Name: 一种新型的高分辨率在体内成像技术研究肿瘤生长及治疗颅内结构的动态响应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习利用双光子共聚焦显微镜结合荧光嵌合小鼠模型，对颅内肿瘤血管化进行高分辨率单细胞动态成像。该技术可实时观察骨髓来源祖细胞向脑血管的募集过程，为研究脑肿瘤新生血管机制及药物递送评估提供重要平台。

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我们感谢公主玛格丽特医院先进光学显微镜中心，特别是詹姆斯·琼克曼（James Jonkman），在双光子显微镜通道初始设置过程中提供的帮助。作者感谢时空靶向与辐射反应放大（STTARR）项目及其相关资助机构。我们感谢彼得·通格（Peter Tonge）博士、伊阿科沃斯·迈克尔（Iacovos Michael）博士和安德拉斯·纳吉（Andras Nagy）博士提供VEGFTrap质粒，并对本文稿提出修改意见和反馈。BTRC工作人员持续的支持与讨论极具价值，我们谨以此纪念阿比杰特·古哈（Abhijit Guha）博士在科学方面的重要贡献。本研究工作由加拿大健康研究院（CIHR）和美国国立卫生研究院（NIH）资助项目提供经费支持。

所有动物实验均在动物护理与使用委员会批准的方案下进行，并严格遵守所有相关指南、法规及监管机构的要求。
如需故障排除，请参考表 2。
1. 骨髓重建（可选）图1（准备30分钟，每只小鼠5分钟）
所有手术操作均应使用经高压灭菌的无菌器械，并严格遵守无菌技术进行。
一只供体小鼠可重建三只受体小鼠。
<ol>
	<li>将受体 NODscid 小鼠麻醉，并用铅板遮蔽头部后，置于 Gammacell 40 'exactor' 照射器中心位置。</li>
	<li>对 NODscid 小鼠进行 2.5 Gy 全身照射（TBI）。</li>
</ol>
关键步骤：由于不同小鼠品系在实现足够宿主免疫细胞清除时所需的剂量存在差异，可能需要对TBI进行优化。
暂停点：宿主小鼠可预先进行照射，但应在照射后24小时内使用。
<ol start="3">
	<li>根据机构动物护理委员会的指南对供体小鼠实施安乐死。清洁后肢，取出两侧的胫骨和股骨，并剥离骨骼上所有多余的组织 （图 1ai、1aii）。</li>
</ol>
关键步骤：腓骨因骨髓腔过于狭窄，不可用于实验。
<ol start="4">
	<li>从四根已提取的骨骼两端去除骨端板，并使用22 G针头和1 mL无菌PBS冲洗，直至骨骼呈白色外观（图1aiii）。参见表2。</li>
	<li>充分混匀提取的骨髓（BM）悬液，将300 μl分装至三支27 G结核菌素注射器中。提取的BM应含有约2 × 107个细胞，足以用于3只受体小鼠的重建。参见表2。</li>
	<li>将悬液注射至步骤1.1中预先经辐照处理的三只NODscid小鼠的侧尾静脉（图1b）。参见表2。</li>
</ol>
注意：为检测注射用骨髓的无菌性，建议将剩余的骨髓进行平板培养24小时以检查是否存在污染。此时小鼠死亡的主要原因是新重建小鼠体内的感染。
2. 颅窗制备 - 图2（每只小鼠30分钟）
所有手术均应使用经高压灭菌的无菌器械，在严格无菌技术下进行，并在保温灯下操作以保持动物体温 （图 2A）。
<ol>
	<li>使用IACUC批准的麻醉剂Avertin，按0.5 mg/g剂量进行腹腔注射，麻醉受体NODscid小鼠，并将其置于Gammacell 40“exactor”辐照仪中心位置，用铅板遮蔽头部。去除头皮毛发，并涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水。</li>
	<li>先用聚维酮碘溶液清洁头皮，再用酒精擦拭，然后从双耳中点至双眼上方做一正中切口。沿切口两侧各去除3 mm宽的头皮组织，暴露颅骨及颅骨表面解剖标志(图2Bi)。</li>
	<li>注射2%利多卡因-肾上腺素混合液以抬升骨膜，并将其从颅骨表面钝性分离(图2Bii)。</li>
	<li>使用2.7 mm直径的环钻，在右侧大脑半球顶叶的lambda与bregma之间、对应皮层区域的颅骨上钻出一个2.7 mm的环形薄弱区。切勿用钻头穿透颅骨(图2Biii)。参见表2。</li>
</ol>
关键步骤：若钻孔穿透颅骨，将损伤脑表面，导致额外创伤而影响实验结果。此外，还会发生大量出血，从而无法形成清晰的观察窗。
<ol start="5">
	<li>使用解剖镊子和牙科钩，施加谨慎但可控的力度，移除已削弱的骨瓣 (图 2Biii)。</li>
	<li>（可选） 若需观察肿瘤病理，可将选定的肿瘤细胞系（携带荧光报告基因）注入第 2.5 步所形成的窗口中心。
	<ol>
		<li>用 10 μl 30 G Hamilton 注射器吸取细胞悬液，并将针头装入立体定位仪。 
		关键步骤： 细胞数量需根据所用肿瘤细胞类型及所需的生长时间进行优化。对于 U87 细胞培养，我们每只小鼠使用 2 × 105 个细胞溶于 10 μl 中。</li>
		<li>将小鼠固定于数字立体定位仪上，将针头对准所形成窗口的中心点。</li>
		<li>缓慢下放针头直至刚好接触皮层表面，然后重置数字坐标。</li>
		<li>将针头下插至皮层组织深 3.2 mm 处，并在 3 mm 深度进行注射。</li>
		<li>缓慢回撤针头，随后将小鼠从定位仪中取出。 
		关键步骤： 注射过程应持续 1 分钟，并在注射完成后保持针头原位一段时间，以减少回流。 
		关键步骤： 若出现轻微出血，可用无菌生理盐水灌注 1–5 分钟以止住表层出血，随后继续后续操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滴加一滴无菌 PBS 润湿脑表面，以保持脑组织湿润。</li>
	<li>将一片 3 mm 盖玻片轻置于脑表面，使其完全密封 2.7 mm 的窗口区域。参见表 2。</li>
	<li>擦干周围颅骨，然后在整个暴露的颅骨表面涂抹 Vetbond，以重新封闭头皮组织与颅骨，并固定盖玻片位置。切勿过量使用，否则会渗入玻璃下方，降低成像效果。</li>
	<li>配制新鲜的牙科丙烯酸粉末与溶液（约 30% w/v），并涂抹于 Vetbond 表面。为确保密封严密，丙烯酸应略微覆盖盖玻片边缘 (图 2Biv)。参见表 2。</li>
</ol>
警告：牙科 丙烯酸树脂危害性极高，因此我们建议在整个操作过程中佩戴手套和口罩。
关键步骤： 在塑形过程中，牙科丙烯酸树脂必须保持可塑性，以确保良好的密封性并减少多余材料。若丙烯酸树脂在窗口处堆积，将导致图像模糊。
<ol start="11">
	<li>将小鼠置于温暖的笼子中恢复。</li>
</ol>
3. 立体定向放疗（可选）- 图3（每只小鼠25分钟）
不同辐照装置之间存在差异，因此需要进行优化。我们使用了一台定制设计的辐照装置。
<ol>
	<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉，诱导浓度为4%，术中维持浓度为1.5-2%，同时给予0.5-1升/分钟的氧气2 1 分钟，然后放入立体定向辐照仪内的定制头部固定器中 （图3Ai）。</li>
	<li>使用X射线管在40 kVp、0.05 mA条件下，通过2 mm铝滤过器获取360°锥形束CT扫描图像。利用该图像引导载物台移动，将辐射等中心定位至右侧半脑，并确保其在背腹方向上居中。</li>
	<li>插入半球形准直器，8 mm × 11 mm 挡块。</li>
</ol>
关键步骤：准直器可针对多种不同装置进行设计，因此可优化以包含或排除大脑的不同区域。8 mm × 11 mm 定义了大脑的一个半球区域。
<ol start="4">
	<li>通过准直器从上方（AP方向）和下方（PA方向）获取单个CT正交图像，以进一步优化脑部位置的确定，可利用解剖骨性结构确保可重复性。</li>
	<li>将铝滤片更换为0.93 mm铜治疗滤片，然后在X射线管以225 kVp和13 mA运行的条件下，从上方沿AP方向给予所需辐射剂量的一半。</li>
	<li>将机架返回到底部位置，再次在X射线管以225 kVp和13 mA运行的条件下，从下方沿PA方向给予剩余一半的辐射剂量。</li>
</ol>
关键步骤：必须从顶部和底部同时进行照射，以减少脑组织中的室温梯度，这也有助于将等中心对准脑部中心。
4. 体内 双光子激光显微镜观察 - 图3（每次1-3小时）
不同显微镜之间存在差异，因此需要进行优化。我们使用了蔡司（Carl Zeiss）LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜。
<ol>
	<li>使用IACUC批准的麻醉剂Avertin，按0.5 mg/g剂量进行腹腔注射，使小鼠麻醉，并用酒精喷雾清洁窗口。</li>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>（可选） 在成像前5-10分钟，通过尾静脉注射标记的血管染料。使用剂量为0.35 μg/g的Alexa647-葡聚糖或0.2 μg/g的APC-CD31。参见表2。</li>
		<li>（可选） 在成像前5分钟，按7.7 mg/kg剂量通过尾静脉注射荧光素钠，以界定肿瘤边界。参见表2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据所用嵌合小鼠中荧光染料的类型，在共聚焦显微镜上设置相应的通道。表1列出了本模型中描述的通道设置。</li>
	<li>将小鼠倒置于可移动的显微镜载物台上，并用可塑性橡皮泥固定头部位置。图3Aii。参见表2。</li>
</ol>
关键步骤：ICW 必须与激光点垂直，因此需水平放置，以确保成像效果最佳。
<ol start="5">
	<li>打开第一通道激光器，并用于将视野定位至 ICW 的中心位置。</li>
	<li>使用 5 倍镜获取整个窗口的图像，作为后续更高分辨率图像的定位参考图。</li>
	<li>应使用 10 倍和 20 倍“长工作距离”物镜进行成像，以获得最佳图像质量。</li>
</ol>
关键步骤： 使用基因工程细胞设置双光子显微镜的通道和物镜 体外 在对小鼠模型进行成像之前，确保它们能够正确突出相应的荧光染料。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>荧光染料</td>
			<td>CFP</td>
			<td>GFP / 荧光素 / FITC</td>
			<td>mCherry / RFP / DsRED</td>
			<td>APC / Alexa647</td>
			<td>SHG 自发荧光</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>激发激光</td>
			<td>458 nm</td>
			<td>488 nm</td>
			<td>543 nm</td>
			<td>633 nm</td>
			<td>Chameleon 激光 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收集滤光片</td>
			<td>480–520 nm</td>
			<td>500–550 nm</td>
			<td>565–615 nm</td>
			<td>650–710 nm</td>
			<td>390–465 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 荧光染料设置。 为用户提供的指南，用于查看该型号仪器各通道所使用的激发激光器和发射光谱收集器。

<ol><li>Kienast, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).</li>
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<li>Purhonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+circulating+endothelial+precursors+do+not+contribute+to+vascular+endothelium+and+are+not+needed+for+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

迄今为止，所有图像中描述的三个通道可互换用于其他模型中三种目标标记物，为研究人员提供了一套极为宝贵的工具，可用于观察多种细胞类型及其相互作用。在实验设计时需进行周密规划，以确保所有标记物和细胞类型均已成功整合报告荧光分子，并分别位于不同的通道中。
除了此处使用的标准三通道外，我们还成功整合了第四通道CFP通道 （图4A） 基于SHG的胶原蛋白通道 7 (图4B）。 这扩展了观察细胞间相互作用的可能性 体内 此外，该方法允许用户进行细胞群体混合，以研究特定的细胞间相互作用，同时保留两个通道用于其他标记物的检测。例如，我们以1:3的比例混合了肿瘤细胞（RFP）和肿瘤干细胞（CFP），旨在比较它们在肿瘤内部的相互作用 （图4A）。 我们观察到，在混合细胞群植入后第7天，该比例仍然维持，且两种细胞群仍可被观察到。
由于CFP通道在激发光谱和发射光谱上均与GFP通道存在重叠，因此在技术上存在挑战，需要通过成像后处理来区分真正的CFP+细胞与实际为GFP+的细胞。成像后处理可直接在配备Zeiss LSM软件的双光子显微镜上进行，通过将GFP图像从CFP图像中减去，从而保留真正的CFP细胞（图4A）。该比值相减方法的前提是两幅图像亮度相当，原因是CFP激光（458 nm）可同时激发CFP和GFP细胞，而GFP激光（488 nm）波长过高，无法激发CFP细胞。除了CFP外，我们还利用先前已发表的实验设置检测了SHG信号水平，从而可视化构成血管周围基底膜的胶原纤维（图4B）。
该模型的另一种改进利用了一种定制的小动物辐照仪，该仪器能够使用立体定向引导的辐射技术，对直径小至2 mm的组织区域进行辐照。通过针对窗口区域进行辐照，可以观察辐射对下方组织的影响。我们近期发表了一项研究，探讨辐射对正常脑组织的影响，特别是关于骨髓来源细胞（BMDCs）向血管系统的募集及其在辐射后组织改变中的作用。研究发现，在正常组织中，BMDCs的募集具有时间和剂量依赖性11。
通过使用荧光标记物标记药物，研究治疗药物的递送与整合机制是可行的。在我们的研究过程中，我们成功追踪了VEGFTrap的产生情况，这是一种抗血管生成药物，可阻断局部产生区域内的全部VEGF信号通路25。通过基因改造使肿瘤细胞表达与IRES连接的VEGFtrap基因，并结合EGFP （图4Ci），同时使用RFP标记的骨髓（BM）作为“供体”，我们能够同时成像EGFP:VEGFtrap的表达、骨髓来源细胞（BMDC）的相互作用以及血管系统 （图4Cii）。这展示了该模型及可用成像通道的多功能性。此外，由于具备单细胞分辨率的潜力，研究药物动力学也是可行的。荧光素（GFP+）在手术中用于界定肿瘤边界，以确保实现最大程度的切除 26。通过在成像过程中静脉注射荧光素，可以证明这种边界界定并非通过肿瘤细胞主动摄取荧光素实现，而是随着时间推移，药物在间质区域聚集所致；在注射荧光素后10分钟内缺乏共定位现象即可证明这一点 （图4D）。
总体而言，我们的策略结合了新颖技术和现有技术，构建了一个独特的实验平台，有利于研究动态的细胞相互作用。该策略已被证明是一种极为宝贵的方法，可用于在颅内环境下，以高分辨率研究骨髓来源树突状细胞（BMDC）、肿瘤以及正常脑血管系统在治疗响应过程中的单细胞动态演化。活体成像技术有助于更深入理解BMDC在颅内脑肿瘤血管系统中的募集、迁移和分化等分子调控机制，同时也适用于其他多种动态生物学过程，并可拓展至其他研究领域。通过抑制调控BMDC的潜在因子，并与其他治疗策略联合应用，有助于确定联合治疗的最佳时机。此外，该策略还可拓展至众多未来研究项目，不仅可利用in vivo活体染色染料，还可结合使用荧光标记的小分子抑制剂和纳米颗粒，使研究人员能够追踪更特异性治疗药物的分布与迁移模式，并对它们的动力学进行长期纵向观察。

深入了解大脑在应对各种病理状态及治疗干预时所发生的结构和生物学变化，对于改进治疗策略至关重要。然而，当前研究这些结构和生物学变化面临的一个挑战是组织难以获取，且无法在活体环境中研究这些变化的时间演化和动态进展过程。此前，“窗口”技术的开发已被证明可成功用于观察肿瘤发展过程中的软组织变化5-7。由于需要在不损伤或引发脑组织感染的前提下移除颅骨，颅窗（ICW）模型的建立在技术上更具挑战性。以往研究曾尝试通过磨薄颅骨来实现组织可视化8-10，但要获得高分辨率的清晰图像，必须完全去除颅骨11。重复性的长期成像（30天以上）直到最近才通过成像技术成为可行方案1,11，而此前的研究多局限于较短的时间范围5。
在过去十年中，一个主要目标是阐明在病理刺激（特别是肿瘤形成和进展）后新生血管的来源，以提供治疗肿瘤的新型治疗靶点。关于在脑部肿瘤发展或放疗后新生血管的来源，目前仍存在较大争议。传统上认为，血管生成是通过血管发生（angiogenesis）实现的，即新血管由已有血管出芽形成12。然而，近年来的研究表明，过去被认为仅存在于胚胎发育过程中的血管发生（vasculogenesis）可能在病理性血管形成中发挥更为重要的作用。血管发生涉及从骨髓中募集成体血管母细胞的对应细胞，这些细胞随后直接参与新血管内皮的形成12-14。越来越多的证据表明，内皮前体细胞在致癌介质的作用下从骨髓中动员，以启动de novo（从头）血管形成15-17。然而，这些研究对于骨髓来源细胞（BMDCs）是否直接参与血管内皮构成提供了相互矛盾的证据，其贡献比例因病理刺激类型及对治疗的反应不同而有所差异18-21。
因此，建立可重复的实验方法，实现高分辨率的活体成像，以长期反复研究骨髓来源细胞（BMDC）整合入肿瘤血管系统的过程及其对治疗的反应，具有重要价值。传统的组织学技术无法提供确定这些形成新生血管的细胞长期存活、分化和整合所需的动态信息，因而无法明确证实细胞间相互作用的机制。
我们通过实验方法表明，颅内电离辐射和肿瘤生长均会引起不同程度的骨髓来源树突状细胞（BMDC）募集，但这种募集具有病理部位特异性，并不会侵入整个颅内组织。 11,22我们已证明，通过单个动物的重复成像，可观察到招募过程遵循一种具有时间敏感性的模式。 11,22同样地， 在体内 成像技术还可为肿瘤细胞拟态提供极为宝贵的见解，通过使用荧光标记的肿瘤细胞并结合体内CD31抗体对内皮细胞进行染色，可实现对肿瘤细胞的成像与追踪，从而揭示肿瘤细胞转分化为自身内皮结构的潜在能力。
该模型的多功能性得益于可同时成像4个荧光通道的能力，为研究不同的细胞和生物学过程提供了极为丰富的组合方式。我们能够在同一视野中，随时间重复地同时进行活体成像，检测CFP（蓝色）、GFP（绿色）、Cherry/RFP（红色）以及Alexa647/APC（远红）信号。研究人员可通过基因改造使细胞表达各通道对应的荧光蛋白，也可购买染料和抗体以突出显示特定的结构变化。迄今为止，研究中常用的染料和抗体包括CD31和葡聚糖，二者均可标记微血管系统及其在组织中的变化1,11,23,24；尽管我们使用远红通道实现此目的，但这些试剂也可用于上述其他荧光通道。类似地，其他染料如Sytox Orange（可标记凋亡区域）以及Visen公司开发的标记物，均专为in vivo应用而设计。除上述四个常用荧光通道外，还可添加并优化第二谐波生成（SHG）通道，用于成像模型内源性的胶原纤维7，从而可视化血管周围基底膜的结构。
为了展示我们模型的适应性以及上述的细胞间相互作用，我们已能够研究药物与细胞之间的相互作用。我们研究了诸如AMD3100（一种SDF-1抑制剂）等药物抑制剂在BMDC募集相关信号网络中的作用11。类似地，我们通过基因工程改造U87胶质瘤异种移植细胞，使其表达VEGFTrap（一种VEGF抑制剂）25，并通过IRES共表达GFP分子。利用RFP+骨髓细胞，我们能够研究VEGF在BMDC向血管系统募集过程中的作用。最近，我们还利用该模型在细胞水平上研究药物动力学，探讨肿瘤显影药物荧光素（Fluorescein）发挥作用的机制26。通过使用自主研发的小动物照射装置，我们能够整合立体定向放射治疗，评估肿瘤细胞和BMDC对治疗的反应。
通过使用我们创新的活体成像方法，研究人员将能够深入了解各种病理状态和生物系统中发生的单细胞实时变化，有助于阐明组织变化的诸多功能与生物学特征。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NODSCID 小鼠</td><td>Jackson Lab</td><td>001303</td><td>8 周龄</td></tr><tr><td>B5/EGFP 小鼠</td><td>Jackson Lab</td><td>003516</td><td></td></tr><tr><td>ACTB/DsRED 小鼠</td><td>Jackson Lab</td><td>005441</td><td></td></tr><tr><td>眼用凝胶</td><td>诺华（Novartis）</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>2% 利多卡因-肾上腺素</td><td>Bimeda MTC</td><td>25SP</td><td>直接使用</td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>自固化丙烯酸树脂套件</td><td>Bosworth</td><td>166260</td><td>使用约 30% (w/v)</td></tr><tr><td>10K 分子量 Dextran-Alexa647</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td>在生理盐水中按 0.6 mg/kg 使用</td></tr><tr><td>CD31-APC</td><td>BDPharmingen</td><td>551262</td><td>在生理盐水中按 0.3 mg/kg 使用</td></tr><tr><td>AK-fluor（荧光素）10%</td><td>AKORN 公司</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>在生理盐水中按 7.7 mg/kg 使用</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>普渡制药（Purdue Products）</td><td>NDC 67618-150</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>精细解剖剪刀</td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>22G 针头</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>27G 0.5 ml 注射器</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>手持式微型钻机</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>2.7 mm 环钻钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-27</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;l 30G Hamilton 注射器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>20909-U</td><td></td></tr><tr><td>3 mm 玻璃盖玻片</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720 CS-3R</td><td></td></tr><tr><td>荧光护目镜</td><td>BLS</td><td>FHS/T01</td><td>基础头架</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>stoelting</td><td>51950</td><td></td></tr><tr><td>小鼠静脉注射固定器</td><td>Brain Tree Lifescience</td><td>MTI</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型高分辨率 体内 研究颅内结构对肿瘤生长及治疗动态响应的成像技术

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

我们已成功将先前建立的颅窗（Intracranial window, ICW）技术1-4与活体双光子共聚焦显微镜相结合，开发出一种新型平台，可直接长期观察颅内组织结构的变化。以单细胞分辨率进行实时成像，能够提供超出传统终点组织学分析的动态信息，后者仅能观察组织的“快照式”横截面。
在荧光嵌合小鼠中建立这种活体成像技术后，我们能够同时对四个荧光通道进行成像。通过引入荧光标记的细胞（例如GFP+骨髓细胞），可以追踪这些细胞在组织内的长期迁移、整合与分化命运。进一步引入第二类报告细胞（例如mCherry标记的胶质瘤细胞系），则可实现对细胞间相互作用的表征。通过加入活体染料和抗体（例如CD31标记的抗体和葡聚糖分子），还可突出显示组织微环境中的结构变化。
此外，我们描述了将我们的ICW成像模型与一种可提供立体定向照射的小动物微照射装置相结合，从而构建一个平台，用于评估电离辐射给药后发生的动态组织变化。
本模型目前的局限性包括显微镜的穿透能力，其成像深度仅限于皮层下表面以下最多900 μm，因此成像范围局限于大脑的背侧轴向区域。颅骨的存在使得颅窗手术（ICW）相较于目前用于研究乳腺组织和脂肪垫的更为成熟和广泛应用的腔室模型5-7，成为一项更具挑战性的技术操作。此外，在优化成像条件时，ICW也带来诸多技术难题。

重建NODscid小鼠骨髓的可选步骤应使100%的NODscid“受体”小鼠中荧光标记的“供体”骨髓植入率达到80%；然而，为提高其他非免疫缺陷小鼠品系的重建效率，需对全身照射（TBI）条件进行优化。若小鼠骨髓重建失败，将在操作后迅速发病并死亡；体质虚弱的小鼠可能需要额外的食物和水源。
完成后的颅窗应如图2Biv所示。在玻璃盖玻片周围形成一圈丙烯酸树脂边缘是理想的，因为这可以增强其与颅骨连接的强度。理想的颅窗可重复制作，并可在制备后支持长达8周的重复成像（图2C）。通过这些优质颅窗获得的图像应如图3Bi所示。颅窗制备过程中的缺陷将导致图像质量下降，例如，颅窗下存在气泡会阻碍整个视野的成像，由于空气阻挡激光成像，相应区域将呈现黑色（图3Bii）。若盖玻片上胶水或丙烯酸树脂过多，则会产生较强的背景荧光，并出现视野部分被遮挡的现象，如图3Biii所示；同样，若颅窗表面有污物，则视野中将可见少量背景荧光小点（图3Biv）。
ICW 成像的成功取决于手术技术的完整性，然而即使是最理想的 ICW，在成像过程中仍可能出现问题。因此，所获得的图像在清晰度上存在一定的范围和程度，如图3所示。图3C所示的出版级图像是在所有条件均最优时获得的。尽管并非所有小鼠都能达到这一效果，但有理由期望生成的图像中约80%能达到此类质量。当前显微镜系统的一个主要缺陷在于使用了倒置激光扫描显微镜。小鼠必须仰卧放置，这会导致其承受过度的应激和不适，可能在成像期间引发呼吸困难。这会产生“条纹状”图像，因为呼吸运动会干扰成像过程中的信号平均化——每个像素行会被成像四次，最终图像显示的是这四次成像的平均值。在信号平均过程中发生的任何移动，例如由呼吸困难引起的移动，都会产生条纹状伪影，如图3D所示。成像过程中麻醉不足的小鼠也可能出现这一问题。通过关闭图像平均功能可在一定程度上减轻“条纹”效应，但这会相应降低图像质量，且未必能完全消除问题。另一种解决方法是在小鼠呼吸恢复正常后重新定位或重新尝试成像。若采用直立式双光子显微镜（2PLM），则可避免此问题，因为小鼠可在俯卧位下进行成像。在倒置2PLM上成像的另一个问题是，一旦小鼠被放置在显微镜上，ICW的定位操作空间受限，从而导致出现如图3E所示的“分段”图像。此时激光与盖玻片未保持相互垂直，导致成像角度倾斜，结果是视场两侧区域未能被成像，形成“分段”图像。该问题可通过重新调整小鼠位置轻松解决，确保其固定在头部夹具上后盖玻片完全水平，如图3Aii所示。
本文所展示的模型专门用于研究骨髓来源树突状细胞（BMDCs）在肿瘤组织血管化过程中的作用，并展示了可同时使用三种不同通道（Cherry、GFP、远红光——Alexa647 和 APC）进行成像的能力，因此在此特定研究中，CFP 和 SHG 通道变得冗余。我们能够对小鼠进行长达 8 周的纵向成像，以单细胞水平研究骨髓细胞向血管系统的募集与整合过程，且成像窗口未引起任何不良影响。该模型表明，相较于以往因终点组织学分析而丢失的信息，现在可便捷地获取有关血管来源、形成过程以及不同类型目标细胞间相互作用的动态信息。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>问题</td>
			<td>原因分析</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4</td>
			<td>骨骼碎裂</td>
			<td>使用钝器</td>
			<td>使用锋利的剪刀或新的手术刀片从新鲜小鼠中采集骨髓；骨碎片会抑制TV注射</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td>提取量低（黏度低）</td>
			<td>骨终板切割位置过于远端；收集方法不佳</td>
			<td>应尽可能靠近近端切割骨骼，并将骨骼放入收集管中进行收集，以防止液体飞溅 
			应花费足够时间仔细充分地提取骨髓 
			如有必要，可将多只小鼠的骨髓合并至1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>提取量过高（黏度过高）</td>
			<td>收集缓冲液体积不足</td>
			<td>用额外的0.1% BSA稀释溶液，最多分注至三只受体小鼠，每只最多500 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6</td>
			<td>静脉注射效果差</td>
			<td>血管扩张不良，血管可视性差</td>
			<td>使用加热灯增强血管扩张。将小鼠置于内置光源的尾静脉固定器中，以方便操作</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>小鼠生病</td>
			<td>感染</td>
			<td>根据机构规定处死小鼠。注射前确保尾部清洁，并在培养中检测提取骨髓的无菌性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>小鼠死亡</td>
			<td>骨髓摄取不良</td>
			<td>检测死亡小鼠骨髓荧光摄取率。 
			针对所用小鼠品系优化TBI条件 
			增加骨髓注射量（例如，一只供体小鼠用于两只受体）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4</td>
			<td>轻微出血</td>
			<td>钻孔时损伤硬脑膜</td>
			<td>使用凝胶垫加压并持续用无菌生理盐水冲洗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>严重出血</td>
			<td>钻孔导致脑组织损伤</td>
			<td>根据机构指南处死小鼠</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8</td>
			<td>盖玻片下出现气泡</td>
			<td>与皮层表面接触不良，导致放置不当</td>
			<td>取下盖玻片，加入额外PBS使盖玻片漂浮到窗口上，以去除气泡</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.10</td>
			<td>粘合过程中盖玻片滑动</td>
			<td>丙烯酸胶质量大，对盖玻片施加压力，导致其移位</td>
			<td>应用Vetbond和丙烯酸胶时，应使用镊子固定盖玻片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.2</td>
			<td>静脉注射效果差</td>
			<td>血管扩张不良，血管可视性差</td>
			<td>使用加热灯增强血管扩张。将小鼠置于内置光源的尾静脉固定器中，以方便操作</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.4 
			图3C</td>
			<td>图像呈“条纹状”</td>
			<td>呼吸费力或不规则</td>
			<td>将小鼠从成像架上移开，让其恢复 
			增加麻醉剂用量，并调整体位，确保颈部不过度屈曲或伸展，以保障正常呼吸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>图3C</td>
			<td>图像呈“分段状”</td>
			<td>脑组织与物镜不平行</td>
			<td>调整盖玻片位置，确保其平整</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>无法观察到血管</td>
			<td>未见血管内注射信号</td>
			<td>重新向另一条尾静脉注射，加热尾部以确保良好血管扩张</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>背景信号过高</td>
			<td>盖玻片脏污， 
			存在气泡，丙烯酸胶污染</td>
			<td>用湿润的70%乙醇布擦拭盖玻片，切勿浸泡，以免液体渗入丙烯酸胶下方损伤脑组织</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 故障排除。 针对实验步骤中出现问题的部分所需采取纠正措施的指导方案。
<img alt="颅内窗制备示意图；小鼠模型、胶质瘤注射、治疗时间线。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Schemata 1"> 
示意图 1. 实验流程图。 本图展示了实验步骤1-4中的事件时间线。小鼠模型需建立约一周时间，以确保骨髓（BM）充分重建，并在成瘤后第7天才开始给药治疗，以保证肿瘤移植物成功植入。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363schemata1large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="小鼠腿部解剖过程，步骤i-iii；解剖示意图；静脉、动脉、静脉注射部位。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 骨髓重建。(A) 骨髓提取步骤 i. 后肢骨的解剖。 ii. 从后肢分离出的股骨和胫骨，已清理干净，准备进行提取。 iii. 去除骨端板并冲洗后的骨骼，显示空骨呈白色外观。 (B) 示意图显示尾部侧静脉注射部位的位置。
<img alt="啮齿类动物颅脑手术过程；手术器械与步骤；神经科学实验装置。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 颅窗（ICW）制备。 (A) 推荐的无菌操作设置 (B) i. 暴露的颅骨表面显示手术所需解剖标志，颅窗应置于右侧半球，距前囟（bregma）与后囟（lambda）等距处。 ii. 用利多卡因溶液抬起骨膜，准备去除。 iii. 使用牙科钩清除钻孔产生的骨碎片。 iv. 使用牙科丙烯酸树脂完成颅窗制备。 (C) 三个示例窗口展示了该方法的可重复性。
<img alt="小鼠颅窗成像装置示意图；图中显示由于伪影导致的理想与缺陷成像效果。" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 双光子激光扫描显微镜（2PLM）预期结果。所有图像中，绿色代表基底膜（BM），红色代表肿瘤，蓝色（伪彩的远红通道）代表血管系统。 (A) i. 显示用于固定小动物照射器内异氟烷气流的头部固定架。图中还可观察到8 × 11 mm的准直器在机架中移动。 ii. 小鼠倒置固定于成像所需的头部固定架中，可塑性橡皮泥确保适用于各种颅窗。 (B) 展示颅窗制备过程中可能出现问题的代表性照片：i. 理想的颅窗；ii. 颅窗下方困有气泡；iii. 盖玻片上溢出丙烯酸树脂；iv. 颅窗表面存在污物。 (C) 突出显示颅骨内颅窗（ICW）成功制备后成像过程中可能出现的问题：i. 理想成像；ii. 呼吸伪影导致图像呈现“条纹状”；iii. 盖玻片未与激光束垂直，导致图像呈“分段状”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="Multichannel fluorescence microscopy, tumor analysis, SHG collagen, VEGFTrap visualization, in vitro/in vivo." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 模型的功能用途与适应性 （A） CFP 图像后期处理，通过从 CFP 图像中减去 GFP 图像，获得真实的 CFP 图像，可用于以白色叠加到其余三个通道上。 绿色 BM，红色肿瘤，白色 CSCs，蓝色（伪彩远红）血管 （B） 可利用二次谐波成像技术观察到的胶原纤维示例。 绿色葡聚糖，红色基质，青色胶原 (C) i. VEGFTrap 细胞 体外 展示使用VEGFtrap产生的GFP信号。 ii. 在体 成像清晰地展示了VEGFtrap细胞，同时突显了切换通道的便捷性，便于展示所观察的系统。 绿色 VEGFTRap + 肿瘤，红色 BM，蓝色（伪彩远红）血管系统。 （D） 显示荧光素在肿瘤间质中聚集，而未直接进入细胞内，表现为绿色信号与红色肿瘤无重叠绿色 荧光素，红色肿瘤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig4large.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>.

我们描述了一种新型 体内 一种将荧光嵌合小鼠与颅窗技术及高分辨率双光子显微镜相结合的成像技术。该成像平台有助于在单细胞水平上研究脑组织和微血管系统在病理损伤后的动态变化，并可适用于评估药物在颅内的递送与分布情况。

我们已成功将既往建立的颅窗（Intracranial window, ICW）技术1-4与活体双光子共聚焦显微镜相结合，开发出一种……

本实验的总体目标是，通过观察骨髓来源的前体细胞在正常脑组织及脑肿瘤相关血管中的归巢模式随时间的变化，获得这些细胞的高分辨率单细胞图像。该目标通过以下步骤实现：首先，从供体小鼠中分离胫骨和股骨以获取荧光标记的骨髓前体细胞，随后将这些细胞注射到经辐射处理的受体小鼠体内。第二步是在嵌合小鼠的颅窗装置内建立颅内胶质母细胞瘤（GBM）异种移植模型。接下来，小鼠将接受多种治疗方案，包括立体定向引导的放射治疗。最后一步是在双光子共聚焦显微镜上对小鼠进行成像。最终，该方法可用于在多种模型中动态研究颅内血管化机制。与现有的离体组织病理学等方法相比，该技术的主要优势在于能够研究与脑内血管形成相关的关键动态信息。因此，我们可以解答围绕颅内新生血管形成机制的核心问题。尽管该方法可用于深入了解颅内新生血管化过程，但它也可应用于脑内的其他系统和疾病过程，例如颅内缺血或脑卒中、神经退行性疾病，以及肿瘤细胞向脑部转移的机制。本视频出于演示目的，未能遵循严格的无菌操作技术。因此，生物安全柜的开口超过12英寸，且未对动物进行铺巾，以便观众更清晰地观察操作过程，并更好地理解实验操作的步骤。实际实验工作中应严格遵守无菌操作规范。开始此操作前，需确认GFP供体小鼠的荧光表达情况，并根据机构动物护理委员会的指南将其实施安乐死。随后，在无菌条件下清洁双侧后肢，分离胫骨和股骨，并去除骨骼上所有多余组织。然后从四根已取出的骨骼两端去除骨端板。使用22号针头和1毫升无菌PBS冲洗骨骼。当所有骨髓均被彻底冲洗干净后，骨骼将变得透明。随后，混匀提取的骨髓悬液。该悬液应含有约2000万个细胞，足以用于三只受体小鼠的重建。接下来，准备3支27号结核菌素注射针，分别吸取300 µL骨髓悬液。当小鼠置于固定器中时，标记尾部背侧表面以确定方位。然后将悬浮液注射至三只预先经辐照的小鼠的尾侧静脉。在此操作过程中，于无菌条件下使用嵌合型骨髓 nod skid 小鼠。对嵌合型骨髓 nod skid 小鼠进行麻醉，并给予经 IACUC 批准的预先镇痛处理。涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水。首先用聚维酮碘溶液清洁头部，然后用酒精擦拭并去除多余的毛发。接着用酒精进一步清洁下方的头皮。从耳部中点至眼睛上方做一切口。在第一次切口两侧去除头皮，暴露下方颅骨约五毫米。然后识别颅骨表面的解剖学标志。接着，通过注射含肾上腺素的2%利多卡因溶液，识别并抬起骨膜。随后使用锐器将骨膜从颅骨表面剥离。然后使用2.7毫米TR精修钻头，在颅骨右侧半球距人字缝（Lambda）和前囟（bgma）等距处，磨薄一块直径2.7毫米的环形骨瓣。钻孔时切勿穿透骨质，以保护下方的硬脑膜及组织。现在，使用解剖器械、镊子和牙科钩，以谨慎而可控的力度移除变弱的骨瓣。接着，用30号Hamilton注射器吸取10 µL细胞悬液，并将针头安装到立体定位仪上。然后将小鼠置于立体定位仪中。将针头对准此后生成的窗口中心点，然后降低针头直至接触皮层表面。随后重置数字坐标。现在将针头向下插入皮层组织 3.2 毫米。然后回撤 0.2 毫米，并在 3 毫米深度处注射。注射应以每分钟 10 微升的速度进行。注射完成后，将针头留置原位 1 分钟，再缓慢回撤。然后将小鼠从固定架上取下。随后，使用无菌 PBS 滴液保持脑表面湿润。将一个3毫米的盖玻片放置在脑表面，以封闭2.7毫米的窗口。然后干燥周围的颅骨。接着，使用Vet Bond将头皮组织粘附到颅骨上，以固定盖玻片。切勿使用过多，否则会渗入盖玻片下方，降低成像效果。接下来，在通风橱内将新鲜的牙科丙烯酸粉末与溶液混合，并使用22号针头将混合物涂布于 Vet Bond 表面。为确保密封严密，应将丙烯酸涂至略微覆盖盖玻片边缘，但不可覆盖整个玻璃盖玻片。在此步骤中，将一只麻醉后的小鼠放入定制的头部固定器中，该固定器位于专门设计的XAD 2 25立体定向辐照仪内。使用X射线管在40千伏峰值和0.05毫安条件下，经2毫米铝滤过，获取360度锥形束CT扫描图像。利用该图像调整载物台位置，使辐射等中心对准右侧半脑，并在背腹方向上居中。有多种多样的准直器可用于靶向辐射，这体现了该模型的适应性。在此情况下，我们采用8毫米×11毫米的半球形照射准直器。将半球形准直器插入X RAD 2 25立体定向辐照器中。通过准直器从上方和下方获取单个 CT 正交图像，以定位解剖骨性结构，并在监视器上手动微调载物台位置，确保头部正确放置。将 XAD 2 25 IRRADIATOR 铝滤片更换为 0.93 毫米铜治疗滤片。然后以 225 千伏峰值电压和 13 毫安运行 X 射线管程序，并从上方以 AP 方向给予一半的辐射剂量。将机架返回到底部位置，并从底部以腹侧向背侧（PA）方向给予第二半剂量的辐射。在此步骤中，麻醉先前制备的颅窗小鼠，并用酒精喷雾清洁颅窗。根据所构建的嵌合小鼠体内整合的荧光染料，设置共聚焦显微镜的通道。或者，可重复使用先前的设置，以减少成像会话之间的变异性。在此情况下，通过尾静脉侧支注射成像所需的标记物，如用于血管造影的葡聚糖。将小鼠倒置于定制的头部固定装置上，用可塑性橡皮泥支撑，确保头部与激光垂直且平整，然后将固定装置加载到显微镜的可移动载物台上。打开第一通道激光器，并通过直接观察激光束在颅窗上的交叉点，将激光束定位至颅窗中心。使用5倍物镜对整个颅窗区域拍摄每个通道的图像，并将其作为使用10倍和20倍长工作距离物镜获取其他高分辨率图像的定位参考图。该示意图重点说明了手术过程中可能产生的技术误差，并展示了每种误差对成像结果的影响。窗口下方滞留的气泡在图像中会以气泡形式可见。玻璃上的丙烯酸积聚物在远红通道中具有自发荧光，会遮挡部分视野。同样，成像过程中窗口上的污物会在图像中表现为自发荧光的伪影。即使完美的颅窗在显微镜下也可能出现问题。呼吸伪影会导致图像出现条纹，而小鼠在支架上位置不佳则会导致图像分段。由于激光仅穿过部分组织，结合后期图像处理，可以为CFP标记的细胞添加额外通道，通过从CFP图像中减去GFP信号来揭示真实的CFP信号。此外，利用胶原四型纤维的二次谐波自发荧光特性，我们能够对血管基底膜进行成像。本研究所描述的新型镜像模型具备五个荧光通道，为使用者提供了极大的灵活性与适应性。在实施该操作过程中，需特别注意手术期间所使用的有害物质。在整个长期成像过程中，细致入微并特别关注细节也至关重要，以确保脑组织不受损伤。观看本视频后，您应能充分掌握如何构建带有荧光标记前体细胞的嵌合小鼠，并能够继而获得高分辨率的实时图像，以观察肿瘤细胞植入后颅内血管系统的变化，无论是否进行治疗干预。

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一种新型高分辨率体内研究颅内结构对肿瘤生长及治疗动态响应的成像技术

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