미생물 식별 및 특성화를위한 Pyrosequencing

다음 실험의 전반적인 목표는 파이로 염기서열분석 방법론을 사용하여 16초 리보솜 DNA 염기서열 분석을 통해 박테리아를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 비오틴화 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 통해 표적 DNA를 증폭함으로써 달성됩니다. 그런 다음 비오틴화된 앰플리콘을 스트렙타비딘으로 코팅된 스페로스 비드를 사용하여 고정하고 세척 완충액을 사용하여 정제합니다.

다음으로, 앰플리콘을 변성시키고 16 s 리보솜 염기서열분석 프라이머를 DNA의 단일 가닥에 ELL로 만듭니다. 이 단계의 목표는 염기서열분석을 위해 DNA를 준비하는 것입니다. 마지막으로, DNA 염기서열분석 반응은 합성에 의한 염기서열분석 원리에 따라 핵산을 염기서열분석하는 빠르고 정확한 방법인 파이로 염기서열분석에 의해 발생합니다.

비오틴화된 알리콘은 DNA 중합효소에 의해 주형으로 사용되어 한 번에 하나의 염기로 DN TPS를 통합하여 피로인산을 생성합니다. TP Sul Urease는 피로인산염을 A-T-P-A-T-P로 비례적으로 변환하여 Lucifer에서 Lucifer로의 루시퍼라제 매개 변환을 촉매하여 TP의 양에 비례하는 빛을 생성합니다. 빛은 파이로 트레이스에서 피크로 기록되며 뉴클레오티드 통합을 나타냅니다. 통합되지 않은 DN NTP는 합성의 지속을 위해 다음 DNTP가 추가되기 전에 apras에 의해 분해됩니다.

로그램에 기록된 화학발광 신호를 통해 DNA의 염기서열을 결정할 수 있습니다. 얻은 결과는 리보솜 16 SDNA 염기서열이며, 이는 리보솜 DNA 참조 데이터베이스와 비교하여 박테리아를 식별하는 데 사용됩니다. 파이로 염기서열분석은 미생물 게놈 염기서열분석을 용이하게 하는 다목적 기술로, 박테리아 종을 식별하고, 박테리아 균주를 구별하고, 항균제에 내성을 부여하는 유전자 돌연변이를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오에서는 박테리아 앰플리콘 생성 앰플리콘 파이로 염기서열분석 및 DNA 염기서열 분석 절차를 시연합니다. 템플릿 증폭 절차를 시작하려면 필요한 모든 용액을 해동하고 각 용액을 철저히 혼합합니다. 모든 작업은 실온에서 수행할 수 있습니다. 이 표에 따라 PCR 반응을 설정합니다.

최종 염화마그네슘 농도가 1.5밀리몰이면 대부분의 경우 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 최대 3.5마이크로리터의 25밀리몰까지 더 높은 마그네슘 농도가 필요한 경우 염화마그네슘을 반응에 추가할 수 있습니다. 하나의 프라이머는 5개의 프라임 말단에서 비오틴화되어야 하며, 프라이머는 HPLC를 철저히 정제하는 것이 좋습니다.

위아래로 부드럽게 피펫팅하여 반응 혼합물을 혼합한 다음 PCR 튜브에 적절한 부피를 분주합니다. 다음으로, 각 PCR 튜브에 템플릿 DNA를 추가합니다. 반응당 10나노그램의 게놈 DNA가 권장됩니다.

PCR 튜브를 사이클러에 넣고 마스터 믹스를 만들기 전에 이 사이클링 프로그램을 시작합니다. 균질한 현탁액을 보장하기 위해 연쇄상구균 열렬한 병과 코팅된 혈청 구슬을 휘젓습니다. 이 순서도에 따라 마스터 믹스를 만드십시오.

비드, 결합 완충액 및 고순도 물을 마이크로 원심분리기 튜브에 결합합니다. 사용된 PCR 산물의 부피에 따라 총 부피가 웰당 80마이크로리터가 되도록 PCR 플레이트의 각 웰에 60-75마이크로리터의 마스터 믹스를 분배했습니다. 각 웰에 5-20마이크로리터의 Biotinylated PCR 산물을 추가합니다.

이제 웰당 부피는 80마이크로리터가 되어야 합니다. 웰을 스트립 캡으로 밀봉하고 오비탈 셰이커를 사용하여 실온에서 5-10분 동안 1, 400RPM으로 PCR 플레이트를 교반합니다. 니링 버퍼를 사용하여 염기서열분석 프라이머를 0.3마이크로몰로 희석하고 반응 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터를 분배하여 이 절차를 시작합니다.

진공 워크스테이션에 플레이트를 배치합니다. 이 다이어그램에 따라 워크스테이션 홈통을 채웁니다. 물마루에 70 % 에탄올 50 밀리리터, 골짜기에 40 밀리리터의 변성 용액 1 개, 골짜기에 50 밀리리터의 세척 완충액 2 개, 골짜기에 50 밀리리터의 고순도 물 3 개, 골짜기 4 개, 70 밀리리터의 고순도 물 5 밀리리터.

진공 펌프를 켜고 진공 도구의 스위치가 켜져 있는지 확인하고 필터 프로브를 고순도 물로 플러시합니다. 5골에서 PCR 플레이트와 반응 플레이트가 모두 동일한 방향에 있도록 워크스테이션에 비드가 있는 PCR 플레이트를 배치합니다. 진공 도구를 PCR 플레이트의 웰로 내립니다.

20초 동안 또는 모든 부피가 흡인될 때까지 비드는 진공 청소기가 켜져 있는 상태에서 진공 도구에 의해 캡처됩니다. 70% 에탄올로 도구를 20초 동안 또는 모든 부피가 흡입될 때까지 세척합니다. 그런 다음 Denaturation 용액으로 공구를 20초 동안 또는 모든 부피가 흡입될 때까지 세척합니다.

그런 다음 20초 동안 또는 진공 상태가 유지된 상태에서 모든 볼륨이 흡입될 때까지 세척 버퍼로 도구를 세척하십시오. 진공 도구를 수직으로 90도 이상으로 5초 동안 들어 올려 진공 도구에서 모든 액체가 배출되도록 합니다. 이제 펌프를 끄고 진공 도구를 세 개의 반응판에 맞춥니다.

진공 도구를 우물로 내립니다. 그런 다음 약 10초 동안 좌우로 부드럽게 흔들어 염기서열분석 프라이머가 들어 있는 웰로 비드를 방출합니다. 진공 도구를 물통에 넣어 DNA에 염기서열분석 프라이머를 세척합니다.

반응 플레이트를 예열 플레이트 홀더에 놓습니다. 접시를 섭씨 80도에서 2분 동안 가열합니다. 홀더에서 접시를 꺼내 카운터에 올려 놓고 실온에서 5분 동안 식힙니다.

전원 코드 위에 있는 전원 스위치를 사용하여 기기를 켜서 필요한 볼륨을 결정하여 이 절차를 시작합니다. 기기 소프트웨어에서 실행 파일을 설정하고 도구 메뉴에서 사전 실행 정보를 선택합니다. 실행 전 정보 페이지에 제공된 지침에 따라 카트리지를 채웁니다.

기포가 없는지 확인하여 각 웰의 모서리에 피펫 팁을 가능한 한 멀리 놓습니다. 카트리지 게이트를 열고 레이블이 앞쪽을 향하도록 카트리지를 삽입합니다. 카트리지가 제대로 삽입되었는지 확인하고 게이트를 닫습니다.

플레이트 고정 프레임을 열고 기기 내부에 반응 플레이트를 배치합니다. 플레이트 고정 프레임과 기기 덮개를 닫습니다. 런이 있는 USB 스틱 삽입 file기기 소프트웨어로 만든 파일을 기기 프레스 전면의 USB 포트에 넣습니다.

원하는 실행 파일의 메뉴를 보려면 좋습니다. 스크롤 화살표를 사용하여 원하는 실행 파일을 선택하고 선택을 누릅니다. 사전 설정된 모든 압력 및 온도 수준에 도달하면 기기는 실행 중에 시약을 분배하기 시작합니다.

기기 화면에는 선택한 우물의 파이로가 실시간으로 표시됩니다. 스크롤 화살표를 사용하여 view 다른 우물의 파이로. 기기에서 실행이 완료되고 실행 파일이 USB 스틱에 저장되었음을 확인하면 닫기를 누릅니다.

USB 스틱을 제거합니다. 일반적인 파이로 염기서열분석 실행의 결과는 다음과 같습니다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 16초 리보솜 서열인 DNA 템플릿의 보존된 영역을 위해 설계되었습니다.

이 예에서 염기서열분석 프라이머는 파란색으로 표시된 앰플리콘 내에서 잘 특성화된 식별 초가변 DNA 염기서열의 바로 상류에 위치합니다. 이 초변수 염기서열은 내부 품질 관리로 보존된 염기서열분석 프라이머를 사용하여 많은 수의 박테리아 종의 박테리아 식별을 가능하게 하며, 가변 영역을 브라케팅하는 DNA 염기서열을 확인하여 올바른 DNA 영역이 분석되었는지 확인할 수 있습니다. 파이로 염기서열분석 소프트웨어를 사용하면 박테리아 식별을 위해 생성된 염기서열을 박테리아 리보솜 염기서열의 내부 데이터베이스와 비교하고 정렬할 수 있습니다.

또한 항생제 약물 내성을 부여하는 돌연변이를 결정하기 위해 염기서열을 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 헬리코박터 파일로리의 23s 리보솜 유전자의 돌연변이를 분석하면 항생제 내성을 부여하는 GAA 또는 GA의 두 가지 돌연변이 패턴이 드러납니다. 파이로 염기서열분석(Pyro sequencing)은 미생물 게놈 염기서열분석을 용이하게 하는 다목적 기술입니다.

미생물학 응용 분야에서 파이로 염기서열분석의 장점으로는 빠르고 신뢰할 수 있는 고처리량 스크리닝과 미생물 및 미생물 게놈 돌연변이의 정확한 식별이 있습니다. 또한 파이로 염기서열분석 방법론은 SNP 포인트 돌연변이, 삽입 및 결실의 유형화뿐만 아니라 일부 항생제 내성 패턴에서 발생할 수 있는 여러 유전자 사본의 정량화를 포함하여 항생제 내성의 전체 유전적 다양성을 분석할 수 있습니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사드리며, 염기서열분석 실험에 행운을 빕니다.