1.11: 광학 현미경 검사를위한 조직 학적 샘플 준비

조직학은 조직과 세포의 미시적 해부학에 대한 연구를 지칭하는 용어입니다. 광학 현미경 검사를 위한 적절한 조직학적 시료 준비는 조직 시료에서 양질의 결과를 얻는 데 필수적입니다.

거의 모든 조직학적 절차에 공통적인 3가지 주요 단계가 있습니다. 먼저, 조직을 보존하고 조직 분해를 늦추기 위해 샘플을 고정합니다. 다음으로, 샘플은 그 자체와 유사한 기계적 특성을 가진 재료 또는 임베딩 매체에 담근다. 일단 삽입되면 샘플은 마이크로톰(microtome)으로 알려진 정밀한 절단 도구를 사용하여 얇은 조각으로 절단되거나 절단됩니다. 이 비디오에서는 이러한 일반적인 단계 및 이와 관련된 몇 가지 개념에 대해 설명합니다.

조직 고정은 세포와 조직의 구성 요소를 보존하고 구조를 유지하는 중요한 단계입니다. 세포가 죽으면 세포 소기관에서 자연적으로 발생하는 효소가 방출되어 세포와 세포외 기질 전체의 단백질을 분해하기 시작하여 세포의 구조를 파괴합니다. 고정은 이러한 효소가 단백질을 소화하는 능력을 직접 억제하고 효소 절단 부위를 알아볼 수 없게 함으로써 이러한 분해를 방지합니다.

고정의 두 가지 주요 메커니즘은 가교와 응고입니다. 가교결합은 단백질 내부와 단백질 사이에 공유 결합이 형성되는 것을 포함하며, 이로 인해 조직이 굳어지게 되어 분해에 저항하게 됩니다. 응고는 단백질 3차 구조를 변형시키는 알코올 또는 아세톤의 사용을 통한 단백질의 탈수에 의해 발생하며, 따라서 소수성 또는 물을 두려워하는 영역이 단백질 표면을 이동시킵니다. 응고 고정은 파라핀 왁스와 같은 매립 매체가 조직에 침투하는 데 도움이 될 수 있습니다.

가장 일반적으로 사용되는 고정제 중 하나는 포르말린(Formalin)으로, 포름알데히드가 물에 용해되어 있습니다. 고정하는 동안 포름알데히드는 아미노산 라이신(lysine)과 글루타민(glutamine)의 곁사슬에서 발견되는 것과 같은 1차 아민에 부착하여 메텔렌 브리지(methelene bridge)라고 하는 안정적인 가교를 형성합니다. 이 프로세스는 본질적으로 느리며 최대 1-2일이 걸릴 수 있습니다.

고정하기 전에 몇 가지 사항을 고려해야 합니다. 먼저 샘플의 확산도를 고려합니다. 고정액은 고정액에 대한 확산 계수에 시간의 제곱근을 곱한 것과 관련된 비율로 조직을 통해 거리를 확산시킵니다. 시료 내부로 1mm를 침투하는 데 1시간이 걸리는 고정제는 5mm를 침투하는 데 25시간이 걸립니다. 포르말린이 조직의 중심에 도달하면, 가교반응 문턱이 발생해야 합니다. 따라서 합리적인 시간 내에 철저한 고정을 위해 샘플 크기를 4mm 두께로 제한해야 합니다.

둘째, 정착제의 부피와 pH를 고려하십시오. 고정액 대 시료 부피 비율은 시간이 지남에 따라 시약이 쉽게 고갈되지 않도록 최소 40:1이어야 합니다. 일부 고정제는 산성 pH에서 작용하도록 설계되었지만, 포르말린은 인산염과 완충하여 중성 pH를 유지할 때 가장 잘 작용하여 조직에 인공물을 유발하는 과도한 산이 생성되지 않도록 합니다.

조직학적 준비의 다음 단계는 포딩(embedding)으로, 이는 시편 자체와 유사한 기계적 강성을 가진 매체에서 시편을 지지하는 것입니다. 올바른 매립 매체를 선택하는 것이 중요한데, 너무 뻣뻣하거나 너무 약하면 절편 중에 결함이 발생할 수 있기 때문입니다. 지금까지 임베딩에 사용되는 가장 일반적인 매체는 파라핀 왁스입니다.

파라핀 포매 전에 조직의 수분을 먼저 에탄올로 교체한 다음 자일렌, 마지막으로 데운 파라핀 왁스로 교체하여 샘플을 탈수해야 합니다. 왁스가 샘플에 침투하면 조심스럽게 배치하고 주형을 사용하여 추가 왁스로 둘러싸서 블록을 형성합니다. 다음으로, 절편을 위해 샘플을 조직 카세트에 부착합니다.

절편은 포매 블록에서 샘플의 얇은 조각을 절단하는 과정입니다. 단면은 일반적으로 광학 현미경에 사용하기 위해 4-10 μm 두께입니다.

단면을 절단하려면 먼저 금속, 유리 또는 다이아몬드 날을 마이크로톰에 고정합니다. 그런 다음 샘플을 샘플 홀더에 넣습니다. 다음으로, 샘플을 절단 표면으로 전진시키고 블레이드를 가로질러 그려 원하는 두께의 슬라이스를 만듭니다. 섹션은 유리 슬라이드에 놓을 수 있는 얇은 리본으로 모입니다.

절편 다음에는 샘플이 슬라이드에 배치됩니다. 파라핀이 함유된 샘플의 경우, 먼저 조각을 따뜻한 수조에 넣은 다음 물에서 슬라이드로 들어 올려 건조시킵니다.

생물학적 조직에는 고유한 대비가 거의 없기 때문에 조직학 후에 슬라이드는 일반적으로 형태 또는 특정 단백질을 강조하는 염료 또는 항체로 염색됩니다. 가장 흔한 염색은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신 또는 H&E입니다. H&E는 매우 흔하기 때문에 많은 자동화 기계가 H&E로 수많은 부분을 재현 가능하게 염색하도록 만들어졌습니다. 헤마톡실린은 세포핵을 파란색으로 염색하고 에오신은 세포질을 분홍색으로 염색하여 조직의 세포 형태를 드러냅니다.

고정의 한 가지 단점은 단백질의 가교로 인해 항체를 표지하여 결합 부위를 찾는 데 더 많은 역할을 할 수 있다는 것입니다. 샘플을 보존하기 위해 고정을 사용하는 대신 조직의 급속 동결 또는 급속 동결을 사용할 수 있으며, 그 다음에는 동결 절편

이라는 절편 기술이 뒤따릅니다. 조직 샘플은 OCT 또는 최적 절단 온도 매체라고 하는 특수 동결 매체에 삽입되고 배향된 다음 빠르게 동결됩니다. 다른 임베딩 미디어와 마찬가지로 OCT는 샘플의 강성과 일치합니다.

극저온 절편절제술기 또는 저온 유지 장치는 얼어붙은 부분을 절단하는 데 사용되며 이 기기는 내부 온도를 -20도로 유지합니까? 절단 날과 샘플을 차갑게 유지하기 위한 C. 파라핀이 함유된 절편과 달리, 동결된 절편은 절편 직후 양전하를 띤 유리 슬라이드로 직접 들어 올릴 수 있습니다.

고정을 피하는 또 다른 방법은 한천 포매를 사용하는 것인데, 이 경우 샘플은 갓 준비된 액체 아가로스로 덮여 있습니다. 아가로스가 식으면 조직이 제자리에 고정되고 과도한 아가로스를 잘라낼 수 있습니다.

마이크로톰의 또 다른 대안인 바이브로톰(Vibrotomes)에는 아가로스가 내장된 샘플을 가로질러 진동하고 이동하는 블레이드가 있습니다. 진동절제술은 아가로스 내장 샘플에서 50-1000μm 정도의 두꺼운 절편을 만드는 데 사용됩니다.

샘플은 일반적으로 염색하기 전에 아가로스에서 제거한 다음 커버슬립이 샘플을 찌그러뜨리는 것을 방지하는 진공 그리스와 같은 물질로 둘러싸인 슬라이드에 놓습니다. 각 두꺼운 부분의 고해상도 이미지를 얻기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 가장 잘 볼 수 있습니다.

당신은 방금 광학 현미경 검사를위한 조직 학적 샘플 준비에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다.

이제 조직 조각에서 염색 가능한 부분으로 이동하기 위한 샘플 준비와 관련된 단계를 이해해야 합니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!