Name: Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 배우세요 생쥐 spinotrapezius 근육에서 동맥 결찰을 이용한 미세혈관 기능 및 리모델링 평가 방법을. 이 기법은 허혈성 질환에서 혈관 반응성을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 그의 트랙 &#39;공항 라운지&#39;, &#39;배경 화면&#39;및 &#39;야간 멜로 드라마 (외관의 순서)를 포함하여, 관련 동영상에 자신의 크리에이티브 커먼즈 라이센스 음악의 사용을 위해 케빈 Macleod을 인정합니다. &quot; 우리는 또한 수술 동영상의 도움을 Ndubisi Okeke와 프레 더릭 Torstrick을 인정하고 싶습니다.

1. Spinotrapezius 피드 동맥 결합 외과 <ol><li> intraperitoneal 주사하여 마우스를 마취. 0.5 ML의 주사기에서 책정 : 100 밀리그램 / ML 케타민의 0.06 ML을 20.0 MG / ML Xylazine의 0.03 ML 0.4 MG / ML 아트로핀의 0.01 ML 0.9 %의 식염의 0.30 ML. 용량 : 0.01 ML의 * g 체중 당, IP </li></ol> 마우스 변형 및 주식시 * 복용 변수, 유도에서 한 시간 이내에 마우스 복구가 따라 조정할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 각막 건조를 방지하기 위해 표준 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 탈모 용 크림에 대한 간략한 응용 프로그램에 의해 다음 트리밍 가위를 사용하여 뒤쪽에서 머리를 제거합니다. </li><li> chlorhexidine 또는 povidone-요오드와 수술 필드를 소독. povidone - 요오드로 끝나는 에탄올을 세 번으로 대체 povidone - 요오드. </li><li> 가열 패드와 무균 드레이프으로, 이전에 준비 수술 작업 표면에 마우스를 전송장소 인치 </li><li> tenting하여 조직을 홍채 가위 및 표준 패턴 포셉 (예를 들면 FST, 11271-30)를 사용하여 평행하게 절단 어깨 블레이드의 뼈 부각에 꼬리 약 5mm의 등쪽 피부를 통해 선형 절개 (3~5밀리미터)를 만들기 척추. 대상 절개 사이트는 피부 착색을 허용하는 경우 등쪽의 지방 패드의 transdermal 시각화에 의해 식별 될 수 있으며, 지방 패드의 꼬리 경계에 자른다. 필요에 따라 절개를 확장하고 봄 가위를 사용하여 보조 피부 층을 통해 확장됩니다. <ol><li> 해부학 참고 - spinotrapezius 근육이 dorsally 위치해 있으며, 척추의 양쪽을 따라 L3에 T4에서 확장됩니다. 앞 국경은 약 어깨 블레이드 측면 확장합니다. 근육은 가장 뒤쪽 경계는 앞 국경에 안쪽 자리 잡고 있으며, 척추와 수세식하다 할 수 있도록 꼬리 방향으로 tapers. 두 지방 패드 spinotrapezius에 직접 등쪽과 복부 누워도 유의하는 것이 중요합니다 아르두개골 이분의 일에 대한 근육. </li><li> 절개로 인해 염증이 사기의 결합 수술은 spinotrapezius의 vasculature의 리모델링에 변화를 보여주지로 혈관 리모델링 응답에 영향을 미치지 않습니다 것을 보여줘왔다. 두 공간 요소는이 결과에 기여합니다. 먼저 절개는 근육의 혈관 응답이 일반적으로 심사 관심 지역에서 두개의 방향으로 5mm에 의해 제거됩니다. 또한, 등쪽의 피부에 절개 사이트는 spinotrapezius 근육의 두개골 셋째 상단에 자리 잡고 있습니다 복부 지방 패드로 선박 결합 사이트에서 분리되어 있습니다. </li></ol></li><li> 근육 탈수를 방지하기 위해 따뜻하게 벨소리의 솔루션으로 절개를 관개. 같은 papaverine 등 vasodilators의 응용 프로그램은 결합의 대상 동맥을 시각화에 도움이 될 것입니다. </li><li> 해부 현미경 아래에서 기본 musc에서 (제거 만) 해부 무딘과 분리 등쪽의 흰색 지방 패드를 집게를 사용하여이 입력과 측면 가장자리에 spinotrapezius을 떠난로 vasculature을 시각화하기 위해 ular 조직. </li><li> 하나 또는 두 개의 쌍으로 정맥과 함께 근육의 외측 가장자리에에서의 길에 spinotrapezius에 복부있는 지방 패드를 통과 대상 동맥을 찾습니다. 이 동맥은 반영 및 근육 내 동맥의 경로를 관찰하기 위해 근육을 대체하여 확인 할 수있는 근육의 꼬리 반 상당한 부분을 피드. 결합의 대상 위치는 동맥은 복부 지방 패드를 종료하고 근육을 입력의 세그먼트이며,이 지역의 매우 액세스 할 수 있습니다. 동맥 - 정맥 쌍 부드럽게이 지역에 복부 지방 패드에서 분리해야 할 수 있습니다. spinotrapezius이 가로 등쪽과 복부 지방 패드 중 그 선박을 포함하여 여러 동맥 - 정맥 쌍으로 공급된다합니다. 이 선박를 중단 않도록주의보십시오. <ol><li> 여러 지표는 동맥을 구별하는 데 사용할 수 있습니다정맥에서. 가장 좋은 방법 중 하나는 부드럽게 microprobe와 혈액의 흐름을 방해하고 근육 멀리 상류로 이동하는 것입니다, 방해가 출시 될 때까지 흐름이 동맥에 다시 시작되지 않습니다. 정맥 벽은 동맥 부족하는 결합 조직의 약간 흰 드레스를 포함으로 색상도 사용할 수 있습니다. 정맥은 일반적으로 크기가 큰만큼 또한, 하나는 vasodilator의 응용 전에 직경을 고려해 볼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 동맥은 짝을 정맥 가까이에 일반적이며, 동맥 뒤에 microprobe을 통과하고, 자연의 넓은 격차를 만들기 위해 팁을 사용하여, microprobe과 약 5mm 세그먼트를 분리하기 위해 # 5 포셉과 무딘 절개를 사용하여 동맥과 정맥 사이에 갈라진 틈. 이것은 봉합이 스레드 될 통해 격차입니다. </li><li> 10-0 단일 스레드 봉합과 바늘 홀더 장소 외과 의사의 매듭을 사용하여 해부 세그먼트의 근위 끝 부분 피드 동맥 (~ 70 μm의 직경) 주위 결합을 사용합니다. PLA동맥의 절개를 허용 할 수 ligatures 사이에 충분한 분리와 해부 동맥 세그먼트의 말단부에 대한 CE는 추가 결합. <ol><li> spinotrapezius 피드 동맥과 관련된 소규모는 대퇴 동맥과 같은 큰 혈관의 결합에 비해 증가 수술 난이도로 연결됩니다. 경험이없는 의사는 특히 무리하게 떼어 냄, 부주의 출혈 등 수술 합병증의 높은 속도를해야합니다. 특히 우려 파악하고 흐름이 바로 절단하기 전에 방해 된 후 무색 동맥을 절단의 어려움입니다. 외과 의사가 동맥뿐만 아니라 2 ligatures의 쉽게 관찰 분리와 컷의 확인을 가로로 쪼개다 위치를 찾기위한 안내서를 가지고 이러한 이유로, 2 ligatures을 배치하여, 절차 익숙 사람들을 위해 권장됩니다. 그러나, 경험 많은 외과 의사는 오랫동안 사람들이 명확하게 할 수있는 등 하나의 끈이 충분 될 수 있습니다파악하고 끈의 동맥 하류를 잘라. 이 기술의 아니게 날카로운 결합의 봉합과 주변 혈관을 nicking의 위​​험을 줄일 수 있지만,이 동맥은 가로로 된 확인 증가 어려움 등의 단점없이하지 않습니다. </li></ol></li><li> 혈액 흐름의 감소 (방해 RBC 열) 결합 사이트의 하류 (근육에 대한 예) 관찰에 의해 결합을 확인합니다. </li><li> 사용 해부 가위는 두 ligatures 사이의 출혈도 잡았 동맥을 가로로 쪼개다. 하나의 끈이 배치 된 경우 (11A), 하류 방향으로 극단적 인주의 자른다. </li><li> 일반 필름로드 의약품 (1mm)이 실험 절차의 일환으로 (caudally) 하류 게재 할 수 있습니다. </li><li> 원래 방향으로 변위 근막과 지방 조직을 변경할 수 있습니다. </li><li> 8-0 비 resorbable 봉합을 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 그런 관찰 준비 온수 복구 케이지에 마우스를 놓고 AP를 관리이러한 bupivacaine, 0.02-0.05 ML 0.25 % 지역 침투 등의 진통제를 propriate. </li></ol> 2. 현장에서 Spinotrapezius Intravital 현미경, <ol><li> 3~4%는 isoflurane 3-4 L의 유량 · 분 -1에서 100 % 산소로 기화로 유도 챔버에 마우스를 마취. <ol><li> injectable anesthetics보다 적은 유산소 운동 우울증이 있기 때문에 흡입 마취의 사용은 기능 측정을위한 바람직합니다. 같은 pentobarbital 나트륨 등을 사용할 수 없습니다, 오래 연기 injectable anesthetics에 흡입 마취는 동물이 위치 된 후에 반복 주사를 피하기 위해 선호하는 경우. </li></ol></li><li> 일단 anesthetized, 지속적으로 유지 보수 농도 (일반적으로 ~ 2 %) 및 0.5-1 L · 분 -1의 유속으로 마취 마스크 (일명 코 콘)를 통해 isoflurane 제공합니다. <ol><li> 마우스는 주로 자신의 비강을 통해 환기 때문에 만 NEC입니다마취 마스크 다이어프램 자신의 코를 충당 할 essary. </li></ol></li><li> 필요한 경우, 트리밍 가위와 탈모 크림을 사용하여 뒤쪽에서 머리를 제거합니다. </li><li> 열 패드로 동물을 운송. <ol><li> 그것은 감​​기 유발 혈관 수축을 방지하기 위해 euthermic 상태의 생쥐를 유지하는 것이 중요합니다,이 방법은 램프를 통해 수행 할 수, 물 열 패드를 순환 microwavable는 패드 등을 가열 </li></ol></li><li> 직장 온도 프로브를 넣고 35 온도 컨트롤러를 설정 ° C. </li><li> 홍채 가위 및 표준 패턴 집게를 사용하여 spinotrapezius의 꼬리 끝에 피부 절개를합니다. </li><li> , 지방 패드에 cranially 절개를 확장 말 신발 절개를 생성하고, 탈수를 방지하기 위해 플라스틱 랩과 함께 피부 플랩을 다룹니다. </li><li> 노출을 극대화 할 수 포셉, 봄 가위로 피하 결합 조직을 해부 퉁명. </li><li> 가까운 toge 등의 자극 전극을 삽입합니다가능한 한 군터, 현재 필드의 크기를 최소화하고, 척추에 불과 측면 노출 된 근육의 꼬리 끝에서 그들을 배치합니다. </li><li> 1 Hz에서 제공되는 200 μsec 기간, 2mA 진폭의 제곱 파도와 함께, 전극 데이터 수집 시스템, 전극 자극 아이솔레이터, 컴퓨터 컨트롤러를 사용하여 전극 위치를 확인하기 위해 테스트 자극을 수행합니다. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 노출 근육 위에 플라스틱 랩을 놓습니다. </li><li> 선박 직경이 평형되는 동안 30 분 기간을 타이밍 시작합니다. </li><li> 혈관 구조를 볼 수 있습니다 spinotrapezius 근육 위에 intravital 현미경를 배치합니다. <ol><li> 이머 션 렌즈를 사용하는 경우, 대상과 랩 사이의 PBS 한 방울 넣습니다. </li></ol></li><li> 메인 arteriole (가장 큰 선박 표시) 위에 시작하면, 관심있는 혈관을 찾습니다 XY 평면에 무대를 조작. <ol><li> 작은 arteriol을 표시반사 - 빛 현미경과 에스는 붉은 세포 열이 제공하는 것보다 더 큰 대비를해야합니다. 우리는 주로 microvascular 대비를 향상시키기 위해 사이드 스트림 어두운 현장 영상 현미경을 사용하지만, 반대로도 높은 분자량 형광 dextran의 정맥 주사 후 반영 - 빛 형광 현미경으로 향상시킬 수 있습니다. </li></ol></li><li> 30 분 평균 후, 관심있는 선박의 이미지 / 비디오를 캡처합니다. </li><li> 90 초 8 Hz에서에서 배달 200 μsec 시간, 2mA 진폭, 위에서 설명한 평방 파도와 함께 근육을 자극한다. </li><li> 다른 이미지 / 동영상 바로 후 자극을 캡처하여 선박의 휴식 직경으로 돌아 때까지 분마다 캡처 계속 10 분 ~. </li><li> contralateral 근육을 사용하여 단계 6-18를 반복합니다. </li><li> 데이터 분석은 이미지 분석 소프트웨어와 비디오 캘리퍼스 또는 오프라인으로 실시간으로 수행 할 수 있습니다. </li><li> 마우스가 따라 안락사시켜야ING IACUC 프로토콜입니다. </li></ol> 3. Spinotrapezius 조직 수확 및 고정 <ol><li> Spinotrapezius 피드 동맥 결합 단계 1로 배합, intraperitoneal 주사로 쥐를 마취. </li><li> 홍채 가위 및 표준 패턴 집게를 사용하여 마우스의 어깨 블레이드의 뼈 부각에 두개골 절개 몇 mm하십시오. 양쪽에 caudally 측면 후 절개를 확장합니다. </li><li> 부드럽게 피부를 반영하고 얕은 근막을 절단하여 등쪽의 몸에서 피부를 놓습니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 등쪽 지방 조직을 제거하고 근육을 반영하고 유사 복부 지방 조직을 해부하기 위해 무딘 절개를 사용하십시오. </li><li> 집게 및 스프링 가위를 사용하여 근육 위에 놓인 근막을 제거합니다. 이 단계는 어렵고 시간이 많이 걸릴하지만, immunofluorescent 착색 및 이미징을 향상하는 것이 중요합니다 수 있습니다. 조직은 수화하는 것은 근막의 제거를 쉽게 할 수 있습니다. </li><li> 찾기측면 근육의 경계, 그리고 거기에 복부 자리 잡고 지방 패드에서 spinotrapezius 근육을 분리하는 무딘 절개를 사용합니다. </li><li> 꼬리 방향으로 두개의 무딘 절개을 계속합니다. 여러 혈관이 근육이 복부 표면을 입력하고 떠나 있습니다, 재관류가 필요한 경우, 이러한 혈관을 끊어 버렸네하기 전에 수행해야합니다. 그 근육의 꼬리 반으로, 그 측면 테두리 삽입을 거기에 복부 거짓말을 근육으로도합니다. 일부 절단이 완전히 가장자리를 정의하고 해방이 경계해야 할 수 있습니다. </li><li> 소비세 spinotrapezius 근육. 이 작업을 수행하려면 : <ol><li> 무료 위에서 설명한대로 근육의 외측 가장자리. </li><li> 근육의 가장 두개 정도에 걸쳐 횡 방향 자른다. </li><li> 시상면에서, 안쪽 테두리 (척추를 따라)을 따라 잘라. </li></ol></li><li> 반복 절차는 contralateral 근육에 4-9 단계를 한 다음 m를 안락사시켜야IACUC 승인 방식에 의한 ouse. </li><li> 차가운 메탄올 (4 ° C) 또는 20 분의 4 % paraformaldehyde / RT의 탈 이온수 솔루션에 빠져있는 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 조직 문제를 해결했습니다. <ol><li> 또한, 재관류 고정이 채용 될 수있다. 2 단계 이전에, 1의 5 ML × 4의 5 ML 다음, 0.1 MM CaCl 2, 왼쪽 심실을 통해 2 %의 헤파린과 생리 트리스 버퍼로 오른쪽 아트리움에 절개를 만들어 thoracotomy을 수행하고 perfuse의 vasculature %의 선박 고정 용 paraformaldehyde, 1의 마지막 5 ML × 0.1 MM CaCl 2 7과 생리 트리스 버퍼. </li></ol></li><li> 바로 다음과 같은 고정, 네 번 20 분을 위해 표본을 씻어 각 0.1 % 사포닌을 0.01 M 인산 버퍼 생리 (PBS)를 사용하여. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없습니다 선언합니다.

여기에 제시된 손쥐 spinotrapezius의 결합 모델은 동맥 폐색의 기능 및 구조 적응이 결과를 연구 할 수있는 효과적인 작은 동물 모델입니다. 이 모델은 광범위하게 사용되는 hindlimb의 국소 빈혈 모델 4 보완입니다 점에서 높은 공간적 해상도 그대로 microvascular 네트워크 전체 - 근육의 전망을 제공합니다. 이 근육은 단지 등쪽 피부 아래에 자리 잡고 있기 때문에 또한, 그것은 intravital 현미경과 시리얼 이미징에, 그리고 superfusion 또는 박막 주입이를 통해 지역 약물 투여에 액세스 할 수 있습니다. 이러한 기능은 동맥 폐색에 따라 혈관 리모델링 및 기능 vasodilation에 소설 치료 목표의 효과를 연구하기에 매력적인 작은 동물 모델하십시오. 때문에 몇 가지 주요 D에 hindlimb 결합 모델에서 얻은 데이터에 spinotrapezius 결합 모델에서 얻은 데이터를 비교 때주의를 사용해야합니다ifferences. 첫째, spinotrapezius 근육은 근육을 안정화하고 있으며, 그들은 기능과 섬유 유형 분포의 측면에서 다리 근육 다릅니다. 우리 그룹은 이전에 spinotrapezius 근육의 arteriolar 결합이 아니라 hindlimb 모델 1,8에있는 대퇴 동맥의 결합에 따라 hindpaw에서 관찰 hypoxia에 비해 잘 발달 부수적 인 arteriolar 네트워크와 긴장에 작거나 무시할 hypoxia를 만들어 보여주었습니다 - 10. 우리는 또한 spinotrapezius 결합 모델은 기존 arteriolar 연결 3의 확대에 의해 모세관 collateralization 및 C57bl / 6 개조로 Balb / C 마우스 네트워크 리모델링과 C57bl / 6 마우스에 비해 Balb / C 마우스에서 다른 리모델링 응답을 생성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰과 hindlimb 결합 모델에서 만든 그 사이에 재미있는 평행가 있습니다 항에있어서, 상기 Balb / C 마우스 C57bl / 6 마우스 9,11,12에 비해 결합에 따라 연장 재관류 복구를 경험 &lt;/&gt;를 논의하게 될 것입니다. 우리가 아직 spinotrapezius 결합 모델에서 이러한 predictors을 테스트하지 않은 있지만 조직 국소 빈혈, 마우스 13 세 성별 14 병 (15)의 존재의 다른 모델도 arteriolar 가림으로 조직의 반응에 영향을 미칠 수. 둘째, spinotrapezius 모델에 출혈도 잡았되는 동맥의 크기는 대퇴 동맥보다 실질적으로 작이며, 따라서 결합은 spinotrapezius에 순환 트리의 낮은 수준에서 즉, 더 하류있는 작은 조직 볼륨에 미치는 영향 hindlimb 3 비교했다. 이 개입에 해당 생리적 반응 (예를 들면 혈관 리모델링)과 비교했을 때 따라서,이 두 모델의 결합의 위치에있는 해부학 적 차이는 고려되어야한다. 셋째, spinotrapezius의 두께는 산소가 이웃에서 조직의 unperfused 부분에 도달 할 수 있습니다3 위 명시된대로 hindlimb 모델의 결합 된 국소 빈혈과 hypoxia에 비해 조직. 넷째, 결합의 spinotrapezius 하류 부분에 흐름의 복구 hindlimb 결합보다 빠릅니다. spinotrapezius 결합 모델은 고유 한 만성 모델이며, 국소 빈혈 reperfusion의 부상 과도 동맥 폐색이나 모델의 다른 모델과 혼동해서는 안됩니다. 우리는 조건의 이러한 유형을 수용 할이 모델을 적용하는 것이 가능 고려해야하지만,이 여기에 제시 작업의 범위를 넘어입니다. 마지막으로, 우리는 젊은 쥐 달리 건강하고 높은 심장 박동 5와 고유의 생리적 한계로 인해를 활용 특히 직접 인간의 허혈성 질환의 임상 적 발현이 모델에 사전 임상 관찰과 관련된에 대한주의. 그럼에도 불구하고, 우리는 결합에 조직 반응의 기본 메커니즘을 잠복하고 잠재적 인을 식별하기위한 중요한 도구로이 새로운 모델을 간주의 생체 설정에 rapeutic 목표. spinotrapezius 피드 동맥 결합 절차 (해부학 정맥 (9A)에서 동맥을 구별 노트 (6A), 그리고 하나의 끈 (11A)의 사용)에서 제공하는 수술 노트에서 프로 시저 혜택의 몇 가지 측면뿐만 아니라 토론. 첫째, 등쪽의 지방 패드 국경 (또는 transdermal 시각화 할 수없는 경우 어깨 블레이드에 꼬리 몇 mm)으로 만든 최초의 절개는 이상적으로 외과 의사가있는 편안한 작게했고, 필요한 경우 절차를 수행하는 동안 확장됩니다. 이러한 행위는 외과 의사에 편리합니다 절개를 닫 필요한 suturing을 최소화 절차 시간을 단축하고, 또한 복구시 동물에 덜 자극적입니다. 근육이 확장 필드를 찾을 수 쉬울 수 있기 때문에 또한, 큰 피부 절개는 외과 의사 환경 설정에 따라 적합 할 수 있습니다. 이 경우 절개는 할 수있다척추를 향해 개고 수 있도록 중간 개방 얼굴 말 - 신발 모양 혜택을 누리 실 수 있습니다. 피부 절개를 만들고 표면 혈관이 손상 및 출혈의 원인이되는 경우 보조 피부 층을 통해 확장하는 동안 멸균 거즈로 빛을 압력을 적용하고 지혈 시간을 제공합니다. 또한 참고로,이 최소 힘으로 조직을 처리하는 것이 중요하며, 가능한 가까운 근육의 측면 국경과 거리 의도 허혈성 영역에서 집게로 누르고 있습니다. 이 연습은 동맥 결합에 의해 evoked 혈관 리모델링 응답을 먹이고 수있는 추가 염증성로 인한 조직 반응을 일으킬 수 호감 부상을 방지하는 데 도움이됩니다. 결론적으로, 우리는 arteriolar 결합에 혈관과 조직 반응을 조사를위한 수술 모델로 손쥐 spinotrapezius 근육의 사용을 보여주고 있습니다. 이 모델은 (대한 혈관 변경 intravital 평가에 적합합니다예를 들어, 기능 vasodilation), 그리고 혈관 변경 전 생체 평가 (예를 들어, 혈관 네트워크 immunofluorescent 이미징 및 quantitation 개). 두 사전 임상 및 임상 연구 arteriolar 장애물 (인간의 생쥐 또는 atherosclerotic 액자의 결합을 통해 예를 들어)에 대한 개인의 반응은 나이에 따라 달라집니다 것을 증명 한 질병의 유무 (예 : 당뇨병) 방해 동맥의 직경 , 개인, 그리고 조직 11-15의 대사 요구의 유전 메이크업. 이러한 여기에 제시된 것과 손쥐 모델은 이러한 복잡한 관계에 대한 조사를 용이하게 스트레인 특정 해부학 적 및 유전 차이점과 질병 특정 phenotypes의 연구원 소용.

만성 국소 빈혈의 동물 모델은 주변 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 뇌 혈관 질환 및 허혈성 질환 등의 pathophysiology를 조사를위한 유용한 도구입니다. 설치류에 인간에서와 같이 동맥 폐색은 arteriogenesis과 혈관 신생을 포함하여 혈관 네트워크의 구조 리모델링로 연결됩니다. 건강하고 젊은 환자에서이 개조는 국소 빈혈 유발 부상 조직을 구출하기에 충분 수 있지만, 당뇨병과 같은 공동 morbidities는 심각하게 개조 및 복구를 손상 할 수 있습니다. 혈관 리모델링 이벤트를 근간 메커니즘을 이해하는 것은 이러한 내생 revascularization 프로세스를 자극 요법을 개발하는 것이 필수적입니다. 현재 hindlimb의 대퇴 동맥의 결합 또는 절제술은 4,5 작은 동물에서 만성 국소 빈혈 유발 혈관 리모델링을 공부위한 표준 기술이다. 직경, 연결, 그리고 반응성 분석출혈도 잡았 넙 다리 동맥의 혈관 네트워크의 하류를 구성하는 microvessels은 근육의 두께로 인해 그러나, 어렵습니다. 이 안정화 등쪽 근육 1에 측면 피드 동맥의 일방적 결합 : 우리는 마우스 spinotrapezius 근육에 arteriolar 결합 모델을 개발했습니다. 상대적으로 얇은 spinotrapezius (60-200 μm)는 전체 조직에서 혈관 리모델링 이벤트에 대한 자세한 검사를 수 있도록 단일 셀 해상도 전체 네트워크 토폴로지의 평가를위한 실내 얼굴 immunostaining 의무가 있습니다. spinotrapezius는 표면 및 액세스 할 수 있습니다, 그래서 그 혈관은 쉽게 혈관 반응성에 대한 리모델링 및 arteriolar 결합의 영향의 효율적인 특성에 대해 intravital 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. 이 보고서에서, 우리는 자세히 설명하고 마우스 spinotrapezius arteriolar의 결합 모델을 보여줍니다. 생체 및 예 생체 내에서 두평가 다음과 같은 수술 thods은 허혈성 조건 6에서 장애인을 할 게재 된 기능 vasodilation, 그리고 전체 - 근육 microvascular 네트워크 immunofluorescent 이미지의 측정을 포함하여 설명되어 있습니다. 우리는 또한 모델의 유틸리티를 설명하기 위해 두 개의 파일럿 연구의 결과가 포함되어 있습니다. 첫째, 우리는 C57BL / 6 마우스 (그림 2B)의 선박 꼬부라 짐에 통계적으로 의미있는 증가를 유도하기 위해 동맥 결합 모델을 활용. arteriole의 민간인 피해에 arteriogenesis 동안 꼬부라 짐이 증가합니다. 다른 마우스 변종에서 그 부수적 인 arterioles의 부재 (예 : Balb / C)에 의한 국소 빈혈에 더 취약 있으며, 모세 혈관 arterialization 10을 관찰하고 있습니다. 모세관 arterialization이 증가 직경과 α-부드러운 근육 고를의 반응성의 개발에 의해 검출된다. 둘째, 근육의 기능 전기 자극은 spinotrapezi의 터미널 arterioles에 vasodilation로 연결우리가 (그림 3B).

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 창포 가위 </td><td> FST </td><td> 14090-09 </td><td> 유형 : 도구 </td></tr><tr><td> 크기 7 포셉 </td><td> FST </td><td> 11271-30 </td><td> 유형 : 도구 </td></tr><tr><td> 크기 5 포셉을 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td><td> 유형 : 도구 </td></tr><tr><td> 봄 가위 </td><td> Roboz </td><td> RS5671 </td><td> 유형 : 도구 </td></tr><tr><td> Microprobe </td><td> FST </td><td> 10140-03 </td><td> 유형 : 도구 직선 프로브로 대체 될 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 니들 홀더 </td><td> FST </td><td> 12500-12 </td><td> 유형 : 도구 </td></tr><tr><td> 유도 챔버 </td><td> 지구 JD 의료. (주) 주식회사 </td><td> IC-1086 </td><td>유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 아이 젤 </td><td> Dechra </td><td> NDC 17033-211-38 </td><td> 유형 : 시약 </td></tr><tr><td> 열 패드 </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 직장 온도 프로브 </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 자극 전극 </td><td> FHC </td><td> UEWSGCSE0N1M </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 의 장인 폴리머 클레이 </td><td> Polyform </td><td> N / A </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> PowerLab 데이터 수집 시스템 </td><td> ADInstruments </td><td> ML 845 </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 자극 아이솔레이터 </td><td> ADInstruments </td><td> FE 180 </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> LabChart </td><td> ADInstruments </td><td> ML S060 / 7 </td><td> 유형 : 소프트웨어 </td></tr&gt; <tr><td> 반사 - 빛 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BFXM </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 높은 MW 형광 dextran </td><td> 시그마 </td><td> FD250S-100MG </td><td> 유형 : 시약 </td></tr><tr><td> 동영상 캘리퍼스 </td><td> 콜로라도 비디오 </td><td> 308 </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 자동 혈관 분석 (AVA) </td><td> Microvision 의료 </td><td></td><td> 유형 : 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 안티 αSMA 복합 형광 </td><td> 시그마 </td><td> 1A4-Cy3 </td><td> 유형 : 시약 Clonal, 1:100 </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BFXM </td><td> 유형 : 장비 </td></tr><tr><td> 고 분자량 형광 dextran </td><td> 시그마 </td><td> FD250S-100MG </td><td> 유형 : 시약 </td></tr></tbody></table>

microvascular 기능 및 리모델링에 arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 spinotrapezius 모델

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

손쥐 spinotrapezius는 T3에서 L4로 확장하는 얇은 표면 골격 지원 근육이며, 등쪽 피부 절개를 통해 쉽게 접근 할 수 있습니다. 독특한 신체 구조는 허혈성 부상 이후 microvascular 리모델링의 조사를 위해 spinotrapezius이 유용합니다. 여기, 우리는 우리의 연구 팀에 의해 개발 이전에 1-3로 출판 되었음 : 손쥐 spinotrapezius 근육에 arteriolar 결합 모델을 보여줍니다. 예를 Balb / C 마우스와 같은 특정 취약 마우스 변종은이 결합 수술 안정적으로 골격 근육 국소 빈혈을 생성하고 revascularization을 자극 요법을 조사하기위한 플랫폼 역할을합니다. 평가의 방법도 intravital 및 공 촛점 현미경의 사용을 포함하여 시연됩니다. spinotrapezius 잘은 접근성 (표면 등쪽 해부학) 및 상대 두께 (60-200 μm)로 인해 같은 이미징 연구에 적합합니다. spinotrapezius 근육은 촉진, 얼굴 욕실이 장착 될 수있다조직 학적 sectioning없이 전체 - 근육 microvascular 네트워크 이미지. 우리는 기능 vasodilation 절차를 다음과 같은 통계를 얻기위한 intravital 현미경의 사용을 설명 할 수있다; 특히 근육 수축의 결과로 arterilar 직경의 증가. 우리는 또한 조직을 수확하고 해결을위한 절차, 연구 및 공 촛점 현미경의 사용을 immunostaining에 필요한 전구체를 보여줍니다.

결합을 거쳐 spinotrapezius 근육 먹이를 주요 동맥의 수술 전망은 관심 분야를 나타내는 레이블과 함께 그림 1에 표시됩니다. 결합은 그림 2A에 표시 한 후 바로 하류에 출혈도 잡았 동맥 일주에 위치한 근육의 수확과 immunostained 지역의 예를 들어 공 촛점 이미지입니다. 평활근 세포 (적색)을 표현 평활근 알파 - 고를를 포함하는 확대 된 부수적 인 arterioles이 결합 다음과 같은 특성 꼬부라 짐을 표시합니다. 출혈도 잡았 근육의 혈관 경로 길이와 코드 거리 (즉, 동일한 선박 경로 끝점으로 연장 선) 사이의 비율로보고 선박 꼬부라 짐은, (오른쪽) (; N = 8 그림 2B) unligated contralateral 근육에 상대적으로 향상 . 그림 3은 터미널 arteriole 기능 vasodilation은 intravital 현미경을 사용하여 측정 된에 파일럿 연구의 결과를 보여줍니다. 예상대로, arteriolar 디<html> ameter 크게 전기 자극을 유발 근육 수축에 따라 증가합니다. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1highres.jpg"/> 1 그림. 반영 spinotrapezius 근육 피드 동맥 수술 분야. 피드 동맥이 A0로 표시 두 곳에서 출혈도 잡았 있습니다. 이 ligatures 사이 bloodflow의 방해 후 동맥이 표시 사이트에서, D에 의해 명시된 바와 같이, spinotrapezius 근육에, A.에 의해 C에 의해 설명 된 복부 지방 패드에서 동맥 전환의 대상 세그먼트를 표시 현장에서 었어요 화살표 B. 흐름 방향 점선 화살표 E.로 표시됩니다와 ghres.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 꼬부라 짐의 파일럿 연구 spinotrapezius 근육의 microvascular 네트워크의 공 촛점 이미지. (A) 수확 및 전체 - 장착 근육이 공 촛점 현미경을 사용하여 평활근 알파 - 고를 및 이미징을위한 immunostained되었습니다. 보기의 필드는 근육의 영역이 바로 하류 출혈도 잡았 arteriole 1 주 후 결합의 위치 보여줍니다. 고통스러운 혈관 결합의 결과로 근육에 증거들이 (B) 파일럿 연구 결과는 크게 (P는 = 0.035, 1 꼬리 학생의 t-테스트) 증가를 나타냅니다. 꼬부라 짐이에 선박 경로 길이에 의해 측정으로 출혈도 잡았 근육에 microvessels에 의해 전시 C57BL / 6 마​​우스의 시험에 대한 코드를 거리 비율 (N = 8) contralateral 제어에 비해. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3highres.jpg"/> Figu3 다시. 생체 내 spinotrapezius의 arterioles의 기능 vasodilation의 Intravital 현미경 이미징. 휴식 (A) 대표 휴식 (왼쪽)에서 spinotrapezius 터미널 arterioles의 photomicrographs 즉시 8 Hz에서 근육의 수축 (오른쪽)의 정지를 따라가. (B) 터미널 arteriole 직경 ( 8.5 ± 0.5 μm, 왼쪽)와 바로 다음의 (11 ± 1 μm, 중) 크게 arteriolar 직경 (증가 근육 수축의 90 초, P = 0.032, 1 꼬리)가 Balb / C 마우스에서 t-테스트 짝 (n은 = 6). 비율 변화 (오른쪽) 지적했다.

우리는 단계별 절차와 필요한 장비에 대한 설명을 포함 손쥐 spinotrapezius 근육의 소설 동맥 결합 모델을 보여줍니다. 우리는 수술과 intravital 및 공 촛점 현미경을 사용하여 혈관 네트워크 리모델링 및 기능 vasodilation에 관한 관련 결과 측정을 설명합니다.

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

말초혈관질환은 인구의 약 12~14%에 영향을 미치며, 특히 흡연자나 당뇨병, 비만, 고혈압, 진행 단계 또는 동맥경화증이 있는 개인에게 흔하게 나타납니다. 본 수술의 목적은 거울상 척추승모근의 내측 절반으로 이어지는 세 개의 공급 동맥 중 하나를 결찰하여 골격근 허혈 모델을 제작하는 것입니다. 이 애니메이션은 이러한 동맥들의 일반적인 위치를 묘사하며, 허혈 반응을 유도하기 위한 의도된 결찰 부위를 나타냅니다.혈관 조직은 마우스 계통에 따라 동맥 무발생의 특징적인 변화를 겪게 됩니다. 여기에는 가교 측부 혈관의 형성이나 혈관 굴곡도의 증가가 포함됩니다. 또한, 생체 내 현미경 관찰을 통해 척수 승모근에서 기능적 혈관 확장 절차를 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.이 과정은 근육을 조심스럽게 노출시키고, 전원 장치 및 컨트롤러와 함께 자극 전극을 배치한 후, 영상 장치를 설정하는 과정을 포함합니다. 마지막으로, 근육을 절제하는 방법과 면역화학 염색 및 영상 촬영에 적합한 고정 과정을 설명하겠습니다. 안녕하세요, 저는 샬러츠빌에 위치한 버지니아 대학교 의생명공학과의 부교수 셰인 피어스 코틀러(Shane Pierce Kotler)입니다.안녕하세요, 저는 Kyle Martin입니다. 저는 Shane 교수님 연구실의 대학원생이며, 척수 승모근 결찰 모델 실험을 수행할 예정입니다. 저희 연구실에서는 미세혈관의 성장과 재형성을 연구하며, 특히 심장 질환, 말초 동맥 질환 및 뇌졸중과 같은 허혈성 질환 환경에서의 연구에 집중하고 있습니다.우리는 동맥 혈류의 국소적 폐쇄가 하류 미세혈관 네트워크의 구조적 적응을 어떻게 유발하는지 연구하기 위해 이 거울상 척추 승모근 결찰 모델을 개발했습니다. 우리는 이 모델이 조직학적 절편 제작 없이도 매우 얇은 근육 내에서 동맥 형성, 신경 형성 및 혈관 신생에 대한 전체 네트워크 관점을 제공한다는 점에서, 이미 잘 확립되어 널리 사용되는 후지 허혈 모델을 보완하는 모델이라고 생각합니다. 이 근육은 매우 얇고 결찰을 통해 혈류 감소를 재현 가능하게 유도할 수 있으므로, 전체 미세혈관床에 걸쳐 동맥 결찰의 효과를 단일 세포 수준의 해상도로 시각화할 수 있습니다.Kyle이 스피노 트라페지우스 결찰(spino trapezius ligation) 모델을 수행하는 단계별 절차를 안내한 후, Cal Poly의 공동 연구진이 이 모델을 사용하여 기능적 혈관 확장을 연구하는 방법을 보여줄 것입니다. 그 과정을 확인한 다음, 다시 버지니아 대학교로 돌아와 이미징 및 염색 전에 수행해야 하는 스피노 트라페지우스 채취를 진행하겠습니다. 안녕하세요, 저는 Trevor Cardinal입니다.저는 캘리포니아주 산루이스오비스포에 위치한 캘리포니아 폴리테크닉 주립대학교 의생명공학과 조교수 Josh Cutz입니다. 그리고 저는 산루이스오비스포 캘리포니아 폴리테크닉 대학교의 의생명공학 석사 과정 학생입니다. 저희 연구실의 주요 관심 분야는 말초혈관 질환에서 발생하는 만성 허혈이 저항 혈관의 기능적 능력에 미치는 영향을 이해하는 것입니다.척수 승모근 공급 동맥 결찰 수술을 마친 후, Josh가 저희 연구실에서 사용하는 기능적 혈관 확장 절차를 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 동맥 폐쇄가 혈관 반응성과 혈류 조절에 미치는 영향을 조사하기 위해 기능적 혈관 확장 절차를 사용합니다. 사전 준비물로는 10번 결찰 봉합사, o 폐쇄 봉합사, 지침기, 홍채 가위, 표준 포셉, 스프링 가위 및 굽은 마이크로 프로브가 포함됩니다.수술 도구를 준비한 후 마우스를 마취합니다. 여기서는 제시된 공식과 용량을 사용합니다. 발가락 꼬집 반사 테스트로 마취 상태를 확인한 다음, 전기 면도기를 사용하여 동물의 등에서 넓은 부위의 털을 제거하여 보호 구역을 확보합니다. 척추 승모근 결찰에는 견갑골 근처의 좁은 영역만 제거하면 되지만, 며칠 내에 수행할 척추 승모근 조직 채취를 위해서는 훨씬 더 넓은 제모 면적이 필요합니다.남은 털을 씻어낸 다음, 제조사의 지침에 따라 제모 크림을 도포합니다. 젖은 스펀지로 등 부위를 닦아냅니다. 그런 다음 알코올 솜과 Betadine 솜을 번갈아 가며 세 번 닦아내고, 마지막에는 Betadine으로 마무리합니다.충분한 조명 조건에서는 경피 식별을 통해 등쪽 지방 패드의 최적 절개 부위를 찾을 수 있습니다. 공급 동맥이 척추 승모근을 급격히 가로지르기 때문에, 이 위치에서는 지방 패드 경계가 피부를 팽팽하게 밀어 올립니다. 이때 홍채 가위를 동물의 등쪽과 수직이 되도록 위에서 직접 삽입하여 3~5 mm 길이의 선형 절개를 실시합니다. 조명이나 피부 색소 침착으로 인해 경피 식별이 불가능한 경우에는 다음과 같이 진행하십시오.견갑골의 골성 돌출부에서 5mm 옆으로 절개하고, 피부층을 통해 절개를 연장하며 필요에 따라 외측으로 확장하여 척추 승모근을 찾습니다. 결찰 부위에 접근하기 위해 상부의 근막을 절개합니다. 이 사례와 같이 표면 혈관이 손상되어 출혈이 발생하는 경우, 지혈될 때까지 기다리고 필요시 압박을 가하며, 건조를 방지하기 위해 식염수를 사용하여 적십니다.표시된 동맥은 척추 승모근의 등쪽을 따라 위치하며, 이후 근육을 가로질러 복측 지방패드로 들어갑니다. 척추 승모근의 외측 가장자리를 찾아 거의 뒤집힐 정도로 들어 올려 젖힙니다. 이렇게 하면 근육의 복측면과 동맥이 가로지르는 부위가 드러나는데, 이때 혈관을 가리고 있는 복측 지방패드를 절개하십시오.압착 손상을 방지하기 위해 포셉의 압력 조절에 주의하십시오. 여기서 외과의는 결찰할 spina trapezius artery를 지시합니다. 정맥 쌍의 존재에 유의하십시오. 작용 시간이 짧은 adenosine이나 작용 시간이 더 긴 papin과 같은 혈관 확장제를 적용할 수 있습니다.이 사례에서 동맥은 화살표로 표시된 것처럼 다른 두 혈관 사이에 위치합니다. 하나는 동맥과 크기가 비슷하며, 근육을 젖히지 않았다면 더 외측에 위치한 것으로 보였을 것입니다. 다른 하나는 크기가 훨씬 더 크며, 더 바로 옆에 위치하게 됩니다. 두 결찰 부위는 ai로 표시되어 있습니다.첫 번째 결찰사는 두 번째 결찰사에 대해 하류 방향으로 배치합니다. 이는 두 번째 결찰사를 배치하는 동안 혈관에 여전히 혈액이 채워져 있어 시야를 확보하기 위함입니다. A는 절단할 부위를 나타냅니다.동맥과 그에 쌍을 이루는 정맥이 C로 표시된 복측 지방 패드로 들어가는 위치 B를 확인하십시오. 이를 통해 두 번째의 더 작은 혈관이 정맥임을 알 수 있습니다. 또한 D로 표시된 척추동맥 승모근 자체를 확인하십시오. 동맥과 정맥을 구별하기 위한 몇 가지 팁이 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 기술되어 있습니다. 간단히 설명하자면, 저희가 선호하는 방법은 마이크로 프로브로 압력을 가해 혈류를 차단하는 것입니다.혈관이 동맥인 경우, 반사 근육을 적용하는 방향의 하류 쪽으로 혈류가 차단될 것입니다. 이 기법을 통해 더 큰 혈관을 제외할 수 있습니다. 필요한 경우, 80도 굴곡 마이크로 프로브를 사용하여 동맥을 다른 혈관들과 분리하십시오.이는 혈관 아래의 결합 조직을 뚫고 짧게 측면으로 움직여 틈을 넓힘으로써 수행됩니다. 프로브가 쉽게 통과할 수 있을 때까지, 이제 봉합 바늘을 동맥 아래로 더 쉽게 통과시킬 수 있습니다. 이 과정에서 작은 정맥이 긁혀 약간의 출혈이 발생했습니다.이 혈관은 허혈 구역에서 충분히 떨어져 있어 영향이 최소화될 것입니다. 절차에 따라, 단일 외과용 매듭(surgeon's knot)을 묶고 다음 봉합사를 준비합니다. 다시 한번, 미리 만들어둔 틈을 통해 통과시킨 후 이전 결찰 부위에서 상류 방향으로 몇 mm 떨어진 곳에 또 다른 외과용 매듭을 묶습니다.근육이 반전되어 있어 흐름 방향이 예상과 반대일 수 있음을 유의하십시오. 두 개의 결찰을 모두 배치한 후, 적혈구 기둥의 흐름이 차단되었는지 확인하십시오. 흐름이 멈추지 않았다면 추가 결찰이 필요합니다.그렇지 않으면 결찰사 사이의 혈관을 절단하고, 출혈 여부를 확인하십시오. 출혈이 없는 경우 결찰이 성공적으로 이루어져 동맥 출혈이 보이지 않는 것입니다. 대안적인 방법으로는 단일 결찰 후 하류 방향으로 절단하는 방식이 있습니다. 이 방법이 권장되는 상황에 대해서는 동반 문헌을 참조하십시오.근육을 원래 방향으로 복원하고, 변위된 지방 조직과 근막을 다시 배치한 후 비흡수성 봉합사로 봉합합니다. 마지막으로, 척추 승모근 생체 내 현미경 관찰을 위해 마우스를 가온 회복 케이지에 넣고 관찰하며 진통제를 투여합니다. 마우스는 먼저 유도 챔버에서 isof fluorine으로 마취시킨 후, 노즈 콘을 통해 isof fluorine을 지속적으로 공급합니다.직장 온도 프로브를 삽입하고 온도 조절기를 35 °C로 설정합니다. 사전 준비물에는 iris 가위, 표준 포셉, 스프링 가위 및 PBS로 적신 면봉이 포함됩니다. iris 가위와 표준 patent 포셉을 사용하여 척추 승모근의 꼬리 쪽 끝에 피부 절개를 가합니다. 절개 부위를 지방 패드 쪽 머리 방향으로 확장하여 말발굽 모양의 절개선을 만들고, 건조를 방지하기 위해 플라스틱 랩으로 피부 플랩을 덮습니다. 미세 포셉을 사용하여 피하 결합 조직을 둔탁하게 박리하여 가시성을 최대화합니다.전류장의 크기를 최소화하기 위해 자극 전극을 가능한 한 서로 가깝게 배치하며, 노출된 근육의 꼬리쪽 끝부분이자 척수 바로 외측에 위치시킵니다. 클레이를 사용하여 고정합니다. PowerLab 데이터 수집 시스템, 자극기, 절연기 및 LabChart 소프트웨어를 사용하여 전극 배치를 확인하기 위한 테스트 자극을 수행하며, 이때 설정값은 지속 시간 200 microsecond, 진폭 2 milliamp의 사각파이며 1 hertz로 전달합니다.노출된 근육을 다시 랩으로 덮습니다. 건조를 방지하기 위해 혈관 직경당 30분 동안 평형 상태가 되도록 기다린 후, 이미지 또는 비디오를 캡처하십시오. 혈관 구조를 관찰하기 위해 생체 내 현미경을 척추 승모근 위에 배치합니다.침수 렌즈를 사용하는 경우, 가장 큰 혈관인 주동맥 상단부터 시작하여 대물렌즈와 플라스틱 랩 사이에 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다. XY 평면에서 스테이지를 조작하여 관심 혈관의 위치를 찾습니다. 이전과 동일한 지속 시간 및 진폭의 사각파로 근육을 자극하되, 자극 직후 8Hz의 빈도로 90초 동안 전달합니다.혈관을 촬영하고, 혈관이 휴지기 직경으로 돌아올 때까지 매분 촬영을 계속합니다. 데이터 분석은 비디오 캘리퍼를 사용하여 실시간으로 수행하거나 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 수행할 수 있습니다. 초기 절개부터 촬영까지의 절차를 반대편 근육을 사용하여 반복합니다.종료 후, 표준 ACUC 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시키고 승모근 조직을 채취합니다. 아이리스 가위, 표준 포셉 및 스프링 가위가 필요합니다.앞서 설명한 대로 마우스를 마취합니다. 마우스의 견갑골에서 머리 쪽으로 수 밀리미터 떨어진 지점에 절개를 시작합니다. 절개 부위를 외측으로 확장한 다음 양측 모두를 박리합니다.목표는 절개 후 T3에서 L4까지 뻗어 있는 척주 승모근을 노출시키는 것입니다. 피부는 가볍게 당기거나 결합 조직을 조심스럽게 절개하여 등에서 분리할 수 있으며, 건조를 방지하고 조직 취급을 용이하게 하기 위해 식염수로 충분히 적신 상태로 고정합니다. 둔성 박리를 사용하여 등 쪽의 지방 조직을 제거하고 척주 승모근을 노출시킵니다.마찬가지로 복측 지방 조직을 제거합니다. 근육을 젖힌 후, 동물의 우측 척추 승모근을 여기서 확인합니다. 다음으로, 상층의 근막을 가능한 한 많이 제거합니다.이 절차 단계는 다소 지루할 수 있으나, 현미경 관찰 시 아티팩트(artifact)가 발생하는 것을 방지하기 위해 매우 중요합니다. 결합 조직을 제거한 후, 먼저 등쪽과 대략 평행하게 외측 가장자리를 자르고 머리 쪽에서 꼬리 쪽 방향으로 이동하며 표시된 대로 조직을 절제하십시오. 그다음 가장 머리 쪽 끝부분을 가로질러 횡단면으로 자르고, 마지막으로 척추와 가장 가까운 내측 경계를 따라 잘라 반대편 근육을 수집하십시오.동일한 절차를 따릅니다. 먼저 배측 지방 조직을 제거하고, 그다음 복측 지방 조직을 제거한 뒤, 마지막으로 절개하면서 상부 근막을 제거합니다. 이때 기구를 비우세손으로 바꾸어 잡는 것이 더 수월할 수 있습니다.동물을 안락사시킨 후, 여기에 설명된 절차에 따라 절제된 조직을 고정하고 세척할 수 있습니다. 이는 개선된 A CUC 프로토콜에 따른 것입니다. 대체 관류 고정 절차에 대한 자세한 내용은 관련 문헌을 참조하십시오.여기 반사된 spini trapezius 근육의 라벨링된 도식도를 보여드립니다. 공급 동맥을 노출시킨 후, 문자로 표시된 영역은 이전과 동일합니다. 개체마다 해부학적 구조가 고유하다는 점에 유의하십시오.이 특정 마우스는 다른 두 혈관이 근접해 있어 이 절차를 수행하기에 상당히 까다로운 편입니다. 여기에는 보다 일반적인 동물이 제시되어 있습니다. 표시된 동맥과 그 바로 위에 있는 주변 정맥 사이의 간격이 상대적으로 넓으며, 세 번째 혈관이 없다는 점에 유의하십시오.여기 평활근 알파 액틴으로 염색된, 결찰된 우측 척추 승모근의 공초점 현미경 몽타주 이미지가 있습니다. 허혈 조건 하에서, 결찰 부위 하류의 표시된 영역에서 리모델링이 일어났습니다. 이러한 변화는 이미지 분석 소프트웨어를 통해 정량화할 수 있으며, 여기서는 동맥 경로 길이와 중심 거리의 비율로 굴곡도를 측정하는 데 사용합니다.여기에 표시된 일부 샘플 데이터는 대조측 대조군과 비교하여 혈관 굴곡도(tortuosity)가 증가했음을 나타내는 통계적으로 유의미한 결과를 보여줍니다. 또한, 오프라인 암시야 현미경의 VA 및 MicroVision 의료 소프트웨어를 사용하여 혈관 반응성의 기능적 측정을 시연합니다. 자극 전과 후의 비디오 혈관 직경을 측정하고, 이를 백분율 변화로 상호 비교합니다.여기에 표시된 샘플 데이터는 자극 후 말단 동맥의 혈관 직경이 증가하여 통계적으로 유의미한 결과가 나타났음을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 Pierce Scholer 연구실의 학부생이자 이 영상의 편집을 담당한 Alexander Ell입니다. 지금까지 저희는 거울상 흉쇄유돌근(spin trapezius muscle)에서 골격근 허혈 모델을 만드는 방법을 함께 살펴보았습니다.그런 다음 혈관 반응성 및 혈류 조절 측정에 적합한 기능적 혈관 확장 절차를 시연했습니다. 마지막으로 면역화학 염색 및 이미징에 적합한 고정 준비를 위해 근육을 적출하는 방법을 보여드렸습니다. 샌 루이스 오비스포와 이곳 샬러츠빌의 공동 연구자들을 대신하여, 시청해 주셔서 감사드리며 여러분의 연구 활동에 행운이 함께하기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

심혈관 질환의 동물 모델에서 동맥 병변의 생체 외 분석은 고전적으로 조직학 및 면역 조직 화학 기술에 의존합니다. 이는 3차원 병변에서 2차원 측정을 제공합니다. 이 원고는 광학 투영 단층촬영을 사용하여 3차원의 정량적 분석을 위한 동맥 병변의 발생에 대해 설명합니다.

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