광학 현미경 검사를위한 조직 학적 샘플 준비
조직학은 일반적으로 가벼운 현미경의 사용에 의해 원조되는 세포와 조직의 연구입니다. 조직학적 시료의 제조는 계획된 염색 기술 또는 기타 다운스트림 응용 프로그램을 포함하는 예상 후처리뿐만 아니라 크기 및 경도와 같은 샘플의 고유 특성에 따라 크게 달라질 수 있습니다.…
조직학은 조직과 세포의 현미경 해부학의 연구를 참조 하는 용어. 가벼운 현미경 검사법에 대한 적절한 조직학적 샘플 준비는 조직 샘플에서 품질 결과를 얻기 위해 필수적입니다.
거의 모든 조직학적 절차에 공통된 3가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 시료는 조직을 보존하고 조직 저하를 늦추기 위해 고정된다. 다음으로, 샘플은 자체와 유사한 기계적 특성을 가지는 재료 또는 포함 매체에 침지됩니다. 일단 내장되면, 샘플은 마이크로토메로 알려진 정확한 절단 도구를 사용하여 얇은 조각으로 단면, 또는 절단된다. 이 비디오에서는 이러한 일반적인 단계와 이와 관련된 몇 가지 개념에 대해 설명합니다.
조직 고정은 세포 와 조직 구성 요소를 보존하고 구조를 유지하는 중요한 단계입니다. 세포 사멸 후, 자연적으로 발생하는 효소는 세포 세포세포로부터 방출되고 세포 및 세포 외 매트릭스 전체의 단백질을 저하시켜 세포의 구조를 파괴하기 시작합니다. 고정은 이러한 효소의 능력을 직접 억제하여 단백질을 소화하고 효소 분열 부위를 인식할 수 없게 함으로써 이러한 분해를 방지합니다.
고정의 두 가지 주요 메커니즘은 교차 연결 및 응고입니다. 교차 연결은 단백질 내와 그(것)들 사이 둘 다 공유 결합 형성을 관련시킵니다, 조직을 뻣뻣하게 하고 그러므로 저하에 저항하는 원인이 되는. 응고는 단백질 고등 구조를 변형시키는 알코올 이나 아세톤의 사용을 통해 단백질의 탈수에 의해 발생, 그래서 소수성, 또는 물 두려워, 영역 단백질 표면을 이동. 응고적 고정은 파라핀 왁스와 같은 미디어를 포함시켜 조직을 관통하는 데 도움이 될 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용되는 고정제 중 하나는 물에 용해 된 포름알데히드인 포르말린입니다. 고정 하는 동안, 포름알데히드는 기본 아민에 연결, 아미노산 리신과 글루타민의 측면 사슬에서 발견 하는 것과 같은 메틴 다리 라는 안정적인 크로스 링크를 형성 하기 위해. 이 프로세스는 본질적으로 느리며 최대 1-2 일이 걸릴 수 있습니다.
수정하기 전에 몇 가지 고려 사항이 이루어져야 합니다. 먼저 샘플의 확산성을 고려하십시오. 고정재는 시간의 제곱근을 곱한 고정물의 확산 계수와 관련된 속도로 조직을 통해 거리를 확산시합니다. 시료에 1mm를 침투하는 데 1시간이 걸리는 고정은 5mm를 관통하는 데 25시간이 소요됩니다. 포르말린이 조직의 중심에 도달하면 교차 연결 반응 틀이 발생해야합니다. 따라서, 샘플 크기는 적당한 시간에 철저한 고정을 위해 두께4mm로 제한되어야 한다.
둘째, 고정의 볼륨과 pH를 고려하십시오. 시약이 시간이 지남에 따라 쉽게 고갈되지 않도록 표본 대 표본 볼륨 비율은 적어도 40:1이어야 합니다. 일부 고정제는 산성 pH에서 작동하도록 설계되었지만, 포르말린은 중성 pH를 유지하기 위해 인산염으로 버퍼링할 때 가장 잘 작동하므로 과잉 산이 생성되지 않아 조직에서 유물을 유발합니다.
조직학적 제제의 다음 단계는 표본 자체와 유사한 기계적 강성을 가진 매체의 표본을 지원하는 것을 포함하는 포함입니다. 너무 뻣뻣하거나 너무 약한 경우 단면화하는 동안 결함이 발생할 수 있기 때문에 올바른 포함 매체를 선택하는 것이 중요합니다. 지금까지, 포함에 사용되는 가장 일반적인 미디어는 파라핀 왁스입니다.
파라핀 을 포함하기 전에, 견본은 에탄올로 조직의 물을 대체하여 탈수되어야 합니다, 첫째, xylenes 다음, 그리고 마지막으로 파라핀 왁스를 따뜻하게 합니다. 왁스가 시료에 침투하면 조심스럽게 배치되고 금형을 사용하여 블록을 형성하기 위해 추가 왁스로 둘러싸여 있습니다. 다음으로, 샘플은 단면화를 위한 조직 카세트에 부착됩니다.
단면은 임베딩 블록에서 샘플의 얇은 조각을 절단하는 과정입니다. 단면도는 일반적으로 가벼운 현미경 검사법과 함께 사용하기 위하여 4-10 μm 의 순서에 있습니다.
단면을 자르기 위해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드가 먼저 마이크로톤에 고정됩니다. 그런 다음 샘플이 샘플 홀더에 배치됩니다. 다음으로, 샘플은 절단 표면으로 진보하고 원하는 두께의 조각을 만들기 위해 블레이드를 가로 질러 그려집니다. 단면은 유리 슬라이드에 배치 할 수있는 얇은 리본으로 축적됩니다.
단면에 따라 샘플이 슬라이드에 배치됩니다. 파라핀 임베디드 샘플의 경우, 슬라이스는 먼저 따뜻한 수조에 넣고 물에서 밀어 내고 건조할 수 있습니다.
생물학적 조직은 내재된 대조가 거의 없으므로 조직학 후 슬라이드는 일반적으로 형태학 이나 특정 단백질을 강조하는 염료 또는 항체로 얼룩져 있습니다. 가장 일반적인 얼룩은 헤마톡시린과 에신 또는 H&E입니다. 너무 흔하기 때문에 많은 자동화 기계가 H&E. Hematoxylin이 세포의 핵을 파란색으로 얼룩지게 하고 세포균 분홍색이 조직의 세포 형태를 드러내는 것을 얼룩지게 하기 위해 만들어졌습니다.
고정에 한 가지 단점은 단백질의 교차 연결 그들의 결합 사이트를 찾기 위해 항체를 라벨에 대 한 더 많은 만들 수 있습니다. 견본을 보존하기 위하여 고정을 사용하는 대신, 조직의 급속한 동결, 또는 스냅 동결은 극저온절이라는 단면 기술 뒤에 이용될 수 있습니다
조직 샘플은 OCT라는 특수 동결 매체에 내장되고 지향되거나 최적의 절삭 온도 매체를 한 다음 빠르게 동결됩니다. 다른 포함 매체와 마찬가지로 OCT는 샘플의 강성과 일치합니다.
냉동 마이크로 톤 또는 냉동성, 냉동 섹션을 절단하는 데 사용되며,이 악기는 절단 블레이드와 샘플을 냉각 유지하기 위해 -20 ° C의 내부 온도를 유지합니다. 파라핀 임베디드 섹션과 는 달리, 냉동 섹션은 단면 직후 양전하 유리 슬라이드에 직접 들어올릴 수 있습니다.
고정을 방지하는 또 다른 방법은 시가 가루를 포함시키는 것입니다. 아가로즈가 식으면 조직을 제자리에 고정시키고 과도한 아가로즈를 잘라버릴 수 있습니다.
마이크로톤에 대한 또 다른 대안인 진동은 아가로즈 에베디드 샘플을 진동하고 이동하는 블레이드를 가지고 있습니다. 비브로토메는 아가로즈 임베디드 샘플로부터 50-1000 μm의 순서에 두꺼운 섹션을 만드는 데 사용됩니다.
샘플은 일반적으로 염색하기 전에 아가로즈에서 제거된 다음, 진공 그리스와 같은 물질로 둘러싸인 슬라이드에 배치되어 덮개 슬립이 시료를 스퀴싱하지 못하게 합니다. 그들은 각 두꺼운 섹션의 고해상도 이미지를 얻기 위해 공초점 현미경 검사를 사용하여 가장 잘 볼 수 있습니다.
당신은 단지 가벼운 현미경 검사법에 대한 조직학적 샘플 준비에 JoVE의 비디오를 보았다.
이제 조직 조각에서 염색 가능한 섹션으로 당신을 얻기 위해 샘플 준비에 관련된 단계를 이해해야합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!
조직학은 조직과 세포의 현미경 해부학의 연구를 참조 하는 용어. 가벼운 현미경 검사법에 대한 적절한 조직학적 샘플 준비는 조직 샘플에서 품질 결과를 얻기 위해 필수적입니다.
거의 모든 조직학적 절차에 공통된 3가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 시료는 조직을 보존하고 조직 저하를 늦추기 위해 고정된다. 다음으로, 샘플은 자체와 유사한 기계적 특성을 가지는 재료 또는 포함 매체에 침지됩니다. 일단 내장되면, 샘플은 마이크로토메로 알려진 정확한 절단 도구를 사용하여 얇은 조각으로 단면, 또는 절단된다. 이 비디오에서는 이러한 일반적인 단계와 이와 관련된 몇 가지 개념에 대해 설명합니다.
조직 고정은 세포 와 조직 구성 요소를 보존하고 구조를 유지하는 중요한 단계입니다. 세포 사멸 후, 자연적으로 발생하는 효소는 세포 세포세포로부터 방출되고 세포 및 세포 외 매트릭스 전체의 단백질을 저하시켜 세포의 구조를 파괴하기 시작합니다. 고정은 이러한 효소의 능력을 직접 억제하여 단백질을 소화하고 효소 분열 부위를 인식할 수 없게 함으로써 이러한 분해를 방지합니다.
고정의 두 가지 주요 메커니즘은 교차 연결 및 응고입니다. 교차 연결은 단백질 내와 그(것)들 사이 둘 다 공유 결합 형성을 관련시킵니다, 조직을 뻣뻣하게 하고 그러므로 저하에 저항하는 원인이 되는. 응고는 단백질 고등 구조를 변형시키는 알코올 이나 아세톤의 사용을 통해 단백질의 탈수에 의해 발생, 그래서 소수성, 또는 물 두려워, 영역 단백질 표면을 이동. 응고적 고정은 파라핀 왁스와 같은 미디어를 포함시켜 조직을 관통하는 데 도움이 될 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용되는 고정제 중 하나는 물에 용해 된 포름알데히드인 포르말린입니다. 고정 하는 동안, 포름알데히드는 기본 아민에 연결, 아미노산 리신과 글루타민의 측면 사슬에서 발견 하는 것과 같은 메틴 다리 라는 안정적인 크로스 링크를 형성 하기 위해. 이 프로세스는 본질적으로 느리며 최대 1-2 일이 걸릴 수 있습니다.
수정하기 전에 몇 가지 고려 사항이 이루어져야 합니다. 먼저 샘플의 확산성을 고려하십시오. 고정재는 시간의 제곱근을 곱한 고정물의 확산 계수와 관련된 속도로 조직을 통해 거리를 확산시합니다. 시료에 1mm를 침투하는 데 1시간이 걸리는 고정은 5mm를 관통하는 데 25시간이 소요됩니다. 포르말린이 조직의 중심에 도달하면 교차 연결 반응 틀이 발생해야합니다. 따라서, 샘플 크기는 적당한 시간에 철저한 고정을 위해 두께4mm로 제한되어야 한다.
둘째, 고정의 볼륨과 pH를 고려하십시오. 시약이 시간이 지남에 따라 쉽게 고갈되지 않도록 표본 대 표본 볼륨 비율은 적어도 40:1이어야 합니다. 일부 고정제는 산성 pH에서 작동하도록 설계되었지만, 포르말린은 중성 pH를 유지하기 위해 인산염으로 버퍼링할 때 가장 잘 작동하므로 과잉 산이 생성되지 않아 조직에서 유물을 유발합니다.
조직학적 제제의 다음 단계는 표본 자체와 유사한 기계적 강성을 가진 매체의 표본을 지원하는 것을 포함하는 포함입니다. 너무 뻣뻣하거나 너무 약한 경우 단면화하는 동안 결함이 발생할 수 있기 때문에 올바른 포함 매체를 선택하는 것이 중요합니다. 지금까지, 포함에 사용되는 가장 일반적인 미디어는 파라핀 왁스입니다.
파라핀 을 포함하기 전에, 견본은 에탄올로 조직의 물을 대체하여 탈수되어야 합니다, 첫째, xylenes 다음, 그리고 마지막으로 파라핀 왁스를 따뜻하게 합니다. 왁스가 시료에 침투하면 조심스럽게 배치되고 금형을 사용하여 블록을 형성하기 위해 추가 왁스로 둘러싸여 있습니다. 다음으로, 샘플은 단면화를 위한 조직 카세트에 부착됩니다.
단면은 임베딩 블록에서 샘플의 얇은 조각을 절단하는 과정입니다. 단면도는 일반적으로 가벼운 현미경 검사법과 함께 사용하기 위하여 4-10 μm 의 순서에 있습니다.
단면을 자르기 위해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드가 먼저 마이크로톤에 고정됩니다. 그런 다음 샘플이 샘플 홀더에 배치됩니다. 다음으로, 샘플은 절단 표면으로 진보하고 원하는 두께의 조각을 만들기 위해 블레이드를 가로 질러 그려집니다. 단면은 유리 슬라이드에 배치 할 수있는 얇은 리본으로 축적됩니다.
단면에 따라 샘플이 슬라이드에 배치됩니다. 파라핀 임베디드 샘플의 경우, 슬라이스는 먼저 따뜻한 수조에 넣고 물에서 밀어 내고 건조할 수 있습니다.
생물학적 조직은 내재된 대조가 거의 없으므로 조직학 후 슬라이드는 일반적으로 형태학 이나 특정 단백질을 강조하는 염료 또는 항체로 얼룩져 있습니다. 가장 일반적인 얼룩은 헤마톡시린과 에신 또는 H&E입니다. 너무 흔하기 때문에 많은 자동화 기계가 H&E. Hematoxylin이 세포의 핵을 파란색으로 얼룩지게 하고 세포균 분홍색이 조직의 세포 형태를 드러내는 것을 얼룩지게 하기 위해 만들어졌습니다.
고정에 한 가지 단점은 단백질의 교차 연결 그들의 결합 사이트를 찾기 위해 항체를 라벨에 대 한 더 많은 만들 수 있습니다. 견본을 보존하기 위하여 고정을 사용하는 대신, 조직의 급속한 동결, 또는 스냅 동결은 극저온절이라는 단면 기술 뒤에 이용될 수 있습니다
조직 샘플은 OCT라는 특수 동결 매체에 내장되고 지향되거나 최적의 절삭 온도 매체를 한 다음 빠르게 동결됩니다. 다른 포함 매체와 마찬가지로 OCT는 샘플의 강성과 일치합니다.
냉동 마이크로 톤 또는 냉동성, 냉동 섹션을 절단하는 데 사용되며,이 악기는 절단 블레이드와 샘플을 냉각 유지하기 위해 -20 ° C의 내부 온도를 유지합니다. 파라핀 임베디드 섹션과 는 달리, 냉동 섹션은 단면 직후 양전하 유리 슬라이드에 직접 들어올릴 수 있습니다.
고정을 방지하는 또 다른 방법은 시가 가루를 포함시키는 것입니다. 아가로즈가 식으면 조직을 제자리에 고정시키고 과도한 아가로즈를 잘라버릴 수 있습니다.
마이크로톤에 대한 또 다른 대안인 진동은 아가로즈 에베디드 샘플을 진동하고 이동하는 블레이드를 가지고 있습니다. 비브로토메는 아가로즈 임베디드 샘플로부터 50-1000 μm의 순서에 두꺼운 섹션을 만드는 데 사용됩니다.
샘플은 일반적으로 염색하기 전에 아가로즈에서 제거된 다음, 진공 그리스와 같은 물질로 둘러싸인 슬라이드에 배치되어 덮개 슬립이 시료를 스퀴싱하지 못하게 합니다. 그들은 각 두꺼운 섹션의 고해상도 이미지를 얻기 위해 공초점 현미경 검사를 사용하여 가장 잘 볼 수 있습니다.
당신은 단지 가벼운 현미경 검사법에 대한 조직학적 샘플 준비에 JoVE의 비디오를 보았다.
이제 조직 조각에서 염색 가능한 섹션으로 당신을 얻기 위해 샘플 준비에 관련된 단계를 이해해야합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!
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Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.