Name: 미생물 식별 및 특성화를위한 Pyrosequencing (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 배우세요 파이로시퀀싱을 활용한 미생물 16S 리보솜 DNA 서열 분석 방법으로 세균 종을 신속하고 정확하게 식별하고 항생제 내성 유전자 돌연변이를 검출하는 기술을 익히세요.

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이 프로젝트는 존스 홉킨스 대학, 게이트웨이 과학 이니셔티브와 Qiagen의 주식을 통해 학장의 사무실에 의해 부분적으로 지원되었다

소개 : 하나의 세균성 식민지가 하룻밤 배양하는 적절한 배양액을 접종하는 데 사용되어야한다. 박테리아 펠렛은 다음 시판 게놈 분리 키트를 사용하여 게놈 DNA를 정화 처리됩니다. 정제 된 게놈 DNA는 280분의 260 (NM) 비율에게 샘플 단백질 오염 무료입니다 보장하기&gt; 1.8이 있어야합니다. pyrosequencing 템플릿의 생성에 필요한 게놈 DNA의 양이 10-20 NG입니다. 템플릿의 A. 증폭 (PyroMark PCR 수첩, <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / 핸드북</a> 1) PCR 반응을 설정 참고 : 하나의 프라이머의 5 &#39;말단에로 만들었다해야하며, 그것이이 템플릿 준비를 위해 정제 HPLC하는 것이 좋습니다. 우리는 PCR 및 SE에 대한 PyroMark 분석 설계 소프트웨어 2.0을 추천합니다짧은 읽기 시퀀싱에 최적화 된 quence 프라이머 디자인은, 그러나, 프라이머-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> NCBI에서)도 할 수 있습니다 프라이머 디자인에 사용할 수. <ol><li> 필요한 모든 솔루션 (표 1) 해동 각 철저히 섞는다. 표 1에 따라 반응을 설정합니다. 모든 작업은 상온에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : PCR Master Mix는 대부분의 경우 만족스러운 결과를 제공하는 1.5 mm의 최종 농도에 대한 MgCl 2를 포함합니다. 높은 마그네슘 2 + 농도가 필요한 경우, 25 mM의 MgCl 2의 최대 3.5 μL를 반응에 추가 할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 철저하게 부드럽게 위아래로 pipetting에 의해 반응 믹스를 혼합 한 후 PCR 튜브에 적절한 볼륨을 분배. </li><li> templat 추가각 PCR 튜브에 전자 DNA. 우리는 게놈 DNA의 10 NG를 추천합니다. </li><li> 표 2에 따라 열 자전거 타는 사람을 프로그램입니다. 4에서 마지막 홀드 ° C는 편의를 위해 권장됩니다. 100 μL 미네랄 오일을 가열 뚜껑없이 열 자전거 타는 사람을 사용하는 경우, 오버레이는 반응. </li><li> 자전거 타는 사람에 PCR 튜브를 삽입하고 순환 프로그램을 시작합니다. </li></ol> B. 진공 워크 스테이션 프로토콜 바이오틴 PCR 제품을 고정 <ol><li> 그림 4에 따른 마스터 믹스를 확인하십시오. </li></ol> 참고 : 피펫 전에 부드럽게 균일 한 현탁액을 보장하기 위해 스트렙 타비 딘 - 코팅 세파 비즈의 병을 흔들어. <ol start="2"><li> 사용되는 PCR 제품의 양에 따라 잘 당 80 μL의 총 볼륨을주는 PCR 플레이트의 각 웰에 60 ~ 75 μL 마스터 믹스를 분배. </li><li> 각 well에 5-20 μL 바이오틴 PCR 제품을 추가합니다. </li><li> 지구 CA와 우물을 밀봉궤도 셰이커를 사용하여 실내 온도 (15-25 ° C)에서 5 ~ 10 분 동안 1,400 rpm에서 PCR 플레이트 PS 및 교반. </li></ol> DNA의 변성 및 프라이머 시퀀싱 추가 <ol><li> 버퍼를 열처리와 0.3 μM로 시퀀싱 프라이머를 희석 반응 플레이트의 각 웰에 25 μl를 분배. 워크 스테이션에 접시를 놓습니다. </li><li> 그림 5 그림에 따라 워크 스테이션 골짜기를 입력합니다. </li><li> 진공 펌프를 켜고 진공 도구를 스위치 (그림 6)에 설정되어 있는지 확인합니다. 통 5 고순도 물 (밀리-Q 18.2 MW X cm 또는 동급) (그림 5)와 필터 프로브를 세척합니다. 12 단계에서 사용하기 위해 신선한 고순도의 물을 리필 통. </li><li> 신속하게 작업, 워크 스테이션 구슬 PCR 플레이트를 배치합니다. 두 플레이트 샘플로드 된 때와 같은 방향으로되어 있는지 확인합니다. </li><li> ON 진공 스위치, 진공을 낮출20 초 또는 모든 볼륨이 흡입 될 때까지 PCR 플레이트의 우물에 도구입니다. 구슬 진공 도구 (그림 7)에 의해 캡처됩니다. </li><li> 아직도 진공, 20 초 동안 70 % 에탄올 (여물통 1) 도구를 세척 또는 모든 볼륨이 흡인 될 때​​까지. </li><li> ON 진공, 20 초 동안 변성 용액 (여물통 2)와 도구를 세척 또는 모든 볼륨이 흡인 될 때​​까지. </li></ol> 참고 : 변성 솔루션은 눈과 피부에 자극이다 수산화 나트륨을 포함하고 있습니다. 항상 실험실 코트, 장갑 및 보호 안경을 착용하십시오. <ol start="8"><li> ON 진공, 20 초 동안 세척 버퍼 (여물통)로, 도구를 세척 또는 모든 볼륨이 흡인 될 때​​까지. </li><li> ON 진공, 모든 액체가 진공 도구를 밖으로 배출 할 수 있도록 5 초 동안 90 ° 이상 수직으로 진공 도구를 올립니다. 펌프를 끄고, 반응 플레이트 진공 도구를 맞 춥니 다. 에 진공 도구를 낮 춥니 다우물은 부드럽게 우물 포함 시퀀싱 프라이머로 구슬을 풀어 좌우로 흔 듭니다. </li><li> 진공 도구를 청소하기 위해 10 초 고순도 물 (트로프 4)에서 필터 프로브를 선동. </li><li> ON 진공 전환하고 모든 볼륨이 흡입 될 때까지 20 초 또는 고순도 물 (통 5)로 도구를 세척하십시오. </li><li> 5 초 동안 90 넘어 ° C 수직에 진공 도구를 올린 후 진공 OFF 스위치를 &quot;주차&quot;위치에 저장합니다. </li></ol> DNA 가닥에 시퀀싱 프라이머를 어닐링 <ol><li> 미리 예열 격판 덮개 홀더 반응 플레이트를 놓습니다. </li><li> 2 분 80 가열 블록 ° C에서 접시를 가열한다. </li><li> 5 분 동안 상온에서 냉각 카운터 홀더와 장소에서 플레이트를 제거합니다. </li></ol> Pyromark Q24 운영 참고 : 전원 코드 위에있는 전원 스위치를 사용하여 기기의 스위치를 켭니다. 스타TUP는 1 분까지 걸릴 수 있습니다. <ol><li> PyroMark 골드 Q24 시약 지침서 제 2 권에 제공된 지침에 따라 카트리지를 입력합니다. 장비 소프트웨어의 실행 파일을 설정, 필요한 볼륨을 결정하고, 도구 메뉴에서 사전 실행 정보를 선택하려면 </li><li> 기기에 이미 경우, 실행을 수행되지 않도록하고 뚜껑을 엽니 다. 그렇게하는 것이 안전 할 때 뚜껑이 열리는 경우 가청 경보 신호가 방출 될 것입니다. </li><li> 카트리지 문을 열고 레이블 (그림 8) 앞으로 향하게하여 카트리지를 삽입합니다. 카트리지가 제대로 (라인 앞에 표시되어야합니다) 삽입되어 있는지 확인하고 문을 닫습니다. </li><li> 판 지주 프레임을 열고 기기 내부의 샘플 접시를 놓습니다. </li><li> 판 지주 프레임과 악기 뚜껑 (그림 9)를 닫습니다. </li></ol> 실행을 시작 <ol><li> 실행 파일을 USB 스틱을 삽입s는 기기의 전면에있는 USB 포트에 기기의 소프트웨어를 만들었습니다. </li><li> 메인 메뉴에서 &quot;실행&quot;을 선택하고 &quot;OK&quot;를 누릅니다. </li><li> 원하는 실행 파일을 선택하고 &quot;선택&quot;을 눌러 이동 화살표를 사용합니다. </li></ol> 참고 :이 장비는 모든 사전 설정 압력과 온도 수준 (이 작업은 몇 분의 시간이 소요될 수 있음)에 도달 할 때 시약을 조제하기 시작합니다. 실행 중에, 기기의 화면을 실시간으로 선택 잘 pyrogram를 표시합니다. 다른 우물의 pyrogram를 보려면 이동 화살표를 사용합니다. 실행을 완료 <ol><li> 악기가 실행이 완료되었음을 확인하고 실행 파일을 USB 스틱에 저장되어있는 경우, &quot;닫기&quot;를 누릅니다. </li><li> USB 스틱을 제거합니다. 실행이 완료되기 전에이 제거 된 경우, USB 스틱을 삽입합니다. &quot;관리&quot;및 &quot;복사 저장되지 않은 뛰기&quot;를 선택합니다. </li><li> 실행 파일이 현재 열려 장비 소프트웨어를 사용하여 비교 분석 할 수 있습니다Identifire 소프트웨어를 사용하여 알려진 미생물의 라이브러리. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+PCR+Handbook%22">PyroMark PCR Handbook</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
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<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
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	 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn">http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn</a> (2012).</li>
</ol>

이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스는 Qiagen의 후원됩니다. 저자 아메드, Durocher, Jessen 및 Vardi이 문서에 사용 된 시약 및 장비를 생산 Qiagen의 주식 회사의 직원입니다.

몇 가지 새로운 차세대 시퀀싱 방법이 상용화되었다. 가장 널리 사용되는 방법의 세 가지 다음 방법 중 3-11은 각각 합성 순서에 따라 달라집니다. 이온 반도체 연속, 단일 분자 실시간 시퀀싱 및 합성 (SBS)에서 연속이지만 법인 핵산의 검출을위한 새로운 플랫폼을 사용합니다. 이온 반도체 서열에서 DNA의 단일 가닥 서열 가닥의 템플릿 역할을합니다. 12 중합 효소 및 핵산 순차적으로 pyrosequencing에서와 같이 추가됩니다. 뉴클레오티드가 성장하는 DNA 가닥에 추가 될 때, 수소 이온이 해제됩니다. 수소 이온이 전계 효과 트랜지스터 기반의 센서에 의해 감지됩니다. 단일 분자 실시간 시퀀싱 제로 모드 도파관 (ZMW)에 따라 달라집니다. 13 ZMW는 단일 효소 분자가 잘 하단에 부착되는 작은 구조입니다. 그것은 그 플로 같은 방법으로 켜집니다냄새 분자를 감​​지 할 수 있습니다. 각각의 뉴클레오티드 형광 분자로 태그됩니다. 찬란 태그 염기가 통합 될 때, 감지기는 염기를 식별합니다. 다음 뉴클레오티드가 추가 될 때, 형광 분자가 쪼개합니다. 14 합성 시퀀싱 (SBS) 고유 한 시퀀스 클러스터가 생성하는 표적 DNA와 같은 증폭하는 독특한 방법을 사용합니다. 15 단일 가닥의 템플릿을 생성하고 보완 가닥이 합성된다. 각각의 뉴클레오티드 형광 분자로 표시되며, 각베이스 추가 한 후 추가 된베이스의 형광 기록됩니다.

Pyrosequencing은 &quot;합성 순서&quot;의 원리에 근거 시퀀스 핵산 산에 신속하고 정확한 방법입니다. &quot;합성 시퀀싱은&quot;한 번에 상보적인 가닥 하나의 기본을 합성 한 가닥의 DNA 템플릿을 사용하고 통합베이스 (A, T, G, 또는 C) 화학 발광 신호를 검출하여 각 단계에서 감지 포함한다. pyrosequencing 반응은 주형 DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA 중합 효소, ATP sulfurylase, 루시페린, 루시퍼, 그리고 apyrase가 포함되어 있습니다. 합성 반응은 네 가지 dNTPs와 단일 좌초 바이오틴 템플릿 DNA에 DNA 중합 효소 중 하나의 추가에 의해 시작됩니다. DNA 중합 효소는 피로 인산의 후속 릴리스 (그림 1), 템플릿 위에 보완 dNTP를 포함합니다. ATP sulfurylase 비례 ATP에 피로 인산으로 변환합니다. ATP는 어떤 oxyluciferin에 루시페린의 루시 페라 제 - 매개 변환을위한 촉매 역할을등 (그림 2)를 생성합니다. 빛의 강도는 통합 된 뉴클레오티드의 수에 비례 하나 이상의 특정 dNTP의이 (dATP, dTTP, dGTP, dCTP 또는) 순차적으로 템플릿 가닥 (그림 3)에 있는지 확인합니다. 어떤 비법 dNTP 전에 합성 반응의 연속은 다음 dNTP의 추가에 apyrase로 저하됩니다. 단일 가닥 DNA 템플릿의 DNA 순서가 결정 될 때까지 &quot;합성 순서&quot;반응은 네 가지 dNTPs의 각 추가로 반복됩니다. pyrosequencing 반응의 애니메이션을 보려면 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR 마스터 믹스, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad 농축액, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Solution, 5x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Qiagen</td><td>978776 또는 978777</td><td>Primer는 저명한 올리고뉴클레오티드 제조업체(i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT 등)에서 구입해야 합니다. 동결건조된 프라이머는 100 &mu;M의 원액을 제공하기 위해 TE에 용해되어야 합니다.</td></tr><tr><td>Pyromark Gold Q24 시약</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>고순도수(Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm 또는 동급)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose 고성능 비드</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 어닐링 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 변성 용액</td><td>Qiagen</td><td>979007</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 세척 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>979008</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 카트리지</td><td>Qiagen</td><td>979202</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS 팁 홀더 박스</td><td>Qiagen</td><td>979105</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 진공 워크스테이션</td><td>Qiagen</td><td>9001516</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 플레이트 홀더 Qiagen</td><td></td><td></td><td></td>9022273</tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>히트 블록</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

미생물 식별 및 특성화를위한 pyrosequencing

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing은 박테리아를 식별하는 균주를 감별 및 항균 에이전트에 저항성을 부여하는 유전자 변이를 감지하는 데 사용할 수있는 미생물 게놈 시퀀싱을 용이하게하는 다양한 기술입니다. 미생물학 응용​​ 프로그램에 대한 pyrosequencing의 장점은 신속하고 신뢰성 높은 처리량 검사 및 미생물 및 미생물 게놈 변이의 정확한 신원이 (가) 있습니다. Pyrosequencing은 합성 반응 중에 포함 된 특정 염기의 존재를 결정하면서 보완 가닥 한 번에 하나의 기지를 합성하여 DNA 시퀀싱 포함한다. 반응은 네 가지 deoxyribonucleotides (dNTP)이 순차적으로 추가하고 비법 dNTPs는 합성 반응에 대한 다음 dNTP를 첨가하기 전에 효소로 분해되어있다 고정 된 단일 가닥 주형 DNA에 발생합니다. 템플릿에 포함 된 특정 자료의 검출은 chemilum의 생성에 의해 모니터링inescent 신호. 화학 발광 신호를 생성 dNTPs의 순서는 템플릿의 DNA 순서를 결정합니다. pyrosequencing 기술의 실시간 시퀀싱 기능은 하나의 분석의 급속한 미생물 식별 할 수 있습니다. 또한, pyrosequencing 악기, SNPs를, 점 돌연변이, 삽입 및 삭제뿐만 아니라 일부 항균성 저항에서 발생할 수있는 여러 유전자 사본의 정량화 입력 등의 항균성 약물 저항의 전체 유전 적 다양성을 분석 할 수 있습니다 패턴입니다.

소프트웨어를 사용하여 일반적인 pyrosequencing 실행의 결과는 amplicon의 생성에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머의 위치 및 보존 16S 리보솜 순서 (그림 10)에서 pyrosequencing 반응에 사용되는 시퀀싱 프라이머를 보여줍니다. 프라이머 사이의 hypervariable 순서 사이트는 보존 시퀀싱 프라이머 (5&#39;-TACATGCAAGTCGA)를 사용하여 박테리아 많은 수의 세균 식별 할 수 있습니다. 내부 품질 관리로, DNA 시퀀스 브라케팅 변수 영역이 올바른 DNA 영역이 분석되었음을 보장하기 위해 검사 할 수 . pyrosequencing 소프트웨어는 세균의 식별을위한 박테리아 리보솜 시퀀스의 내부 데이터베이스에 생성 된 시퀀스의 비교 및​​ 정렬 할 수 있습니다. 또한, 순서는 항생제 약물 내성을 부여 변이를 결정하기 위해 분석 할 수 있습니다. Helicob의 23S 리보솜 유전자의 돌연변이의 예를 들어, 분석acter pylori 감염은 항생제 내성을 부여하는 두 변이 패턴 (GAA 또는 AGA) (그림 11)를 보여줍니다. 같은 환자에서 여러 균주의 분석은 동시에 미생물 약제 내성 발생의 역학 조사에 도움이 시간이 지남에 약물 저항의 출현을 추적 할 assayed 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> 그림 1. 바이오틴 PCR 제품은 파이로 인산 (PPI)의 생성으로 이어지는, DNA 중합 효소에 의해 dNTPs를 통합하는 템플릿으로 사용됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> 그림 2. ATP sulfurylase 비례 프로입니다 빛을 생성 oxyluciferin에 루시페린의 루시 페라 제 - 중재 변환을위한 촉매로 ATP. ATP의 역할에 피로 인산으로 변환ATP의 양에 비 례. 빛이 pyrogram 추적에 최대로 기록 염기 결합을 나타냅니다. 다음 dNTP가 합성의 연속에 대한 추가되기 전에 비법 dNTPs는 apyrase에 의해 성능이 저하됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> 그림 3. 하나 이상의 특정 dNTP의이 (dATP, dTTP, dGTP, dCTP 또는) 순차적으로 템플릿 가닥에 포함 된 경우 생성 된 빛의 강도를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> 그림 4. 바이오틴 PCR 제품을 무력화하는 마스터 믹스의 준비를위한 플로우 차트. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> GE = &quot;항상&quot;&gt; 그림 5. PCR 플레이트, PyroMark 판과 저점의 위치와 PyroMark 워크 스테이션. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> 그림 6. 위치 ON과 OFF 진공 스위치의 위치. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> 그림 7. 진공 도구입니다. 진공 도구의 적절한 취급. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> 그림 8. 카트리지 게이트 위치에 카트리지를 열었습니다. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> 그림 9. 문이 닫힌 카트리지가 올바르게 삽입. &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> 그림 10. 기반 박테리아 식별 결과를 Pyrosequencing. PCR 프라이머는 DNA 템플릿의 보존 지역을 위해 설계되었으며, 시퀀싱 프라이머의 amplicon (파란색으로 표시)에서 잘 특성화 식별 hypervariable DNA 서열의 상류에 즉시 배치됩니다. <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> 그림 11. pyrosequencing을 사용하여 헬리코박터 파일로리의 항생제 약물 저항의 검출. GAA 또는 AGA 시퀀스를 포함하는 헬리코박터 항균 저항을 부여 23S 유전자의 돌연변이 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;TD&gt; 구성 요소 </td><td> 반응 볼륨 당 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 파이 PCR 마스터 믹스, 배 </td><td> 12.5 μL </td><td> 1X </td></tr><tr><td> CoralLoad 집중, 배 </td><td> 2.5 μL </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 25 mM의 MgCl 2 (선택 사양) </td><td> 변하기 쉬운 </td><td> ≥ 1.5 밀리미터 </td></tr><tr><td> 배 Q-솔루션 (옵션) </td><td> 5 μL </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 프라이머 / 프라이머 B </td><td> 변수 / 변수 </td><td> 0.2 μM/0.2 μM </td></tr><tr><td> RNase가없는 물 </td><td> 변하기 쉬운 </td><td> - </td></tr><tr><td> 총 양 (템플릿 DNA를 추가 한 후) </td><td> 25 μL </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. PCR 반응 혼합물. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; NBSP의; </td><td></td><td> 추가 의견 </td></tr><tr><td> 초기 PCR 활성화 단계 </td><td> 15 분 </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA 중합 효소가 활성화됩니다 </td></tr><tr><td> 3 단계 순환 : 변성 </td><td> 30 초 </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> 가열 냉각 </td><td> 30 초 </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> 게놈 DNA에 대한 아황산 수소 변환 DNA에 대한 </td></tr><tr><td> 확장 </td><td> 30 초 </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> 사이클의 수 </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 최종 확장 </td><td> 10 분 </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. PCR 사이클 사양.

Pyrosequencing은 박테리아를 식별하는 균주를 구별하고, 항균 에이전트에 저항성을 부여하는 유전자 변이를 감지하는 데 사용할 수있는 미생물 게놈 시퀀싱을 용이하게하는 다양한 기술입니다. 이 비디오에서는, 미생물 amplicon의 생성,의 amplicon의 pyrosequencing 및 DNA 염기 서열 분석을위한 절차를 설명합니다.

미생물 식별 및 특성화를위한 Pyrosequencing

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

다음 실험의 전반적인 목표는 파이로시퀀싱(pyro sequencing) 방법론을 이용한 16 s 리보솜 DNA 서열 분석을 통해 박테리아를 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 비오틴화된 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 표적 DNA를 증폭합니다. 그 후, 비오틴화된 증폭물을 스트렙타비딘이 코팅된 스페로스(spheros) 비드를 사용하여 고정시키고 세척 완충액을 이용해 정제합니다.다음으로, 앰플리콘을 변성시키고 단일 가닥 DNA에 16 s 리보솜 시퀀싱 프라이머를 결합합니다. 이 단계의 목적은 DNA를 시퀀싱할 수 있도록 준비하는 것입니다. 마지막으로, 합성 기반 시퀀싱 원리를 이용하여 핵산을 신속하고 정확하게 시퀀싱하는 방법인 파이로시퀀싱(pyro sequencing)을 통해 DNA 시퀀싱 반응을 진행합니다.비오틴화된 프라이머는 DNA polymerase에 의해 템플릿으로 사용되어 dNTP를 한 번에 한 염기씩 결합시키며, 이 과정에서 피로인산이 생성됩니다. ATP sulfurylase는 피로인산을 ATP로 비례적으로 전환하며, ATP는 luciferase 매개 반응을 통해 luciferin을 oxyluciferin으로 전환시켜 ATP 양에 비례하는 빛을 생성합니다. 이 빛은 pyro trace 상의 피크로 기록되며 뉴클레오타이드의 결합을 나타냅니다. 결합되지 않은 dNTP는 다음 dNTP가 추가되어 합성이 계속되기 전에 apyrase에 의해 분해됩니다.프로그램에 기록된 화학발광 신호를 통해 DNA 서열을 결정할 수 있습니다. 얻어진 결과는 리보솜 16S rDNA 서열이며, 이를 리보솜 DNA 참조 데이터베이스와 비교하여 박테리아를 식별하는 데 사용합니다. 파이로 시퀀싱(Pyro sequencing)은 미생물 게놈 서열 분석을 용이하게 하는 다목적 기술로, 박테리아 종의 식별, 박테리아 균주 구별 및 항균제 내성을 부여하는 유전자 변이 검출에 활용될 수 있습니다.본 영상에서는 박테리아 앰플리콘 생성, 앰플리콘 파이로 시퀀싱 및 DNA 서열 분석 절차를 시연합니다. 템플릿 증폭 절차를 시작하기 위해 필요한 모든 용액을 해동하고 각각 충분히 혼합하십시오. 모든 작업은 실온에서 수행할 수 있습니다. 다음 표에 따라 PCR 반응을 준비하십시오.대부분의 경우 최종 염화마그네슘 농도가 1.5 millimolar일 때 만족스러운 결과를 얻을 수 있다는 점에 유의하십시오. 하지만 더 높은 마그네슘 농도가 필요한 경우, 25 millimolar 염화마그네슘을 최대 3.5 microliters까지 반응액에 첨가할 수 있습니다. 프라이머 중 하나는 5' 말단이 비오틴화되어야 하며, 해당 프라이머는 HPLC로 충분히 정제하는 것이 권장됩니다.완만하게 피펫팅하여 반응 혼합물을 섞은 후, PCR 튜브에 적절한 부피를 분주합니다. 다음으로, 각 PCR 튜브에 템플릿 DNA를 첨가합니다. 반응당 10 nanograms의 genomic DNA를 사용하는 것을 권장합니다.마스터 믹스를 만들기 전에 PCR 튜브를 사이클러에 넣고 사이클링 프로그램을 시작하십시오. strep avid 및 coated seros 비드 병을 부드럽게 흔들어 균일한 현탁액이 되도록 합니다. 다음 순서도에 따라 마스터 믹스를 만드십시오.마이크로 원심분리 튜브에 비드, 결합 버퍼 및 고순도수를 혼합합니다. 사용된 PCR 생성물의 부피에 따라, 각 웰의 총 부피가 80 µL가 되도록 PCR 플레이트의 각 웰에 60에서 75 µL의 마스터 믹스를 분주합니다. 각 웰에 5에서 20 µL의 비오틴화된 PCR 생성물을 첨가합니다.각 웰의 부피는 이제 80 µL가 되어야 합니다. 스트립 캡으로 웰을 밀봉하고, 오비탈 셰이커를 사용하여 실온에서 1,400 RPM으로 5~10분 동안 PCR 플레이트를 교반합니다. 이 절차는 시퀀싱 프라이머를 니엘링 버퍼(kneeling buffer)로 0.3 µM까지 희석한 후, 반응 플레이트의 각 웰에 25 µL씩 분주하는 것으로 시작하십시오.플레이트를 진공 워크스테이션 위에 배치합니다. 이 도표에 따라 워크스테이션 트로프를 채웁니다. 트로프 1에는 70% ethanol 50 milliliters, 트로프 2에는 변성 용액 40 milliliters, 트로프 3에는 세척 버퍼 50 milliliters, 트로프 4에는 초순수 50 milliliters, 트로프 5에는 초순수 70 milliliters를 넣습니다.진공 펌프를 켜고 진공 툴의 스위치가 켜짐(on) 상태인지 확인한 후, 고순수(high purity water)로 필터 프로브를 세척합니다. 트러프(trough) 5에서, PCR 플레이트와 반응 플레이트의 방향이 일치하도록 확인하며 비드가 들어 있는 PCR 플레이트를 워크스테이션에 배치합니다. 진공 툴을 PCR 플레이트의 웰 내부로 내립니다.진공 상태를 유지하며 20초 동안 또는 모든 용액이 흡입될 때까지 비즈를 진공 툴로 포집합니다. 70% ethanol로 20초 동안 또는 모든 용액이 흡입될 때까지 툴을 세척합니다. 다음으로, Denaturation solution으로 20초 동안 또는 모든 용액이 흡입될 때까지 툴을 세척합니다.그 후, 진공 상태를 유지하면서 모든 용액이 흡입될 때까지 또는 20초 동안 세척 버퍼로 도구를 헹굽니다. 진공 도구 내의 모든 액체가 배출될 수 있도록 진공 도구를 수직 방향으로 90도 이상 들어 올려 5초 동안 유지합니다. 이제 펌프 전원을 끄고 진공 도구를 3번 반응 플레이트에 맞춥니다.진공 툴을 웰 내부로 내립니다. 그런 다음 약 10초 동안 좌우로 가볍게 흔들어 시퀀싱 프라이머가 들어 있는 웰로 비드를 방출합니다. 시퀀싱 프라이머를 DNA에 어닐링하기 위해 진공 툴을 세척용 수조에 넣습니다.반응 플레이트를 미리 가열된 플레이트 홀더에 넣습니다. 80 °C에서 2분 동안 플레이트를 가열합니다. 홀더에서 플레이트를 꺼내 실험대 위에 놓고 5분 동안 실온으로 식힙니다.전원 코드 위에 있는 전원 스위치를 사용하여 기기의 전원을 켜고 필요한 부피를 확인하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 기기 소프트웨어에서 런 파일을 설정하고, 도구(tools) 메뉴에서 사전 실행 정보(pre-run information)를 선택하십시오. 사전 실행 정보 페이지에 제공된 지침에 따라 카트리지를 채우십시오.공기 방울이 생기지 않도록 주의하며, 각 웰의 구석 끝까지 피펫 팁을 넣습니다. 카트리지 게이트를 열고 라벨이 정면을 향하도록 카트리지를 삽입합니다. 카트리지가 제대로 삽입되었는지 확인한 후 게이트를 닫습니다.플레이트 고정 프레임을 열고 반응 플레이트를 기기 내부에 배치합니다. 플레이트 고정 프레임과 기기 덮개를 닫습니다. 기기 소프트웨어로 생성된 런 파일이 담긴 USB 스틱을 기기 전면의 USB 포트에 삽입합니다.원하는 실행 파일의 메뉴를 확인합니다. 스크롤 화살표를 사용하여 원하는 실행 파일을 선택하고 select를 누릅니다. 모든 사전 설정된 압력 및 온도 수준에 도달하면, 기기가 실행 중에 시약을 분주하기 시작합니다.기기 화면에 선택한 웰의 파이로그램(pyro)이 실시간으로 표시됩니다. 스크롤 화살표를 사용하여 다른 웰의 파이로그램을 확인하십시오. 기기가 분석 완료를 확인하고 분석 파일이 USB 메모리에 저장되면, 닫기(close)를 누르십시오.USB 메모리를 제거하십시오. 여기에서는 전형적인 파이로 시퀀싱(pyro sequencing) 실행 결과가 표시됩니다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 DNA 템플릿의 보존 영역인 16 s 리보솜 서열을 대상으로 설계되었습니다.이 예시에서, 시퀀싱 프라이머는 파란색으로 표시된 앰플리콘 내의 잘 규명된 식별용 초가변 DNA 서열 바로 상류에 위치합니다. 이러한 초가변 서열을 통해 수많은 박테리아 종을 식별할 수 있으며, 보존된 시퀀싱 프라이머를 내부 품질 관리용으로 사용하여 가변 영역을 둘러싼 DNA 서열을 확인함으로써 올바른 DNA 영역이 분석되었는지 보장할 수 있습니다. 파이로 시퀀싱 소프트웨어는 생성된 서열을 박테리아 리보솜 서열 내부 데이터베이스와 비교 및 정렬하여 박테리아 식별을 가능하게 합니다.또한, 서열 분석을 통해 항생제 내성을 부여하는 돌연변이를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, helicobacter pylori의 23 s 리보솜 유전자 돌연변이를 분석하면 항생제 내성을 부여하는 GAA 또는 GA라는 두 가지 돌연변이 패턴이 나타납니다. 파이로 시퀀싱(Pyro sequencing)은 미생물 게놈 시퀀싱을 용이하게 하는 다재다능한 기술입니다.미생물학 응용 분야에서 파이로 시퀀싱(pyro sequencing)의 장점은 신속하고 신뢰할 수 있는 고처리량 스크리닝과 미생물 및 미생물 게놈 돌연변이의 정확한 식별이 가능하다는 점입니다. 또한, 파이로 시퀀싱 방법론은 SNP 점 돌연변이, 삽입 및 결실의 타이핑뿐만 아니라 일부 항균제 내성 패턴에서 나타날 수 있는 다중 유전자 복제수의 정량화를 포함하여 항균제 내성의 전체적인 유전적 다양성을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 시퀀싱 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

Pyrosequencing은 (R) polymorphisms을 분석하는 데 사용 날짜에 가장 철저한 아직 간단한 방법 중 하나입니다. 이 방법은 많은 임상 관련 polymorphisms을 포함하여 신속하고 효율적인 단일 염기 다형성 평가되었다. Pyrosequencing의 기술과 방법론을 설명합니다.

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

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16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.

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세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

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우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.

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미생물 식별 및 특성화를위한 Pyrosequencing

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