Name: 신생아 Subventricular 지대 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 신생아 뇌실하구 전기천공법을 이용한 신경줄기세포 유전자 조작 기술입니다. 이 방법은 신경발생 연구에 효율적이며 비용 효과적인 실험 도구를 제공합니다.

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이 작품은 국방부 (아이디어 개발 상, W81XWH-10-1-0041, AB), CT 줄기 세포 기금 (AB) 및 건강 NRSA 10668225 (DMF)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다. 현재 자료는 부분적으로 코네티컷의 줄기 세포 연구 보조금 프로그램의 코네티컷 주에서 지원 작업에 기반을두고 있습니다. 의 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 코네티컷 코네티컷 또는 중부 표준시 혁신의 주 공공 보건부의 국가의 공식 전망을 대표하지 않습니다 주식회사 funders는 데이터 수집을 연구 설계에 역할을 없었다 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비.

이 절차는 예일 IACUC 요구 사항에 따라 수 있습니다. 과학자들은 IACUC 가이드 라인은 자신의 기관 요구 사항에 따라 승인 및 준수되어 있는지 확인해야합니다. 1. 제 1 항. DNA, 솔루션 및 유리 피펫의 준비 <ol><li> 고순도 (OD 280분의 260&gt; 1.80) 높은 농도 (μg / μl&gt; 2.5) 독소가없는 DNA를 생성 할 수 있습니다. </li><li> 22 μm 필터를 통해 0.9 % 생리 식염수와 멸균 필터를 준비합니다. </li><li> 장소 10cm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브 (OD : 1.5 mm, ID : 1.10 mm) 모델 kanthal 와이어와 PP-830 Narishige PC-10 유리 피펫 풀러에. 70.5에서 한 단계 가중 풀다운 ° C.에 풀러를 설정 원형 집게와 팁을 해제하고 계단 가장자리에 해부 현미경으로 검사한다. 15 분을위한 UV 램프 아래에 베벨 팁과 장소. 당겨 피펫은 팁의 가장자리에서 2mm에서 표시해야합니다. </li><li> 무게 / 볼륨 빠른 그린 soluti 0.1 % 준비건조 빠른 그린과 혼합 살균 필터 0.9 % 생리 식염수로 있습니다. </li></ol> 2. 제 2 항. 동물 준비, 유리 피펫 로딩 및 플라스미드 주입 <ol><li> 유리 페트리 접시 4 미리 차가운에, 케이지 0-1 새끼 개별적으로 출생 후의 일 장소를 제거 ° C, 그리고 서부 유럽 표준시 얼음에 위치. </li><li> 약 5 분 후, 도보로 핀치 응답을 이용하여 anesthetization의 상태를 결정합니다. 심실 주사는 전혀 움직임이 발생하지 않으면, 주제 새끼. </li><li> 그것은 빠르고, 녹색, DNA, 그리고 생리 식염수의 조합 빠른 증발, 결정화 및 유리 피펫의 봉쇄 될 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 따라서, 주식 솔루션과 주사 직전에 parafilm로 나누어지는 1-2 μl를 생성합니다. </li><li> 당겨 유리 피펫으로 전체 aliquoted 볼륨을 대기음. </li><li> 엄지와 덜 지배적 인 손의 검지 손가락 사이의 강아지의 머리를 잡아. </li><li> 램프를 켜십시오D는 광선 이외의 강아지의 머리를 누르고 있습니다. 필요한 경우, 강아지가 반사 빛의 양을 줄이기 위해 머리에 염분 넣어. 심실 이제 조명해야합니다. </li><li> 당신의 지배적 인 손을 사용하면 (그림 1A 및 1B)에 가장 가까운 측면 심실에 바늘을 삽입합니다. 주사의 사이트는 lambdoid 봉합과 눈과 시상 봉합에 측면 2mm에서 약 등거리 있어야합니다. 삽입은 측면 심실에 침투을 보장해야하는, P0 강아지에 대한 2mm 마크에 피펫을 꺼냈다. 동시에, 당신은 intracranial 압력의 릴리스에서 피펫으로 CSF의 작성 다시 볼 수 있습니다. 플라스미드의 주입을 도와 intracranial 압력을 줄이기 위해 pup.Step 2.8의 머리에 그립을 느슨하게. 공기 압력을 주입기 (Picospritzer, 파커)를 사용하여 측면 뇌실에 플라스미드의 약 0.5 μl를 삽입. </li></ol> 3. 제 3 항. Electroporation 및 복구 <ol><li> SEt 5 평방 펄스, 950 밀리 초 간격으로 100 볼트 50 밀리 초 / 펄스에 대한 electroporation 발생기​​의 전압. 플라스미드 electroporation의 공간 특이성은 무료 전송의 방향에 의해 결정됩니다. 닫기주의 SVZ (8)를 따라 줄기 세포 인구의 이질성을 부여 게재 위치를 제공해야합니다. 증식과 세포 운명의 속도의 차이는 복부 - 등쪽과 뱃 부리 장식이있는 - 꼬리 위치 9,10에 대한 확인되었습니다. </li><li> 일단 플라스미드는 딥 트위터 전극은 PBS로, 주입된다. 이 단계는 요금이 전송을 극대화하고 저항으로 인한 화상을 방지하는 것입니다. </li><li> 플라스미드 주사의 사이트 (그림 1C 및 1D)에 ipsilateral 귀 근처에있는 강아지의 등 측면 벽에 긍정적 인 전극을 배치합니다. 의 강아지 코에 contralateral 반구 복부 측면에 부정적인 전극을 배치합니다. </li><li> 펄스 foots를 눌러 현재 송금을 시작합니다마녀는 등쪽에서 ~ 25 ° 각도 간격을 사용하여 측면에 전극 페달하고 지나간다. </li><li> 장소 5 분의 가열 패드에 새끼를 electroporated. 부드럽게 부드러운 자극과 새끼 매 30 초를 회전 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

저자되도록 할 공개가 없습니다.

다음은 세부 신생아 SVZ의 electroporation의 기술, 신속하고 견고 라벨 및 SVZ의 줄기 세포와 자손을 조작 할 수있는 기술을. electroporation 다른 기술에 비해 가지고 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 세포의 초점 라벨에 따라, 하나는 세포 자율적와 비 세포 자율적 인 효과를 판별 할 수 있습니다. inducible 시스템을 사용하여 둘째, 유전자 조작 한 사전이나 신경 통합 후 효과를 비교할 수 있습니다. 또한, 하나는 loxP 사이트를 포함 plasmids과 CRE 표현 쥐를 electroporating하여 여러 plasmids의 사용을 무시할 수 있습니다. 넷째, 유전자 기자 plasmids은 전​​사 transactivati​​on을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 경우 전사 활동은 조작 아르 셀로 측정 될 수있다; 하위 지역이 microdissected 때 추가 특이성 소개 할 수 있습니다. 다섯째, 과도 지속적인 확산으로 인해 교통 증폭기 세포의 라벨 및 희석 OF 플라스미드는 th...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 중형 연마 붕규산 배관 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF150 - 110-10 </td><td></td></tr><tr><td> 듀얼 스테이지 유리 Micropipette 풀러 </td><td> Narishige </td><td> PC-10H </td><td></td></tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 0521192205 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 스퀘어 웨이브 펄스 발생기 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 45-0052 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrodes </td><td> 하버드 장치 </td><td> 45-0488 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 광원 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-562-36 </td><td></td></tr><tr><td> 텅스텐 할로겐램프 </td><td> 우시오 미국, Inc의 </td><td> 1002247 </td><td></td></tr><tr><td> Picospritzer II </td><td> 파커 악기 </td><td> 052-0312-900 </td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 subventricular 지대 electroporation

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

신경 줄기 세포 (NSCs)는 라인 출생 후의 측면 심실하고 뉴런, astrocytes, 그리고 ependymal 세포 1 등 여러 세포 유형에 상승을 제공합니다. 분자 NSC 자기 갱신, 노력에 대한 책임 경로와 차별화를 이해하는 것은 활용 뇌를 수리하고 더 나은 중추 신경계 장애를 이해하는 독특한 가능성에 중요합니다. 포유류의 시스템의 조작에 대한 이전 방법은 전체 동물의 2 단계에서 유전 공학의 시간이 소요 비싼 노력이 필요했습니다. 따라서, 연구의 대부분은 체외 또는 무척추 동물의 NSC 분자의 기능을 살펴 보았다. 여기, 우리는 신생아 subventricular 구역 (SVZ) electroporation로 언급됩니다 신생아 NPCs를 조작 할 수있는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 비슷한 기술은 배아 NSCs을 공부하는 10 년 전 개발 및 cortica에 대한 연구를 도와 왔으며리터 개발 3,4. 최근이는 출생 후의 쥐 forebrain은 5-7 공부 적용되었습니다. 이 기술 SVZ NSCs과 자손의 강력한 라벨의 결과입니다. 따라서, 출생 후의 SVZ electroporation은 포유류의 NSC 유전 공학을위한 비용 및 시간 효율적인 대안을 제공합니다.

트위터 전극의 &quot;탁&quot;운동 (그림 1E) 다음 등쪽의, 등쪽의 측면, 그리고 측면 subventricular 구역과 인접 거의 모든 요골 glia의 라벨에 신생아 subventricular 영역 electroporation 결과이다. 그러나, electroporation은 각 실험의 요구에 맞는하지만 전극을 샅샅이 및 비디오 상세과 같은 특정 위치와 방향을 사용하지 할 수 있습니다. dorsally 현지화 반경 glia 이러한 안감에서 심실의 측면 부분을 다른부터 예를 들어, 하나는 단지 하나의 지역 9,10를 electroporate하기 위해 선택할 수 있습니다. 또한 특이성은 작은 전극을 사용하여 제공 할 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 빠르게 첫 3 주 동안 11에서 희석된다. 따라서, 플라스미드 DNA를 사용하여 식별 genomically 수정 전지는 사용하지 않는 것이 좋습니다. ...

우리는 신생아 subventricular 영역 electroporation라고 최소한 침입 기술을 보여줍니다. 기술은 신생아 새끼의 측면 심실에 플라스미드 DNA를 주입하고 전달하는 전기 전류를 적용 구성되어 있으며, 유전자 신경 줄기 세포를 조작

신생아 Subventricular 지대 Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

이 절차의 목적은 뇌실하 영역 신경 줄기 세포의 분자 성분을 유전적으로 라벨링하고 조작하는 것입니다. 이것은 먼저 DNA가 적재된 유리 피펫을 P zero P의 외측심실에 삽입함으로써 달성되며, 두 번째 단계는 DNA를 외측심실의 대뇌척수액으로 배출하는 것입니다. 다음 전류는 P에 적용되며, 이것은 DNA를 외측 심실을 감싸고 있는 신경 줄기 세포로 전달할 수 있습니다.궁극적으로 면역조직화학, 분자생물학, 현미경 검사 및 전기생리학을 포함한 분자 기술의 조합을 사용하여 뇌실하 영역 신경 줄기세포의 운명, 증식, 이동 및 성숙의 변화를 시각화합니다. 신생아 뇌실하 영역 전기천공법은 신경 줄기 세포와 그 자손의 증식, 분화, 이동 및 성숙을 조절하는 분자 경로가 무엇인지와 같은 신경 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 형질전환 마우스와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시간 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 SVZ의 뉴런 줄기세포를 빠르고 강력하게 라벨링할 수 있다는 것입니다.먼저, 전기 정제에 대한 DNA가 순도와 농도가 높고 내독소가 없는지 확인합니다. 10cm 방화 광택 BO 실리카 유리 모세관 튜브를 피펫에 당깁니다. 섭씨 70.5도에서 한 단계 가중 당기기를 당기도록 설정된 PP 8 30ghhi PC 10 피펫 풀러가 여기에 사용됩니다.피펫을 당긴 후 원형 집게를 사용하여 팁을 부러뜨립니다.그런 다음 해부 현미경으로 피펫을 검사하여 들쭉날쭉한 가장자리가 없는지 확인합니다. 필요한 경우 숫돌을 사용하여 팁을 경사지게 할 수 있습니다. 그런 다음 붓은 피펫을 UV 램프 아래에 15분 동안 놓습니다.15분이 경과하면 팁 가장자리에서 2mm 떨어진 곳에 미세한 팁 마커로 파이펫을 표시합니다. 마지막으로, 멸균 여과된 0.9% 멸균 식염수와 건조하고 빠른 녹색 마취제를 혼합하여 부피당 0.1 중량의 빠른 녹색 용액을 준비합니다. 0-1일 된 강아지, 섭씨 4도로 미리 식힌 유리 페트리 접시 약 5분 후 발 꼬집음 반응을 활용하여 마취 상태를 확인합니다.움직임이 없으면 심실 주사를 시작하십시오. 빠른 녹색 용액과 DNA 용액을 결합하고 1-2마이크로리터를 생물막에 분취합니다. 빠른 녹색 용액과 DNA를 결합하면 유리 피펫이 차단되어 급격한 증발 및 결정화가 발생할 수 있으므로 주입 직전에 이 작업을 수행하는 것이 중요하며, 마이크로필름 주사기로 전체 부분 표본 부피를 흡인하고 유

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Neuroscience

신경과학

E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

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예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

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여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.

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신생아 Subventricular 지대 Electroporation

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