로를 통해 내용의 저하로 연결, 또는 세포의 뒤쪽 shuttled 아르 수 있습니다. 후자의 과정에서 1 내부 pH는 소포의 효소의 활동을위한 최적의 산도입니다 약 5-6로 산성화되는 등 라이소자임 등이 칸에서 기능 2. 최근 자료 수는 특별히이 산성화가 자신의화물 cytosolic 전달을 촉진하기 endosomes 활용하여 설계되었습니다. 이 방법의 한 예는 그의 핵심 physiologic pH를 (예 : 7.4)에서 zwitterionic 및 충전 중립입니다 합성, 고분자 마이셀의 나노 입자를 사용합니다. 그러나, 산도 6.0에서- 6.5, 고분자는 protonated이되고 마이셀 코어를 destabilizes 그물 긍정적 인 요금을 습득하고, 노출 된 폴리머 세그먼트과 상호 작용할 수 있으며 endosomal 멤브레인을 방해. 이 활동은 그들의 cytosolic 목표에 액세스 할 수 있습니다 펩타이드 및 핵산 기반 치료학의 endosomal 탈출을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 막 장벽을 방해 endosomal 탈출을 중재하기 위해 개발 방법의 3,4 다른 예는 또는 &#39;fusogenic&#39;펩티드를 포함 인지질 이중층에 막 융합 또는 과도 기공 형성을 중재 할 수 있습니다 단백질이. 같은 폴리 (propylacrylic 산)와 같은 음이온 알킬 아크릴 산의 5 Homopolymers 또 다른 잘 공부 접근 방법이며, 이러한 고분자에 펜던트 카르 복실 산의 protonation 상태를 전환 해주는 엔도-lysosomal 산도 범위에서 소수성으로, 막 중단 상태입니다. 6,7 endosomolytic 행동을 검사에 대해 하나의 유용한 모델 시스템은 전자입니다X 생체의 산도에 의존 용혈 분석 8.이 모델 시스템에서, 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 이 generalizable 모델이 세포 관통 펩티드 및 기타 고분자 유전자 전달 시스템의 endosomolytic 행동을 평가하는 다른 사용되었습니다. 8-11이 실험에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 모방 정의 PHS에서 버퍼에 공동 incubated 아르 세포 (7.4), 초 (6.8) endosomal, 그리고 엔도-lysosomal 하순 (&lt;6.8) 환경. 부화 기간 동안 출시 된 헤모글로빈의 양이 세제로 lysed 긍정적 인 제어 샘플에 출시 헤모글로빈의 양에 표준화되어 적혈구 용해의 측정으로 정량화되어 있습니다. 잠재적 endosomolytic 시험 자료의 작은 도서관을 심사에서, 하나는 산도 7.4에서 더 용혈을 생산하지 그 샘플을 추론하지만, 상당히 고농도의 헛기침 수산도 &lt;6.5에서 olysis은 cytosolic 약물 전달을위한 가장 효과적이고 cytocompatible 후보 될 것입니다. 이 기준에 맞는 자료를 무차별 엔도-lysosomal 구획에 국제화에 따라 지역의 pH의 감소에 노출되는 때까지 지질 이중층의 세포막 (세포 독성을 일으킬 수 IE)를 파괴 불활성이 아닌 상태로 유지 될 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜에서는 적혈구는 인간의 기증자로부터 분리되며, 산도 5.6, 6.2, 6.8, 또는 실험 endosomolytic 약물 전달 에이전트와 7.4에서 공동 incubated. 그대로 적혈구는 pelleted 있으며, supernatants은 (lysed 적혈구에서 출시 헤모글로빈을 포함) 플레이트 리더 (그림 1)를 통해 헤모글로빈의 특성 흡광도를 분석하고 있습니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-253-145 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer 혈액 수집 바늘, 20.5 게이지 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-665-31 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer 튜브 홀더 / 니들 어댑터 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-289-953 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD 브랜드 이소 프로필 알코올 스왑 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-680-63 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer 라텍스 무료 지혈대 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-657-6 </td><td> 혈액 수집을위한 </TD&gt; </tr><tr><td> 염산 (conc.) </td><td> 피셔 과학 </td><td> A144-500 </td><td> D-PBS의 산도 조정하십시오. </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T8787 </td><td> 긍정적 인 제어 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> SFCA 막과 Nalgene MF75 무균 일회용 병 - 상위 필터 단위 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-740 - 44A </td><td></td></tr><tr><td> BD 96 - 웰 플레이트, 평면 바닥, 조직 문화 처리 폴리스티렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772 - 2C </td><td> 분석의 끝에서 판 읽기하십시오. </td></tr><tr><td> BD 96 - 웰 플레이트, 둥근 바닥, 조직 문화 처리 폴리스티렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772-17 </td><td> 실험 대리인과 붉은 혈액 세포의 배양하십시오. </td></tr></표&gt;

biomacromolecular 일반 의약품의 cytosolic 전송 산도 - 응답 endosomolytic 에이전트의 평가에 대한 예 vivo 레드 블러드 세포 용혈 분석

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

엔도-lysosomal 소포를 구성 인지질의 bilayers은 세포 내 표적에 대한 생물학적 약물의 전달에 장벽을 야기 할 수 있습니다. 이 장벽을 극복하기 위해, 합성 약물 캐리어의 수는 적극적으로 endosomal 멤브레인을 방해하고 세포질로화물을 제공하도록 설계되었습니다. 여기, 우리는 세포 내 약물 전달 시스템의 cytocompatibility 및 endosomolytic 활동에 대한 신속하고 높은 처리량 화면으로 사용할 수있는 용혈 분석을 설명합니다. 용혈 분석에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 세포, 초기 endosomal, 늦은 엔도-lysosomal 환경을 모방 정의 PHS의 버퍼의 Co-incubated 수 있습니다. 펠렛 그대로 적혈구에 원심 분리 단계 후, 매체에 발표 헤모글로빈의 양이 spectrophotometrically (가장 동적 범위 405 nm의) 측정됩니다. %의 적혈구 장애는 이후 긍정적 인 제어 samp에 상대적으로 정량화된다레 세제로 lysed. 이 모델 시스템에서 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 원하는 결과는 physiologic pH를 (7.4) 약 산도 5-6.8에서 엔도-lysosomal 산도 범위에서 강력한 용혈에서 무시할 용혈 수 있습니다.

<html> 일반적으로 이상적인 산도에 의존 용혈성 문제가 발생할 요원이 마약, 핵산, 또는 다른 bioactive 분자의 cytosolic 제공을위한 최고의 잠재력을 갖추고 있습니다. 이것은 산도 7.4에서 최소한의 용혈을 전시하고 그림 2에 묘사로 에이전트 # 1 예시하지만, endosomal 산도 범위 (&lt;6.5)에서 용혈성 행동의 날카로운 증가하고 있습니다. 이러한 대리인이 hemocompatible되지 않을 수 있습니다 잠재적으로 이러한 농도에서 세포 독성이 될 수 있다고 제안; 일부 에이전트는 생리적 산도 범위 (그림 2 40 μg / ML에서 에이전트 # 2)에서 용혈성 행동의 상당 수준을 발생할 수 있습니다. 시험 물질의 농도 증가, 특히 (- 6.2 5.6) 테스트 낮은 pH의 범위에서 용혈 높은 수준의 대응으로 대부분의 경우, 용혈도 복용에 따라 달라지게된다. <p class="jove_...

용혈 분석은 세포 내화물 배달 약물 전달 시스템 &#39;cytocompatibility과 endosomolytic 활동의 빠른, 높은 처리량 화면으로 사용할 수 있습니다. 검정은 환경 산도의 함수로 적혈구 멤브레인의 중단을 측정합니다.

Biomacromolecular 일반 의약품의 Cytosolic 전송 산도 - 응답 Endosomolytic 에이전트의 평가에 대한 예 VIVO 레드 블러드 세포 용혈 분석

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

본 실험의 전반적인 목표는 적혈구를 엔도좀 막의 생물학적 모델로 사용하여, 바이오 의약품의 세포 내 전달을 위한 약물 전달 벡터의 막 파괴 가능성을 정량적으로 평가하는 것입니다. 이 영상은 밴더빌트 대학교의 첨단 치료제 연구실(Advanced Therapeutics Laboratory)에서 제작하였습니다. 인간 대상자와 관련된 모든 절차는 밴더빌트 대학교의 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.먼저 엔도좀(endosome), 용혈 및 용혈 작용에 대해 간략히 소개하겠습니다. 바이오 의약품의 운반체는 비특이적 또는 수용체 매개 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포 내 엔도좀으로 유입됩니다. 엔도사이토시스 이후에.화물은 리소좀에서 분해되거나 세포외 공간으로 다시 배출되기 위해 엑소사이토시스로 운반됩니다. 하지만 그림에서 보듯, 엔도솜 내의 pH 감소는 pH 반응성 약물 운반체에 의해 활용될 수 있으며, 이러한 운반체는 산성 환경에서 막 파괴 성질을 갖게 되어 엔도솜 막에 물리적인 구멍을 내거나 막을 불안정하게 만듭니다. 엔도솜이 파괴되면 약물 화물이 세포질로 방출되어 세포질, 미토콘드리아 또는 핵 내의 표적 위치로 확산될 수 있습니다. 본 분석법에서는 생리적 pH 조건에서 적혈구를 엔도솜 막의 모델로 사용합니다.이상적인 전달체는 안정성을 유지하며 적혈구 막을 파괴하지 않아야 합니다. 그러나 pH가 감소하면 전달체가 불안정해지며, 이로 인한 소수성 상호작용이 적혈구 막을 파괴하여 헤모글로빈을 방출시킵니다. 그 후 헤모글로빈을 적혈구로부터 분리하고 405, 450 또는 541 nanometers에서의 흡광도를 통해 분광광도법으로 정량할 수 있습니다.흡광도 값이 높을수록 더 강력한 내세포 용해(endom lytic) 거동과 상관관계가 있습니다. 이는 생리적 pH에서 타임랩스 현미경 관찰을 통해 시각화할 수 있습니다. 약물 운반체가 있는 상태에서 적혈구는 안정적으로 유지됩니다.하지만 엔도솜 경로의 특징인 낮은 pH에서는 전달체가 적혈구 막을 빠르게 파괴하고 손상시킵니다. 본 연구에 필요한 재료는 150 millimolar 염화나트륨으로, 500 milliliters의 탈이온수와 4.383 gram의 염화나트륨을 혼합한 후 병 상단 진공 여과 장치로 멸균 여과하여 준비하였습니다. pH 7.4, 6.8, 6.2 및 5.6의 인산염 완충 식염수 용액은 단일 및 이중 나트륨 인산염 완충액을 적절한 양으로 혼합한 후 병 상단 진공 여과 장치를 사용하여 멸균 여과하여 준비하였습니다.pH 미터 및 pH 시험지를 사용하여 pH를 모니터링하였으며, 측정의 정확성을 보장하기 위해 여러 방법을 사용하였습니다. 20% Triton X는 Triton X 100 20 milliliters를 nano pure water 80 milliliters에 녹인 후, 기관생명윤리위원회(IRB)의 승인을 받아 격렬하게 흔들고 초음파 처리하여 제조하였습니다. 연구 간호사 또는 채혈사가 응고 방지를 위해 익명의 기증자로부터 potassium EDTA 코팅 진공 용기에 전혈 25 milliliters를 채취하도록 하십시오.이 영상에서는 배큠테이너 어댑터에 연결된 20.5 gauge 채혈 바늘이 사용됩니다. 채취한 혈액은 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 혈장층과 적혈구층이 뚜렷하게 구분되어야 합니다.흔들어서 층이 섞이지 않도록 주의하십시오. 혈장 높이를 표시한 후, 마이크로 피펫이나 진공 흡입기로 조심스럽게 흡입하여 표백제에 버립니다. 표시된 선까지 150 millimolar sodium chloride로 혈장을 대체하여 채웁니다.바이알의 캡을 닫고 여러 번 뒤집어 가볍게 섞은 후, 500 G에서 5분 동안 두 번째 원심분리를 수행하고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 표시된 선까지 150 millimolar 염화나트륨으로 상층액을 대체하고 여러 번 뒤집어 가볍게 섞은 후, 500 G에서 5분 동안 세 번째 원심분리를 수행합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 pH 7.4의 PBS로 표시된 선까지 채웁니다.혈액 샘플을 4개의 튜브에 균등하게 나눕니다. 각각 생리적 pH인 7.4, 초기 엔도솜 pH인 6.8, 후기 엔도솜 pH인 6.2, 그리고 후기 엔도솜 또는 리소좀 pH인 5.8까지 테스트할 각 pH 조건에 맞게 배분합니다. 500 G에서 5분 동안 네 번째이자 마지막 원심분리를 수행합니다.상층액 수위를 표시한 뒤 조심스럽게 흡입하여 표백제에 버립니다. 상층액을 적절한 pH의 PBS로 교체합니다. 적혈구 최종 스톡은 스톡 용액을 적절한 pH의 완충액으로 50배 희석하여 제조합니다.본 사례에서는, 농축 적혈구 1 mL를 49 mL의 PBS에 첨가한 후 혈액 조제 전 바이알을 여러 번 부드럽게 뒤집어 적혈구를 혼합하였습니다. 전달체의 스탁 용액을 20배 농도로 준비합니다. 폴리머의 경우, 희석 후 최종 농도가 배양 시 105 및 40 µg/mL가 되도록 초기 테스트 농도를 2100 및 800 µg/mL로 설정할 것을 권장합니다. 원심분리를 통해 손상되지 않은 적혈구를 제거할 수 있도록 원추형 또는 라운드 바텀 플레이트를 사용하십시오. 각 웰에 20배 폴리머 용액 10 µL를 피펫으로 분주합니다.결과를 최적화하기 위해 시료를 최소 3회 또는 4회 반복 측정하는 것을 권장합니다. Triton X는 모든 세포를 용해시키므로 양성 대조군으로 사용할 수 있으며, pH 7.4의 1% PBS는 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 희석된 적혈구 190 µL를 각 웰에 분주하십시오. 적혈구 용액이 균질하게 유지되도록 하며, 세포가 부유 상태를 유지할 수 있도록 가볍게 흔들거나 혼합해야 할 수도 있습니다.적혈구를 첨가하면 매우 용혈성이 강한 화합물의 경우 이미 용혈이 시작되는 것이 보일 수 있습니다. 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 용혈이 일어나도록 합니다. 플레이트를 꺼내 500 G에서 원심분리하여 적혈구를 펠릿화합니다.그런 다음 상층액 100 µL를 평바닥 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 적혈구 펠렛이 흐트러지지 않게 하는 것이 중요하므로 주의해서 다루십시오. 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.헤모글로빈 농도가 너무 높아 흡광도 수치가 높게 나타나는 경우, 플레이트를 541 nanometer에서 측정할 수 있습니다. 반대로, 헤모글로빈이 너무 희석되어 흡광도 수치가 낮게 나타나는 경우에는 흡광도를 최대화하기 위해 플레이트를 405 nanometers에서 측정할 수 있습니다. 데이터를 분석하기 위해, PBS는 적혈구를 전혀 용혈시키지 않고 Triton X는 적혈구를 100% 용혈시킨다고 가정하여 용혈 백분율을 계산할 수 있습니다.제시된 식을 통해 각 샘플의 퍼센트 균일분해(percent homolysis)를 구할 수 있습니다. Microsoft Excel과 같은 소프트웨어를 사용하면 수백 개의 웰에서 얻은 실험 결과를 빠르게 분석할 수 있습니다. 다음은 논의된 pH 범위에 따른 여러 농도에서의 대표적인 결과입니다.이 제형은 이상적인 pH 반응을 보이며, 생리적 pH에서는 용혈 활성이 나타나지 않으나, 엔도좀 pH에서는 빨간색 화살표로 표시된 것과 같이 상당한 막 파괴를 일으키는 스위치와 같은 거동을 보입니다. 지금까지 저희 연구실의 pH 의존적 적혈구 용혈 분석법을 설명하는 영상을 시청하셨습니다. 이 분석법은 비교적 비용이 저렴하고 사용이 간편하며 처리량이 높은 분석법으로, 생물학적 제제의 용해성 전달을 위해 설계된 일련의 폴리머 조합 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.우리는 이 분석법이 단백질, 펩타이드, 핵산을 포함한 다양한 바이오 의약품의 세포질 전달 및 생물학적 활성을 매우 정확하게 예측한다는 것을 발견했습니다. 하지만 이 분석법에는 몇 가지 잠재적인 약점이 있다는 점을 언급해야 합니다. 이 방법은 엔도좀 막을 실제로 물리적으로 파괴하는 폴리머나 펩타이드에 대해 유용한 예측 도구인 것으로 생각됩니다.그러나 이는 폴리머나 양성자 스펀지(proton sponge) 기반 메커니즘으로 작용하는 다른 시스템에 사용할 예측 도구로는 적합하지 않습니다. 또한, 적혈구 지질 이중층의 구성이 엔도솜(endosomal) 또는 리소좀(lysosomal) 막의 구성과 정확히 일치하지 않는다는 점을 고려해야 합니다. 지질 조성 및 콜레스테롤 함량 측면에서 항상 추가적인 후속 연구를 수행할 준비가 되어 있어야 합니다.적혈구 용혈 결과와 함께 보완적인 기술 및 분석법을 활용하십시오. 예를 들어, 엔도솜 또는 리소좀 염색약과 함께 사용하는 형광 현미경을 공동 국소화 연구에 적용하여 생물학적 제제가 엔도-리소좀 경로에서 탈출하는 양상을 시각화할 수 있습니다. 또한, 전달된 약물 또는 생물학적 제제의 생물학적 활성이나 하위 효과를 측정하는 것이 항상 최종 단계가 되어야 합니다.마지막으로, 소속 기관의 규정에 따라 생물학적 위험 폐기물을 항상 적절하게 처리하고 폐기하십시오. 이것으로 영상을 마치겠습니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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