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형광 현미경 검사는 광 현미경 검사법의 돋보기 와 형광의 시각화를 결합하는 매우 강력한 분석 도구입니다. 형광은 형광소로 알려진 형광 분자에 의해 광파장의 작은 범위의 흡수및 방출을 포함하는 현상입니다. 형광 현미경검사는 강력한 광원, 특수 필터 및 형광을 시료에 표시하는 수단을 추가하여 기본 광 현미경과 함께 수행됩니다. 이 비디오는 형광 의 메커니즘, 스토크의 교대 및 광 표백메커니즘을 포함하여 형광 현미경 검사법의 기본 원리를 설명합니다. 또한 형광태그 항체 및 단백질, 핵산 형광염료의 사용, 시편에 자연형광 단백질의 첨가를 포함하는 시료를 형광으로 표시하는 수많은 방법의 예를 제공한다. 크세논 또는 수은 광원, 광 필터, 이색 거울 및 시료를 비추기 위한 셔터의 사용을 포함한 형광 현미경의 주요 성분이 모두 설명되어 있다. 마지막으로, 형광 현미경 검사법을 위한 많은 응용의 몇몇의 예는 도시됩니다.
형광은 물질이 주어진 파장에서 빛을 흡수하고 다른 파장에서 빛을 방출 할 때 일어나는 현상이다. 형광은 전자로 발생, 이는 더 높은 흥분하고있다, 더 불안정한 에너지 상태, 지상 상태로 이완과 빛의 광자를 제공합니다. 흥분을 담당하는 빛, 또는 더 높은 에너지 상태로 전자를 이동, 더 긴 파장, 낮은 에너지, 그리고 다른 색상을 가지고 형광 방출보다 짧은 파장과 높은 에너지입니다.
형광 현미경 현미경은 광 현미경의 돋보기 특성과 형광 기술과 결합하여 형광 화학 화합물인 형광화학물질으로부터 배출을 배분하고 검출할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법을 사용하면 과학자들은 세포 내의 조직 또는 분자 내의 특정 세포 유형의 위치를 관찰 할 수 있습니다.
형광 현미경의 주요 구성 요소는 전통적인 빛 현미경과 크게 겹칩니다. 그러나 2가지 주요 차이점은 광원의 종류와 특수 필터 요소의 사용이다.
형광 현미경 검사법은 여기에 표시된 것과 같은 크세논 또는 수은 아치 램프와 같은 매우 강력한 광원이 필요합니다. 수은 아크 램프에서 방출되는 빛은 대부분의 백열 램프보다 10-100배 더 밝으며 울트라 바이올렛에서 적외선에 이르는 광범위한 파장에서 빛을 제공합니다. 이 고성능 광원은 여과되지 않은 빛을 직접 들여다보면 망막이 심각하게 손상되고 전구를 잘못 취급하면 폭발할 수 있으므로 형광 현미경 설정의 가장 위험한 부분입니다.
형광 현미경 검사법의 원리는 간단합니다. 빛이 아크 램프를 떠날 때 흥분기 필터를 통해 안내되며, 이는 흥분 파장을 선택합니다.
이 빛은 이색 거울이라고 불리는 특수 거울에 의해 샘플쪽으로 반사되며, 이는 흥분 파장에서만 빛을 반사하도록 설계되었습니다. 반사된 빛은 형광 시편에 초점을 맞춘 목표를 통과합니다. 시편에서 배출되는 것은 차례로, 이미지의 배율이 발생하는 목표를 통해 다시 전달됩니다 - 그리고 지금 이질 거울을 통해.
이 빛은 방광 파장을 선택하고 아크 램프 또는 현미경 구성 요소에서 반사되는 다른 소스에서 오염광을 필터링하는 장벽 필터에 의해 여과됩니다. 마지막으로 여과된 형광 방출은 이미지를 디지털화할 수 있는 검출기로 보내거나 광학 보기를 위해 접안으로 전달됩니다.
흥분 필터, 이색 거울 및 배리어 필터는 필터 큐브로 알려진 구성 요소로 함께 조립할 수 있습니다. 표본 보기 중에 상이한 필터 큐브를 변경하여 외래 파장을 변경할 수 있으며, 일련의 다이어프람을 사용하여 흥분의 강도를 수정할 수 있다.
형광 현미경 검사를 수행하는 데 있어 형광은 현미경 자체만큼이나 중요할 수 있으며, 이미지되는 형광호의 유형은 검출되는 흥분 파장 과 방출 파장을 지시합니다. 흥분 파장은 불소에 흡수되어 흥분된 상태로 전환될 수 있는 작은 범위의 에너지를 함유하고 있습니다. 흥분되면 광범위한 배출 또는 낮은 에너지 상태로 의 전환이 가능하여 배출 스펙트럼이 발생할 수 있습니다.
흡수의 피크, 또는 여기 곡선과 배출 곡선의 피크 사이의 차이는 스토크의 시프트로 알려져 있다. 이 시프트의 거리가 클수록 두 개의 서로 다른 파장을 쉽게 분리할 수 있습니다. 또한 필터 큐브의 구성 요소에 의해 겹치는 스펙트럼을 제거하여 배경이 감소하고 이미지 품질을 향상시켜야 합니다.
장기간 흥분에 형광의 노출은 형광의 약화 또는 손실인 광표백을 야기할 것입니다. 광표백을 줄이려면 슬라이드에 페이드 방지 장착 매체를 추가하고 매니큐어로 가장자리를 밀봉할 수 있습니다. 이미지를 이미지하지 않을 때는 슬라이드를 어둠 속에서 유지해야 합니다.
형광 이미징을 시작하려면 크세논 또는 수은 광원을 켜고 일정한 조명에 도달하기 위해 15 분 동안 따뜻하게 할 수 있습니다.
그런 다음 샘플을 무대에 놓고 제자리에 고정하십시오. 그런 다음 현미경의 백색 광원을 켭니다. 거칠고 미세한 초점 노브를 조정하여 가장 낮은 전원 목표를 사용하여 샘플에 집중하십시오. 그런 다음 스테이지 조정 노브를 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
다음으로 백광원을 끄고 불필요한 실내 조명을 끄면 배경을 줄입니다.
이미징중인 염료에 대한 올바른 필터 큐브를 선택하고 셔터를 열어 샘플을 비춥습니다.
마지막으로, 미세 한 초점 조정 하 고 이미징 카메라에 출력 빛을 직접. 사용되는 각 다른 형광또는 형광염에 대한 노출 시간을 조정해야 할 것입니다. 그러나, 다른 견본에 동일한 염료와 특징을 비교할 때 노출 시간을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다.
동일한 샘플에서 여러 염료를 이미지화하려면 필터 큐브를 변경하여 각 불소에 일치시키고 새 이미지를 기록합니다.
샘플의 각 염료가 이미지화된 후 개별 이미지를 오버레이하고 병합할 수 있습니다.
실험의 많은 다른 모형은 형광 현미경 검사법의 사용을 할 수 있고 형광 현미경 검사법의 일반적인 응용의 한은 형광 현미경 검사법의 일반적인 응용의 한개는 형광 화합물에 붙어 있는 항체로 표지된 단백질의 화상 진찰입니다. 여기서, 렙토나선형 표면 단백질을 향한 항체는 알렉사플루어-488에 공주된 이차 항체를 사용하여 검출되었으며, 이는 흥분될 때 녹색을 형광한다.
형광과 특정 특징을 강조하는 또 다른 방법은 녹색 형광 단백질 또는 GFP와 같은 형광 단백질에 대한 코드를 유기체의 DNA에 통합하는 것입니다. GFP를 위한 유전자는 원래 해파리에서 분리되고 특정 트리거에 반응하거나 이 심상에서 빛나는 종양 세포 같이 특정 세포 모형의 한 부분으로, 발현되거나 생성될 수 있습니다
형광 화상 진찰의 또 다른 응용은 이 중요한 cytoskeletal 단백질의 운동 및 회전 회전 운동을 공부하기 위하여 여기에서 보인 F 액틴 네트워크와 같은 형광표지 매크로 분자 어셈블리를 사용하는 기술인 형광 반점 현미경 검사법입니다.
광표백 후 형광 회수또는 FRAP로 알려진 고급 기술은 광표백 된 영역으로 다시 형광 으로 표시된 분자의 확산 속도를 모니터링하기 위해 의도적으로 샘플의 작은 영역을 표백하여 수행됩니다.
당신은 단지 형광 현미경 검사법에 JoVE의 소개를 보았다.
이 비디오에서 우리는 형광의 개념, 형광 현미경 검사가 가벼운 현미경 검사법과 어떻게 다른지, 그리고 범위를 통해 형광 이미지를 취하는 방법에 대해 배웠습니다. 우리는 또한 형광을 사용하는 몇 가지 기본 및 고급 응용 프로그램에 대해 배웠습니다. 보고 주셔서 감사 하고 사진 표백 은 당신의 치아에 좋은 보이는 동안 잊지 마세요 그것은 당신의 샘플에 대 한 너무 좋지 않다.
형광은 물질이 주어진 파장의 빛을 흡수하고 다른 파장의 빛을 방출할 때 발생하는 현상입니다. 형광은 더 높고 더 불안정한 에너지 상태로 여기된 전자가 바닥 상태로 이완되어 빛의 광자를 방출할 때 발생합니다. 여기(excitation) 또는 전자를 더 높은 에너지 상태로 이동시키는 빛은 파장이 더 길고 에너지가 낮으며 색상이 다른 형광 방출보다 파장이 짧고 에너지가 높습니다.
형광 현미경 검사는 광학 현미경의 확대 특성과 형광단(fluorescence technology)을 결합하여 형광단(fluorophores)인 형광단(fluorophores)의 방출을 여기(excitation)하고 검출할 수 있습니다. 형광 현미경을 통해 과학자들은 조직 내 또는 세포 내 분자의 특정 세포 유형의 위치를 관찰할 수 있습니다.
형광 현미경의 주요 구성 요소는 기존 광학 현미경과 크게 겹칩니다. 그러나 2가지 주요 차이점은 광원의 유형과 특수 필터 요소의 사용입니다.
형광 현미경 검사에는 여기에 표시된 것과 같은 크세논 또는 수은 아치 램프와 같은 매우 강력한 광원이 필요합니다. 수은 아크 램프에서 방출되는 빛은 대부분의 백열등보다 10-100배 더 밝으며 자외선에서 적외선에 이르기까지 다양한 파장의 빛을 제공합니다. 이 고출력 광원은 여과되지 않은 빛을 직접 들여다보면 망막이 심각하게 손상될 수 있고 전구를 잘못 다루면 폭발할 수 있으므로 형광 현미경 설정에서 가장 위험한 부분입니다.
형광 현미경 검사의 원리는 간단합니다. 빛이 아크 램프를 떠날 때 여기 파장을 선택하는 익사이터 필터를 통과하게 됩니다.
이 빛은 excitation 파장에서만 빛을 반사하도록 설계된 dichroic mirror라고 하는 특수 거울에 의해 샘플로 반사됩니다. 반사된 빛은 형광 표본에 초점이 맞춰지는 대물렌즈를 통과합니다. 표본에서 배출되는 가스는 차례로 대물렌즈를 통해 다시 전달됩니까? 이미지의 확대가 발생하는 곳과 이제 이색성 거울을 통해.
이 빛은 배리어 필터에 의해 필터링되며, 이 필터는 방출 파장을 선택하고 아크 램프 또는 현미경 구성 요소에서 반사되는 기타 광원의 오염광을 걸러냅니다. 마지막으로, 필터링된 형광 방출은 이미지를 디지털화할 수 있는 검출기로 전송되거나 광학 관찰을 위해 접안렌즈로 전송됩니다.
exciter filter, dichroic mirror 및 barrier filter는 filter cube로 알려진 구성 요소로 함께 조립할 수 있습니다. 여기 파장을 변경하기 위해 표본을 관찰하는 동안 다른 필터 큐브를 변경할 수 있으며, 일련의 다이어프램을 사용하여 여기 강도를 수정할 수 있습니다.
형광 현미경 검사를 수행할 때 형광단은 현미경 자체만큼 중요할 수 있으며, 이미지화되는 형광단의 유형에 따라 사용되는 여기 파장과 감지되는 방출 파장이 결정됩니다. 여기 파장에는 형광단에 흡수되어 여기 상태로 전환될 수 있는 작은 범위의 에너지가 포함되어 있습니다. 일단 여기되면 광범위한 방출 또는 더 낮은 에너지 상태로의 다시 전환이 가능하여 방출 스펙트럼이 생성됩니다.
흡수 또는 여기 곡선의 피크와 방출 곡선의 피크 사이의 차이를 Stoke's Shift라고 합니다. 이 이동의 거리가 멀수록 두 개의 서로 다른 파장을 더 쉽게 분리할 수 있습니다. 또한 겹치는 스펙트럼은 배경을 줄이고 이미지 품질을 개선하기 위해 필터 큐브의 구성 요소에 의해 제거되어야 합니다.
형광단을 장시간 여기(excitation)에 노출시키면 광표백이 발생하여 형광이 약화되거나 손실됩니다. 광표백을 줄이기 위해 슬라이드에 페이드 방지 장착 매체를 추가하고 매니큐어로 가장자리를 밀봉할 수 있습니다. 슬라이드는 이미지를 촬영하지 않을 때도 어두운 곳에 보관해야 합니다.
형광 이미징을 시작하려면 크세논 또는 수은 광원을 켜고 일정한 조명에 도달할 수 있도록 최대 15분 동안 예열합니다.
다음으로, 샘플을 스테이지에 놓고 제자리에 고정합니다. 그런 다음 현미경의 백색 광원을 켭니다. coarse 및 fine focus knobs를 조정하여 가장 낮은 전력의 대물렌즈를 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 스테이지 조정 손잡이를 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
그런 다음 백색 광원과 불필요한 실내 조명을 꺼서 배경을 줄입니다.
이미징 중인 염료에 대한 올바른 필터 큐브를 선택하고 셔터를 열어 샘플을 비춥니다.
마지막으로 초점을 미세하게 조정하고 출력 광을 이미징 카메라로 향하게 합니다. 사용되는 각각의 다른 형광단 또는 형광 염료에 대한 노출 시간을 조정해야 할 수 있습니다. 그러나 다른 샘플에서 동일한 염료를 사용한 기능을 비교할 때 노출 시간을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다.
동일한 샘플에서 여러 염료를 이미지화하려면 각 형광단과 일치하도록 필터 큐브를 변경하고 새 이미지를 기록합니다.
샘플의 각 염료를 이미지화한 후 개별 이미지를 오버레이하고 병합할 수 있습니다.
다양한 유형의 실험은 형광 현미경을 사용할 수 있으며 다양한 유형의 형광단을 포함할 수 있습니다. 형광 현미경 검사의 가장 일반적인 응용 분야 중 하나는 항체로 표지된 단백질의 이미징입니다. 형광 화합물에.. 여기서, 렙토스파이럴 표면 단백질에 대한 항체는 excitiond 때 녹색으로 형광을 발하는 alexafluor-488에 접합된 2차 항체를 사용하여 검출되었습니다.
형광으로 특정 특징을 강조하는 또 다른 방법은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질의 코드를 유기체의 DNA에 통합하는 것입니다. GFP에 대한 유전자는 원래 해파리에서 분리되었으며 특정 유발 요인에 반응하거나 이 이미지에 표시된 종양 세포와 같은 특정 세포 유형의 일부로 배양된 세포에 의해 발현되거나 생성될 수 있습니다.
형광 이미징의 또 다른 응용 분야는 여기에서 볼 수 있는 F-actin 네트워크와 같은 형광 표지된 고분자 어셈블리를 사용하는 기술인 Fluorescence Speckle Microscopy입니다. 이 중요한 세포골격 단백질의 움직임과 회전율 역학을 연구합니다.
광표백 후 형광 회수(FRAP)로 알려진 고급 기술은 형광 표지된 분자가 광표백 영역으로 다시 확산되는 속도를 모니터링하기 위해 샘플의 작은 영역을 의도적으로 광표백하는 방식으로 수행됩니다.
당신은 방금 형광 현미경에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다.
이 비디오에서는 형광의 개념, 형광 현미경 검사와 광학 현미경의 차이점, 그리고 스코프를 통해 형광 이미지를 촬영하는 방법에 대해 배웠습니다. 또한 형광을 사용하는 몇 가지 기본 및 고급 응용 분야에 대해서도 배웠습니다. 시청 해 주셔서 감사 드리며 광 표백이 치아에 멋지게 보이지만 샘플에는 그다지 좋지 않다는 것을 잊지 마십시오.
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