Name: 直接成像诱导ER钙有针对性的酯酶染料装载（TED） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学习靶向酯酶诱导染料装载（TED）方法，利用重组羧酸酯酶在内质网中解掩蔽低亲和力钙指示剂染料，实现活细胞内质网钙动态的直接荧光成像。该技术为研究细胞钙信号传导机制提供了高分辨率工具。

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本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）BL567/3-1 项目和弗里德里希-鲍尔基金会（Friedrich-Baur-Stiftung）的资助。我们衷心感谢加利福尼亚大学圣地亚哥分校霍华德·休斯医学研究所实验室的 Roger Y. Tsien 提供 Tag-RFP-T2。我们诚挚感谢加利福尼亚理工学院（California Institute of Technology, Pasadena）的 David Baltimore 和日内瓦大学（University of Geneva, Geneva）的 Didier Trono 提供慢病毒质粒 FUGW 以及 psPAX2/pMD2.G。

本方案介绍了TED在细胞系、海马神经元和皮层胶质细胞中的应用。当TED载体稳定表达时，其效果最佳，例如通过慢病毒载体实现稳定表达。TED方法的示意图见图4。
1. 溶液的配制
以下溶液应在开始实验前配制，并按指示储存。我们通常使用灭菌的玻璃和塑料器皿以及经高压灭菌的水。
<ol>
 <li>配制 HEPES-Ringer 溶液（单位：mM）：125 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO4.7H2O、2 CaCl2、1.25 NaH2PO4.H2O、10 glucose.H2O。无钙 HEPES-Ringer 溶液成分为（单位：mM）：127 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO4.7H2O、1.25 NaH2PO4.H2O、10 glucose.H2O 和 0.1 EGTA。不含葡萄糖的成像溶液可在 4 °C 下保存。使用前需新鲜加入所需量的 D-葡萄糖。</li>
 <li>对于海马神经元中的 TED 分析，推荐使用人工脑脊液（ACSF）。ACSF 的成分为（单位：mM）：127 NaCl、23 NaHCO3、3 KCl、2.5 NaHPO4.H2O、25 D-glucose.H2O、2 CaCl2、2 MgCl2.7 H20，溶于 ddH20 中。</li>
 <li>将 Fluo5N-AM 配制成 5 mM 的浓度。为促进溶解，向 50 μg 冻干的 Fluo5N-AM 中加入 8.9 μl 的 20% Pluronic F-127（溶于 DMSO，室温保存，避湿避光）。然后使用水浴超声仪溶解 Fluo5N-AM，至少超声 2 分钟。分装成每份 0.5 μl，于 -20 °C 保存，避光避湿。</li>
 <li>根据需要配制拮抗剂和激动剂储备液。例如：a) 10 mM ATP 或 ADP（溶于 H2O，用于嘌呤能受体的代谢型激活）；b) 10 mM 氯化卡巴胆碱（carbachol）溶于 H2O（毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂）；c) 30 mM 环匹阿尼酸（cyclopiazonic acid, CPA）溶于 DMSO（SERCA 抑制剂）；d) 50 mM DHPG 溶于 PBS（代谢型谷氨酸受体 mGluRI 和 mGluR5 的激动剂）；e) 10 mM 谷氨酸（Glutamate）溶于 H2O；f) 1 mM 离子霉素（ionomycin）溶于 DMSO（离子载体）；g) 5 mM 毒胡萝卜素（thapsigargin）溶于 DMSO（高亲和力 SERCA 抑制剂）。分装后于 -20 °C 保存。</li>
 <li>慢病毒载体：本实验方案包含使用慢病毒 TED 表达载体颗粒。其制备与储存不在本方案范围内。我们使用第二代慢病毒载体将重组羧酸酯酶递送至细胞系、胶质细胞和神经元。我们的慢病毒系统基于表达载体 FUGW 37，包装质粒 pCMVΔR8.91 或 psPAX2，以及假型质粒 pMD2.G 38,39。注意：使用重组自失活型慢病毒载体时，必须严格遵守生物安全指南。在许多国家，此类载体被归类为生物危害二级风险。更多信息请参见 <a href="http://www.addgene.org/lentiviral" target="_blank">http://www.addgene.org/lentiviral/</a>。</li>
</ol>
2. 小鼠海马神经元的制备与病毒感染
<ol>
 <li>将100个玻璃盖玻片放入直径为20 cm的玻璃培养皿中，用70%乙醇清洗1次，约30分钟。最后用100%乙醇（p.a.）处理2分钟。去除残留乙醇，并在无菌操作台中将盖玻片晾干。</li>
 <li>准备两种不同的海马神经元培养培养基：（a）Neurobasal培养基添加B27（1:50）；（b）完全培养基：Neurobasal培养基添加B27（1:50）、Glutamax（1:100）和N2补充剂（1:100）。将培养基过滤除菌后置于细胞培养箱中保存，待用。</li>
 <li>在解剖前一天，先将一个无菌的10 mm盖玻片放入4孔细胞培养板的每个孔中，然后小心地在每个盖玻片上加入80–100 μl 0.1%多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）进行包被，随后将培养板置于培养箱中过夜。</li>
 <li>在解剖及细胞培养当天，先用100 μl HBSS将盖玻片清洗三次，然后向每个盖玻片上转移100 μl Neurobasal培养基。将培养板放入培养箱中平衡（例如在小鼠解剖期间）。</li>
</ol>
解剖
我们根据欧盟指南并在本机构动物护理与使用委员会批准后，使用小鼠进行实验。
<ol start="5">
 <li>取出全脑并双侧解剖分离海马体。</li>
 <li>仔细去除海马体以外的脑膜及其他组织，将每侧海马体分别放入含有 450 μl HBSS 的 1.5 ml 离心管中。将组织置于冰上保存，直至获得足够数量的海马体。</li>
</ol>
细胞培养
<ol start="7">
 <li>向每根试管中加入 50 μl 1% 胰蛋白酶（Worthington），在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。期间偶尔轻轻摇动试管。为终止消化反应，向每根试管中加入 50 μl 1% 胰蛋白酶抑制剂，并轻轻颠倒混匀数次。</li>
 <li>将最多 5 个海马体的所有组织转移至一个 15 ml 离心管中，避免转移液体。加入 B27 培养基（a），使终体积为 5 ml。</li>
 <li>使用火焰抛光的巴斯德玻璃移液管，通过轻柔吹打进行组织吹打。注意：避免产生气泡！</li>
 <li>以 400 × g 离心 3 分钟，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 ml B27 培养基（a）中。</li>
 <li>再次使用玻璃移液管吹打一次，随后使用 1,000 μl 带滤膜的塑料吸头吹打两次。操作方法同步骤 2.9 和 2.10 所述。</li>
 <li>最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于 2 ml 完全培养基（b）中，并使用 200 μl 带滤膜的塑料吸头吹打细胞。为将残留的细胞团块与单细胞悬液分离，静置 1–2 分钟使细胞团块自然沉降。</li>
 <li>对细胞进行计数，并计算病毒感染所需的细胞总数。用于 TED 成像时，每张 10 mm 盖玻片接种 25,000 个细胞。</li>
 <li>建议在此时额外接种 25,000 个未转导的细胞作为对照。</li>
</ol>
病毒感染
<ol start="15">
 <li>将用于病毒感染的细胞悬液转移至新的15 ml离心管中，在400 × g条件下离心3分钟。</li>
 <li>吸除上清液，并将细胞重悬于300 μl培养基（b）中。</li>
 <li>加入适量具有感染性的慢病毒TED表达载体颗粒，将离心管置于室温下静置10分钟。</li>
 <li>用完全培养基（b）补足至铺板所需的最终体积（每张10 mm盖玻片100 μl），吸除盖玻片上的原有培养基，立即向每张盖玻片加入100 μl细胞悬液。</li>
 <li>将培养皿放入培养箱中，待所有细胞沉降（约2小时）后，小心地补充培养基至每皿含2 ml（b）。</li>
 <li>让神经元至少培养生长一周，每周更换50%的培养基。</li>
</ol>
3. 小鼠大脑皮层胶质细胞的培养与病毒感染
准备
<ol>
 <li>首先配制基础胶质细胞培养基（DMEM/F12 与 10% 胎牛血清、5% 马血清、1% 青霉素/链霉素、0.45% 葡萄糖按 1:1 比例混合），并在 T75 细胞培养瓶中加入 4 ml 浓度为 0.5 ng/ml 的聚-DL-鸟氨酸氢溴化物（PORN）（用 150 mM 硼酸溶液稀释，pH 8.35）进行包被。37 °C 孵育 2 小时或过夜后，用 HBSS 洗涤细胞培养瓶三次，然后加入 18 ml 含有 B27（1:50）和 10 ng/ml EGF 的基础胶质细胞培养基。将细胞培养瓶置于培养箱中平衡（最长 3 小时）。</li>
</ol>
解剖
<ol>
 <li>我们在符合欧洲联盟指南并经本机构动物护理与使用委员会批准的条件下，使用小鼠进行实验。</li>
 <li>解剖一只P5-P7小鼠的大脑，按照2.5节所述方法，分离双侧半球的海马和软脑膜。</li>
 <li>解剖前额皮质，将其切成数个小块，收集至含有HBSS的1.5 ml离心管中。将离心管置于冰上保存，并立即进行细胞培养操作。</li>
</ol>
细胞培养
<ol start="4">
 <li>使用火焰抛光的玻璃移液管将管中所有组织转移至15 ml离心管中。</li>
 <li>加入基础培养基至终体积5 ml，用火焰抛光的玻璃移液管反复吹打数次以解离组织。在300 × g条件下离心3分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于5 ml基础培养基中。</li>
 <li>重复步骤3.5两次。</li>
 <li>第三次离心后，将细胞沉淀重悬于2 ml含B27（1:50）和10 ng/ml EGF的基础胶质细胞培养基中。</li>
 <li>再次吹打混匀，将细胞悬液转移至预先准备的T75细胞培养瓶中，培养3–4天。</li>
</ol>
胶质细胞的洗涤（培养 3-4 天后）：
<ol start="9">
 <li>用 10 ml PBS 洗涤细胞一次，同时用手用力轻敲或轻轻拍打培养瓶数次，另一只手需牢牢握住培养瓶。此步骤可去除培养物中的细胞碎片和细胞团块。</li>
 <li>吸除 PBS，加入含有 B27（1:50）和 10 ng/ml EGF 的新鲜基础胶质细胞培养基。继续培养 5–7 天，直至细胞达到 80% 融合度。</li>
</ol>
胶质细胞的传代、转导及最终接种：
<ol start="11">
 <li>用 100 μl 多聚赖氨酸（储存液：0.1%，用 PBS 或 HBSS 稀释 50 倍至 20 μg/ml）包被 10 mm 盖玻片，于培养箱中孵育过夜。用 HBSS 洗涤盖玻片三次，加入 100 μl 基础胶质细胞培养基。将盖玻片在培养箱中平衡 3 小时。</li>
 <li>用 10 ml PBS 洗涤胶质细胞两次，吸除 PBS，加入 3 ml 胰蛋白酶（TrypLE，未稀释）。消化细胞最多 1 分钟。注意：避免过度消化。通常 1 分钟后超过 80% 的细胞已脱落，这足以获得数百万健康细胞。</li>
 <li>加入 10 ml 基础胶质细胞培养基终止反应，将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，以 300 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml 基础胶质细胞培养基中。</li>
 <li>再次按照步骤 3.15 所述进行离心和吸除，然后将细胞重悬于 5 ml 基础胶质细胞培养基中。</li>
 <li>将所需数量的细胞转移至 1.5 ml 离心管中。每张 10 mm 盖玻片使用 104–2×104 个胶质细胞即可。通常，用于转导一个 4 孔板的细胞悬液体积少于 200 μl。向细胞中加入适量的慢病毒 TED 表达载体颗粒，在室温下孵育 10 分钟。然后用基础胶质细胞培养基补足至接种体积（每张盖玻片 100 μl）。</li>
 <li>每张盖玻片接种 100 μl 感染后的细胞，孵育约 2 小时，然后加入含 B27（1:50）和 10 ng/ml EGF 的基础胶质细胞培养基，终体积为 2 ml。</li>
 <li>为获得理想的培养条件，建议在铺板后第 3–7 天使用细胞进行实验。</li>
</ol>
4. 报告细胞系的建立与培养
基于HeLa、BHK21、Hek293和SH-SY5Y细胞建立了TED报告细胞系。本文提供了HeLa细胞的实验方案，但该方案也可适用于其他任何细胞系。
稳定表达的 HeLa 细胞系的构建
<ol>
 <li>将野生型 HeLa 细胞系进行分瓶，取 100,000 个细胞以 200 μl 体积转移至 1.5 ml 离心管中。</li>
 <li>向离心管中加入适量的慢病毒 TED 表达载体颗粒，在室温下孵育细胞-病毒悬液 10 分钟。随后将细胞接种至 30 mm 培养皿中，总体积为 2 ml 培养基（DMEM，10% FCS，1% 青霉素/链霉素），孵育 3 天。</li>
 <li>用 PBS 洗涤一次后，吸除培养基，加入 500 μl 胰蛋白酶（TrypLE，PBS 中按 2:3 比例稀释）。孵育约 3 分钟后，加入 3 ml 培养基终止反应。将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，以 400 × g 离心 3 分钟。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于 200 μl 培养基中，并按照步骤 4.2 所述方法再次用慢病毒颗粒感染细胞。然后将细胞接种至 T25 培养瓶中，加入 10 ml 培养基。</li>
 <li>培养细胞至融合度达到 60–80%，随后进行传代。</li>
</ol>
TED 报告基因细胞系
<ol start="6">
 <li>TED 报告细胞系可在任何标准培养基中维持培养， 例如 使用含5%或10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。</li>
 <li>在含有无菌10 mm盖玻片的4孔板中接种适量细胞（见上文）， 例如 每盖玻片 10,000 至 20,000 个细胞。</li>
 <li>在用于TED成像前，至少培养细胞两天。</li>
</ol>
5. 倒置显微镜下活体成像实验的准备工作
<ol>
 <li>
 <ol class="lalpha">
 <li>将 HEPES-Ringer 预热至室温，并加入 D-葡萄糖。</li>
 <li>将不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 ACSF 预热至室温，并加入 D-葡萄糖。用碳合气（carbogen）通气 5 分钟，然后加入 1 M 的 CaCl2 和 MgCl2 储存液，使终浓度均为 2 mM。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>启动活细胞成像显微镜及所有计算机程序。</li>
 <li>在“模拟”成像室上开始灌流，并平衡管路系统。</li>
 <li>预热显微镜载物台上的管路加热器和成像室，并将成像室固定在加热槽中。</li>
 <li>在开始染料加载程序前，将系统平衡至 32–37 °C。注意： 为避免灌流液意外流入显微镜系统，我们使用发圈缠绕物镜，并用弹性硅胶片（1 mm 厚）保护显微镜载物台。</li>
</ol>
6. 任一细胞类型的染料负载
<ol>
 <li>重悬1份Fluo5N-AM（见1.3） 100 μl 预热的成像溶液（HEPES-Ringer 或 ACSF）</li>
 <li>在水浴超声仪中，将 Fluo5N-AM 溶于成像溶液（HEPES-Ringer 或 ACSF）中，持续 90 秒。</li>
 <li>使用新的4孔或24孔板并转移 400 μl 预热的成像溶液加入一个孔中。将染料溶液加入同一孔中，使其达到 500 μl 的 5 μM 溶液</li>
 <li>小心地将带有细胞的盖玻片放入例如 直径为10-18 mm的孔中，细胞朝上放置。</li>
 <li>在细胞培养孵育箱中孵育适当的时间 37 °C （同时在显微镜载物台上设置成像参数）。神经元和胶质细胞的典型染料负载时间为7-15分钟，细胞系为10-20分钟。</li>
</ol>
关键提示：染色时间与染料浓度取决于细胞类型、细胞密度以及特定实验需求！在染料存在下长时间孵育可能对细胞造成损伤，特别是原代神经元和原代胶质细胞，这会影响细胞对生理刺激的响应能力。长时间孵育（例如 30 分钟）仅适用于内质网钙定位实验，以研究内质网钙在亚细胞微小结构（例如 细小神经突或树突棘）中的分布。在某些实验中，将 1/3 培养基与成像溶液混合可能有助于在 Fluo5N-AM 加载过程中保护细胞。
<ol start="6">
 <li>立即把盖玻片转移到另一个含有成像溶液（HEPES-Ringer 或 ACSF）的细胞培养孔中，并开始将细胞装入成像室。</li>
</ol>
7. 使用倒置激光扫描共聚焦显微镜进行内质网钙离子活细胞成像
<ol>
 <li>使用画笔将高真空润滑脂涂抹到成像室上。该润滑脂用于将盖玻片固定在灌流室底部。我们使用自制的适用于10-12 mm盖玻片的小体积成像室，可实现高达每分钟15倍缓冲液更换的高灌流速度。适用于18 mm盖玻片的商用灌流室可从Warner Instruments（RC-49FS）购买。该灌流室还可实现对神经元的场刺激。</li>
 <li>取带有Fluo5N负载细胞的盖玻片，并在细胞上滴加少量成像溶液（50–100 μL），以保持细胞始终被成像溶液覆盖。将盖玻片翻转后安装至成像室中。使用棉签（e.g. Q-tips）轻压盖玻片使其嵌入硅胶中。</li>
 <li>用棉签擦去玻璃盖玻片底部的残留缓冲液。注意：若使用高数值孔径的油镜进行高分辨率成像，需小心擦去残留水分。残留盐分最好用水清除。若不慎沾上润滑脂，可用丙酮或纯乙醇去除。</li>
 <li>将“假”成像室更换为实验用成像室。通过持续灌流对细胞洗涤5–10分钟。</li>
 <li>通过持续灌流对细胞洗涤5–10分钟。</li>
 <li>在细胞筛选过程中，应使用最低限度的激光照明、高扫描速率（2–4 Hz）、小图像尺寸和高增益。</li>
 <li>注意：在筛选Fluo5N标记的细胞时，避免使用过量光照或直接使用落射荧光照明。强光照射Fluo5N/Ca2+复合物会在2–4秒内导致内质网特异性荧光完全丧失（图5）。</li>
 <li>根据实验设计设置显微镜。用于参考的、不同TED载体成像的代表性参数设置见表1。对于倒置激光扫描共聚焦显微镜，我们使用Olympus IX81显微镜，配备Fluoview 1000共聚焦系统，该系统包含二极管激光器（473 nm，15 mW；559 nm，20 mW）和光谱检测系统。</li>
 <li>实验开始时，通过高分辨率x,y-z图像序列记录目标细胞。</li>
 <li>进行x,y-t成像，以在特定实验条件下监测内质网钙动态变化。本系统的典型设置列于表2中。</li>
 <li>在持续灌注成像溶液的条件下监测内质网钙的变化。典型的缓冲液更换速率示例如下：（a）通过SERCA抑制进行细胞清洗和钙库耗竭：1.5 ml/min；（b）ATP/DHPG刺激：3 ml/min。</li>
 <li>优先以12位（4096灰度级）采集数字图像。若需同时成像Fluo5N/Ca2+和RFP，可采用8位图像（256灰度级）以避免系统数据溢出。</li>
 <li>将活细胞时间序列图像（x,y-t）或三维图像序列（x,y-z）（用于显示Fluo5N/Ca2+复合物的细胞内分布）以ImageJ兼容格式（e.g. tiff）存储。</li>
</ol>
8. 图像处理与数据分析
<ol>
 <li>在 ImageJ 程序中打开图像堆栈。若为多色成像，当 ImageJ 提示时，将 RGB 通道分离。</li>
 <li>通过仔细检查图像堆栈来确定你的感兴趣区域（ROI）例如 借助强度随时间变化图）</li>
 <li>使用时间序列分析插件读取感兴趣区域（ROI）中的平均像素强度（F原始）。根据实验目的，可在整个内质网或内质网的小区域周围绘制感兴趣区域（ROI） 例如 外周细胞区域树突的内质网。同时在无细胞区域选取1-3个感兴趣区域（ROI）用于背景扣除。</li>
 <li>计算平均背景荧光（Fb通过计算背景感兴趣区域（ROI）的平均荧光值，并从荧光值 F 中减去背景值 Fb 来自 F原始 值得以获得 F 值感兴趣区域 值</li>
 <li>计算 F0通过计算每个 ROI 在静息状态下十到三十个荧光值的平均值，确定细胞的基础荧光。</li>
 <li>通过 ΔF/F 计算荧光的背景校正相对变化0 由公式：</li>
</ol>
<img alt="荧光信号变化公式 ΔF/F₀，用于光学成像分析。" fo:content-width="1.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50317/50317eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50317/50317eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1">
<ol start="7">
 <li>以荧光相对变化的轨迹图表示，Y 轴为 ΔF/F0，X 轴为时间。</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li>
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<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

近年来的多篇出版物已广泛讨论了TED方法的优缺点34,35。与其他上述方法相比，TED避免了细胞破坏和灌注的问题。此外，需要强调两个方面。用于ER钙成像的TED原理要求：（1）借助TED载体构建体，实现羧酸酯酶在内质网腔内的靶向表达；（2）在内质网腔内高效且优先释放对钙离子亲和力较低的合成AM酯类荧光染料。
	1. TED 载体构建
	图3 总结了TED载体构建体的开发过程。TED基于CES家族蛋白（EC 3.1.1.1）开发而成。这些蛋白是内质网腔内的常驻成员。对于 体外 研究表明，重组CES蛋白的施用在蛋白稳定表达后或病毒介导的中等水平表达后效果最佳。目前尚不清楚其他具有酯酶活性的蛋白是否可替代CES蛋白用于TED成像。不建议使用TED载体的瞬时转染进行动态内质网钙分析，因为细胞在转染操作后反应性降低。CES蛋白需要正确定位于内质网腔，这一过程依赖内质网信号肽的有效切割。此外，CES蛋白在内质网腔内的滞留与回收由其氨基末端的KDEL样基序介导。当瞬时转染T...

为了研究内质网的生理性钙反应，我们开发了一种新策略，以提高合成型钙敏感染料在内质网中的滞留效率。该方法能够在细胞外钙存在的情况下，直接、非侵入性地实时监测内质网内的游离钙浓度。	
	内质网钙离子的功能与信号传导
	钙信号存在于多种细胞类型中，例如肌细胞、神经元和胶质细胞，其功能范围从介导肌肉收缩到参与学习与记忆中的突触传递1,2。游离钙离子浓度的变化具有重要的科研意义，因为钙离子参与调控基因转录、细胞增殖、神经元兴奋性、细胞死亡以及其他细胞信号传导事件1-7。所有这些细胞内的钙信号在功能上相互关联，并共同影响细胞内钙库的动力学过程8-10。
	所有钙信号的共同特征是钙离子在细胞外空间、细胞质以及细胞器（主要是内质网和线粒体）之间的流动。这会导致这些细胞器内钙浓度的动态变化，而不同的信号组分能够感知这些变化。通常情况下，内质网中的钙浓度范围为100至800 μM，细胞质中的钙浓度接近100 nM，细胞外空间的钙浓度约为1-2 mM。因此，钙离子向细胞质流动具有较高的化学驱动力2,9,10。
	最常研究的内质网（ER）来源的钙信号依赖于G蛋白偶联受体（GpcR）的激活，后者进一步激活磷脂酶C（PLC）。PLC继而生成肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）1。当IP3与其在内质网膜上的受体（IP3-Rec，图1）结合后，钙离子便从内质网腔中释放出来。历史上，Streb 等于1983年首次——尽管是间接地——在胰腺腺泡细胞中测量到了内质网通过IP3介导的钙释放11。该研究首次提出了一个信号级联通路，涉及乙酰胆碱、磷脂酶C和IP3。这种钙释放方式通常被称为IP3诱导的钙释放（IiCR）（图1）。受体酪氨酸激酶通过激酶依赖性激活磷脂酶Cγ，将生长因子和神经营养因子的作用与IP3升高后的内质网钙信号联系起来12。除了IiCR外，钙升高还可通过离子型钙内流介导，例如通过电压门控钙通道（CaV），进而由兰尼碱受体（RyR）引发钙诱导的钙释放（CiCR）。IiCR和CiCR在生理上与内质网钙库操纵的钙内流（SOCE）相关联。SOCE涉及STIM（基质相互作用分子）的作用，STIM是内质网钙释放的感受器。研究表明，STIM可通过瞬时受体电位通道（Trp）13、Orai钙通道14，甚至电压门控钙通道15（图1）促进细胞外钙的内流。内质网钙的流失可由肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）动态地补充，该酶主动将钙泵回内质网。使用如毒胡萝卜素（thapsigargin）等药物抑制SERCA，会揭示内质网钙持续向胞质溶胶区室流失的现象。这种内质网钙的“泄漏”是由内质网膜内的孔复合物（如Sec61蛋白复合物）引起的16,17（图1）。
	1998年，Berridge提出了一个名为“神经元内的神经元模型”的理论，该模型提出内质网（ER）在整合神经元钙信号方面具有重要的生理功能5。该模型认为，存在一个连续的内质网膜系统，形成了神经元质膜的细胞内“映像”5。这种二元真核生物膜系统被认为是神经元对快速和慢速钙信号进行时间和空间整合的基本前提。在同一神经元的不同树突棘或树突中同时或相继发生的钙信号可通过内质网传递至细胞体或细胞核，并在其中进行叠加5,18。随后，这些叠加的信号可能影响神经元的兴奋性、基因转录的调控或信号级联的整合。因此，内质网有助于钙信号的整合。该理论的一个前提是单个细胞内内质网的连续性，这一观点已被多项研究提出，并至少在胞体-树突区域及短距离轴突投射中得到证实19-21。至于长距离轴突投射中是否存在内质网的连续性，目前仍存在争议。
	测量游离钙离子在内质网膜上流动的方法
	细胞质中的钙信号最常被监测 22,23因此，很难明确区分是 Ca2+ 从细胞外或细胞内储存库流入细胞质 6,24为克服这一局限，已开发出用于直接进行内质网钙成像的方法学策略。简而言之，采用以下策略：（1) 靶向内质网的基因工程蛋白指示剂 25-27. 基于蛋白质的低亲和力 Ca2+ 指示剂使用生物发光蛋白 aequorin 或 GFP，结合钙感应蛋白。这些基因工程改造的 Ca2+ 指示剂（GECIs）可通过信号肽靶向内质网，并利用保留与回收基序将指示剂主动保留在内质网中。常用的内质网Ca2+ 基于Cameleon原理的指示剂为Cameleon YC4.3 26,28；Cameleon 分子探针 YC7.3ER 29，以及 Cameleon D1 30. (2) 基于酯酶的AM酯低亲和力染料直接负载 Ca2+ 指示剂 31,32. 指示剂染料的AM衍生物（Mag-Fura2-AM、Mag-Fluo4-AM或Fluo5N-AM）以脂溶性且对钙不敏感的状态穿过生物膜。随后，在细胞质以及内质网（ER）中，内源性酯酶会切除AM酯基团，释放出Ca2+ 指示剂，从而在细胞质和内质网中留下一定量的活性染料。因此，只要细胞质钙浓度远低于低亲和力指示剂的检测限，特别是在特征性钙信号期间，当内质网中钙浓度较高时，该方法即为有效。例如 nM 至低 μM。3) AM-酯负载与质膜通透化相结合 32. 任何残留的胞质 Ca2+ 指示剂通过使用少量“温和”去垢剂对质膜进行通透化处理而被去除例如 皂苷)置于人工细胞内缓冲液中。因此，细胞内膜可能被刺激， 例如 与 IP3 在细胞内缓冲液中，直接通过质膜上的“孔”进入。4) 全细胞构型下细胞质的透析及钙离子的同时测量2+ 内质网腔和细胞质 32,33. 首先将细胞加载低亲和力 Ca2+ 指示剂例如 Mag-Fura2-AM，比率型，紫外光）。随后，在膜片钳移液管的辅助下，清除残留的胞质低亲和力 Ca2+ 指示剂通过含有高亲和力 Ca 的缓冲液从细胞质中透析出去2+ 指示剂例如 Fluo-3，可见光）。该策略可实现细胞质和内质网来源信号的同步记录。5) 靶向酯酶诱导染料加载 8,34一种羧酸酯酶（CES）被靶向至内质网腔，可提供高酯酶活性，从而有效捕获低亲和力Ca的AM酯形式2+ 指示剂。
	靶向酯酶诱导染料加载（TED）
	为了提高低亲和力 Ca2+ 探针在内质网腔内的靶向性，开发了 TED 技术。TED 需要过表达一种靶向内质网的小鼠羧酸酯酶（CES2）（图 2），该酶通过表达载体实现表达。表达重组 CES 载体的细胞与钙离子荧光探针的乙酰甲氧基酯形式（Fluo5N-AM，图 2）共同孵育。随后，在内质网中，由于 CES2 具有高酯酶活性，可将探针转化为对 Ca2+ 敏感且不能透过膜的 Ca2+ 探针复合物（Fluo5N/Ca2+），从而将探针高浓度地滞留在内质网腔内8,34。该方法特别适用于研究通过 IiCR 通路（例如代谢型、嘌呤能或谷氨酸受体介导的通路）引发的内质网钙释放8,34，以及直接观察由“泄漏通道”引起的内质网钙耗竭，例如在 SERCA 被阻断后的情况17,34。根据我们的经验，目前 Fluo5N-AM 是与 TED 染料负载策略联用的最佳可用低亲和力 Ca2+ 探针。Fluo5N-AM 对 Ca2+ 的亲和力较低（解离常数 KD 约为 90 μM，图 2），其 AM 形式几乎无荧光，但在结合钙离子后可产生强烈的荧光信号8,34。Fluo5N/Ca2+ 复合物可使用约 490 nm 的标准光源激发，该波长与 FITC、Alexa 488 或 eGFP 等常规荧光染料相匹配。细胞质中的钙信号浓度通常仅达到低 μM 范围，因此 Fluo5N 在细胞质中几乎无法检测到这些信号35。
	为了提高TED的性能，开发了多种重组载体构建体（图3）。最初，TED载体基于CES2的编码序列（Refseq登录号NM_145603，CES2c），其中以CES构建体的稳定表达获得最佳的TED性能。新的TED载体表达CES2的核心元件，并将其与红色荧光蛋白TagRFP-T2融合36。这些载体的优势在于可用于识别转导细胞，并利用红色荧光作为Fluo5N/Ca2+荧光变化归一化的内参对照。此外，红色荧光还能够用于可视化内质网的结构分布及其在刺激条件下内质网动态的变化。

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（Dihydroxyphenylglycine）</td><td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5'-ATP-Na2，三磷酸腺苷二钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂，50倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>氯化氨甲酰胆碱（Carbachol）</td><td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>环匹阿酸（CPA）</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺/谷氨酰胺替代物的DMEM</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca/Mg 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x</td><td>聚丙烯酸</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM，10 x 50 &amp;mu;g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Ascent 科学</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12营养混合物</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、不含镁、含酚红的汉克平衡盐溶液（1×），HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>SHD3250YK</td><td>线性</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 盐</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>小鼠EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2补充剂 100倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127，低紫外吸收，2 g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>聚-DL-鸟氨酸氢溴化物 PORN</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴化物</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbio combust</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>沃辛顿</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>共聚焦系统：倒置激光扫描显微镜：FV1000 配 IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>用户特定配置</td></tr><tr><td>共聚焦系统：激光合束器FV10及二极管激光器（405、473、559、635）</td><td>Olympus</td><td></td><td>用户特定配置</td></tr><tr><td>共聚焦系统：配备光谱检测器的扫描头 FV10-SPD</td><td>Olympus</td><td></td><td>用户特定配置</td></tr><tr><td>加热器控制器 TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td><td>控制在线溶液加热器</td></tr><tr><td>NIH ImageJ 软件</td><td>WS Rasband，ImageJ，美国国立卫生研究院 &lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/&quot; 目标=&quot;_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>目标：UAPON20XW340 NA 0.7 WD 0.35</td><td>Olympus</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>目标：UPLFLN40XO</td><td>Olympus</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>目标：UPLSAPO60XO/1.35，WD=0.15</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>灌流室，倒置</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流室，RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>灌注管：PT-49</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td><td>用于灌注</td></tr><tr><td>蠕动泵 MiniPlus 3（4 通道）</td><td>Gilson</td><td>未提供</td><td>灌流泵</td></tr><tr><td>单通道在线溶液加热器 SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>由加热控制器控制</td></tr><tr><td>吸液管：ST3R</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td><td>用于灌注</td></tr><tr><td>加热模块：Tempocontrol 37-2 数字双通道</td><td>Pecon</td><td>未提供</td><td></td></tr></tbody></table>

靶向酯酶诱导染料加载（ted）技术对内质网钙的直接成像

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

钙动态的可视化对于理解钙在细胞生理学中的作用至关重要。为了研究钙动态，可使用合成的荧光Ca²⁺指示剂，这类指示剂具有易于加载的优点，但其信号持久性、靶向特定细胞区室的能力以及与遗传编码指示剂相比的时间控制方面存在局限性。此外，合成指示剂无法通过病毒转导等方式实现特定细胞类型的靶向表达。遗传编码的钙指示剂（GECIs）克服了这些限制，能够实现细胞类型特异性表达，并可长期稳定表达以用于慢性或纵向研究。其中，GCaMP系列指示剂因其高灵敏度和广泛适用性而被广泛应用。通过将GCaMP靶向表达于特定细胞群，研究人员能够在体内外实验中实时监测神经元或其他细胞类型的钙活动。该方法结合活细胞成像技术，可用于分析单细胞或细胞群体水平的钙信号动力学，从而揭示细胞激活模式、网络连接性及功能响应特性。2+ 指示剂已变得流行。本文中，我们演示了TED（靶向酯酶诱导染料加载）方法，该方法可改善Ca²⁺的释放2+ 不同细胞类型内质网腔中的指示染料。迄今为止，TED 已应用于细胞系、胶质细胞和神经元 体外. TED 基于高效的重组靶向技术，利用表达羧酸酯酶（Carboxylesterases, CES）的载体构建体，将高羧酸酯酶活性靶向内质网（ER）腔。最新的 TED 载体包含与红色荧光蛋白融合的 CES2 核心元件，从而实现双色同时成像。游离钙在内质网中的动态变化以一种颜色成像，而相应的内质网结构则呈现为红色。实验开始时，细胞通过慢病毒转导，随后将感染后的细胞接种于盖玻片上，以便最终进行活细胞成像。接着，活细胞与低亲和力 Ca²⁺ 探针的乙酰氧基甲酯（AM-ester）形式共同孵育2+ 指示剂，例如 Fluo5N-AM、Mag-Fluo4-AM 或 Mag-Fura2-AM。内质网中的酯酶活性可将 AM 形式的 Ca2+ 指示剂和亲水性荧光染料/Ca2+ 复合物在内质网腔内形成并被滞留。染料负载后，细胞在倒置共聚焦激光扫描显微镜下进行分析。细胞持续灌注类林格液，通过延时成像直接观察内质网钙离子动态变化。内质网钙释放表现为兴趣区域荧光强度下降，而内质网钙库的再充盈则导致荧光强度上升。最后，通过计算 ΔF/F 确定随时间变化的荧光强度改变。0.

本方案提供了一种非侵入性的方法，用于直接成像游离的内质网钙离子。在靶向内质网的重组酯酶酶活性的帮助下，低亲和力合成型Ca2+指示剂被释放并滞留在内质网腔内。通过改进Ca2+指示剂染料在内质网腔内的负载效率，可实现对内质网钙库动态的直接且快速的成像。
用于 TED 的细胞类型
该方法在BHK21、HEK29334、HeLa17、SH-SY5Y细胞系、培养的星形胶质细胞8,40以及原代海马和皮层神经元8,34,41中已显示出可行性。在我们的实验中，当TED构建体通过自失活慢病毒载体37,39稳定表达时，TED效果良好，优先使用相对较弱的启动子（例如泛素启动子）35。其他更强的启动子正在研究中。
TED 标记的内质网特异性
使用Fluo5N成功...

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术通过荧光成像支持对细胞内钙库动态的分析。该方法基于将重组的羧酸酯酶靶向至内质网（ER），在内质网腔内增强合成的低亲和力Ca2+指示染料的局部去屏蔽效果。

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术对内质网钙的直接成像

钙动态的可视化对于理解钙在细胞生理学中的作用至关重要。为了研究钙动态，可使用合成荧光…

以下实验的总体目标是直接在活细胞内质网腔内观察钙动态变化。为此，通过将靶向酯酶诱导型染料或 TED 载体构建体转导至细胞中，使其在内质网中过表达羧酸酯酶 CS2。随后，将细胞与乙酰甲酯钙指示剂 Fluo-5N AM 共同孵育，该指示剂可穿过质膜和内质网膜扩散进入细胞。随后，羧酸酯酶将酯基切除，释放内质网腔内的钙离子敏感探针，进而形成荧光钙复合物。通过活细胞成像获得的结果显示了内质网中游离钙浓度的变化。该方法有助于回答有关细胞内钙稳态调控的关键问题。钙信号最常在细胞质中进行监测，因此难以明确区分进入细胞质的钙是来自细胞外空间还是来自细胞内的内质网钙库。为克服这一局限，我们开发了靶向酯酶诱导的钙释放监测技术。通过该方法，可直接监测内质网释放的钙离子。该方法具有非侵入性。细胞质膜保持完整，细胞内信号转导级联得以保留。通常，采用该方法的个体将面临困难，因为他们需要相关经验。在TED载体表达中，我们开发了载体构建体，表达一种中心蛋白与羧化酶CES2的融合蛋白。这使我们能够在实验过程中轻松识别适合进行AR钙成像的细胞，这些细胞具有强红色荧光以及中等至强钙指示剂荧光的特征。这种荧光标记应均匀分布于内质网中，并在细胞核区域无分布。在开始之前。根据文本方案制备人工脑脊液（A CSF）和氟噢五胺（flu oh five NAM）。将A CSF预热至室温，并加入足量葡萄糖，用碳合气（carbogen）充氧5分钟。然后加入氯化钙和氯化镁的1摩尔储备液，使其终浓度均为2毫摩尔。启动活细胞成像显微镜和计算机程序后，先在模拟成像腔室中开始灌注，平衡管路系统，预热管路中的溶液加热器以及显微镜载物台上的成像腔室，并将系统平衡至32至37摄氏度。在开始下载程序以将染料加载到细胞之前，向一份0.5微升的5毫摩尔Fluo-5N AM中加入100微升预热的aCSF，在水浴中超声溶解90秒，然后将400微升预热的成像溶液转移至4孔或24孔板中的一个孔内。将上述D溶液加入同一孔中，配制成总体积为500微升、浓度为5微摩尔的溶液。接下来，小心地将带有细胞的盖玻片放入培养孔中，在37摄氏度的细胞培养箱中孵育适当的时间。DI染料的加载时间和D浓度取决于细胞类型、细胞密度以及实验的具体需求。长时间孵育可能对细胞造成损伤，特别是对原代神经元和胶质细胞，这会影响细胞对生理刺激的反应性。超过30分钟的孵育仅适用于研究内质网钙在微小区域（例如树突棘的MUEs）中分布的内质网钙定位实验。孵育结束后，立即将盖玻片转移至另一个含有成像溶液的细胞培养孔中。在将细胞装入成像腔室之前，使用画笔将高真空油脂涂抹到成像腔室上。我们使用自制的成像腔室，适用于10至12毫米的盖玻片，且体积较小，因此可实现高达每分钟15倍缓冲液更换的高灌流速度。用镊子夹取带有flu oh five及已加载细胞的盖玻片，并加入少量成像溶液以保持其湿润。然后将盖玻片倒置，将细胞装入成像室中。用棉签将盖玻片压入硅胶中，并擦去玻璃盖玻片底部残留的缓冲液。接着，将对照成像室更换为实验用成像室。通过持续灌流进行细胞洗涤，时间为5到10分钟，以实现细胞筛选。使用最低限度的激光照射，以防止荧光染料Fluo-4和细胞内钙离子的快速光漂白，采用每秒2至4赫兹的高扫描速率、较小的图像尺寸以及显微镜上的高增益设置。根据植物实验方案。实验开始时，记录 fluo-5 和钙标记物以及红色羧基荧光素酯构建体的红色荧光标记在细胞内的分布情况。针对您感兴趣的细胞（此处为典型神经元），通过高分辨率的 X、YZ 图像堆栈进行 XYT 成像，以在特定实验条件下监测内质网钙动态变化。本系统典型设置详见文本方案中的表二。在持续灌注成像溶液过程中监测内质网钙的变化，溶液置换速率为：用于细胞清洗和通过阻断肌浆/内质网钙 ATP 酶（SERCA）诱导钙库耗竭时为 1.5 毫升/分钟；使用 ATP 和 DHPG（代谢型谷氨酸受体激动剂）进行刺激时为 3 毫升/分钟。此处用 200 µM ATP 刺激胶质细胞 10 秒。为处理图像，在 ImageJ 程序中打开图像堆栈以进行多色成像。当软件提示时，拆分 RGB 通道。确定感兴趣区域。根据实验目的，在完整的内质网（ER）周围或内质网的局部小区域绘制感兴趣区域。使用时间序列分析插件读取感兴趣区域内像素的平均强度。使用此公式通过 ΔF/F₀ 计算经背景校正的荧光相对变化。将荧光的相对变化以 ΔF/F₀ 为 Y 轴、时间为 X 轴的曲线图形式呈现。在该图中，A 细胞的皮层星形胶质细胞和海马神经元表达红色荧光 TED 载体，并用低亲和力钙指示剂标记。Fluo-4 AM。这种荧光钙离子探针复合物定位于所有细胞类型的内质网中。该图显示了被Fluo-4 AM标记的胶质细胞。在CIN处理过程中，如果细胞的质膜在CIN处理前后均受到损伤，则可见明显的细胞质荧光标记。这表明，荧光染料Fluo-5N也会被内源性酯酶释放到细胞质中。本实验中，用Fluo-5N对培养的海马神经元进行TED标记后，通过环状酸（cyclonic acid）这一钙阻滞剂诱导内质网钙耗竭。注意，此处所示为经ATP刺激的小鼠皮质星形胶质细胞的时间推移序列，可观测到每个感兴趣区域的平均荧光密度发生巨大变化。荧光强度急剧下降后又恢复，代表内质网钙的释放与再充填过程。同时，作为光漂白效应的结果，红色荧光蛋白的荧光强度仅出现轻微下降。部分（但非全部）实验中显示了荧光强度随时间变化的示意图。荧光值无法恢复至初始荧光强度水平，因为在刺激过程中部分Fluo-5N复合物丢失。本视频展示了一个经Fluo-5N钙复合物标记并在三磷酸腺苷（ATP）刺激下成像的、感染了羧化酶2的BHK-21细胞的高分辨率图像。请注意，ATP诱导的钙释放以及内质网（ER）钙库的再填充可在ER小管的精细结构中被观察到。在进行该操作时，需牢记只有完全健康的细胞才会表现出正常的生理钙反应。因此，我们建议在同一天使用同一批细胞进行一系列相互关联的钙稳态实验。根据我们的经验，使用五个 N 的染料荧光效果最佳，但这种钙指示剂的抗漂白能力较弱。因此，该方法将受益于开发出更具抗漂白性、低亲和力的钙指示剂。观看本视频后，您应能充分理解如何使用合成的低亲和力钙离子指示剂对胞外钙瞬变进行成像。这些指示剂可使您以高时间分辨率监测胞外钙离子动态变化。因此，我们的方法可能有助于研究突触可塑性相关的钙信号级联反应，并可用于监测神经退行性疾病细胞模型中钙稳态的变化。

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科研

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生物学

直接成像诱导ER钙有针对性的酯酶染料装载（TED）

内质网在蛋白质生物合成和钙稳态中起关键作用。我们已建立一个实验系统，可用于研究Ca2+泄漏通道的作用，并表征其可能的调控机制。该系统包括siRNA介导的基因沉默和活细胞Ca2+成像。...

活细胞钙成像结合siRNA介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的Ca2+渗漏通道及其调控机制

本文的目的是展示一种利用数字免疫荧光显微镜优化大鼠软脑膜动脉切片中雌激素受体-α（ERα）免疫荧光检测的方法。...

使用数字免疫荧光显微镜对大鼠软脑膜小动脉中雌激素受体-α的成像

利用钙离子敏感型指示剂染料的AM酯形式，可检测发育中神经元网络的自发活动。通过单光子或双光子成像技术，可观察到指示剂荧光的瞬时变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变，指示神经元的激活状态。该方案可适用于多种依赖发育阶段的神经元网络研究。 体外.

发育中皮层网络的功能性钙成像

我们描述了用于研究转染的荧光蛋白在内质网（ER）中分布与移动性的成像方法，该方法通过共聚焦成像技术对活细胞进行观察。同时，我们还从超微结构层面分析了这些蛋白表达对该亚细胞区室结构的影响。...

培养细胞中内质网亚区室的可视化

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。...

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

内质网钙稳态在多种病理状态下受到破坏。一种分泌型内质网钙监测蛋白（SERCaMP）报告系统可用于检测内质网钙库的异常变化。本方案描述了使用该报告系统的具体方法。 高塞氏菌 利用荧光素酶SERCaMP检测内质网钙离子稳态 体外 和 体内.

利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

我们介绍了靶向基因编码钙离子指示剂（GECI）CatchER 的应用方案+ 用于通过实时荧光显微镜监测 HEK293 细胞和骨骼肌 C2C12 细胞内质网/肌浆网（ER/SR）中快速钙瞬变的方案。一种用于 原位 Kd...

使用靶向 Ca2+ 传感器 CatchER+ 监测内质网/肌浆网钙释放

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。...

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。...

转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

本方案描述了用于高通量药物筛选和毒性检测的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）中触发细胞活动的全光学控制与观测方法。展示了在时间和空间上对表型模式进行多参数定量分析的结果，并演示了药物在数小时内产生的长期效应或在数天内进行的连续测量。...

用于毒性测试和表型药物筛选的诱导多能干细胞衍生心肌细胞中钙信号的高通量光学调控与记录

学习靶向酯酶诱导染料装载（TED）方法，利用重组羧酸酯酶在内质网中解掩蔽低亲和力钙指示剂染料，实现活细胞内质网钙动态的直接荧光成像。该技术为研究细胞钙信号传导机制提供了高分辨率工具。

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术对内质网钙的直接成像

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