2.1: 혈구계를 사용하여 세포 수 측정

세포 계수는 세포 수와 생존율을 결정하기 위한 많은 세포 기반 분석에서 중요한 단계입니다. 일반적으로 계수의 목표는 알 수 없는 세포 농도의 샘플이 추가 사용을 위해 얼마나 희석되어야 하는지 이해하는 것입니다. 세포 계수를 위한 가장 일반적인 실험실 도구는 혈구계입니다.

혈구계는 원래 혈구를 계수하기 위해 만들어진 계수 도구입니다. 혈구계의 중앙에는 두 개의 계수 챔버가 있으며, 그 위에서 레이저 에칭 그리드를 찾을 수 있습니다.

그리드는 9개의 주 사분면으로 구성됩니다. 4개의 모서리 사분면은 16개의 더 작은 사분면으로 더 나뉩니다. 중앙 사분면은 이러한 25개의 작은 사분면으로 나뉘며, 각 사분면은 16개의 마이크로 사분면으로 더 나뉩니다.

각 챔버의 맨 끝에는 시료 주입 포트가 있으며, 여기에 계수할 세포 시료가 분배됩니다.

계수 챔버의 양쪽에는 커버 슬립 장착 지지대가 있으며, 그 위에 석영 커버 슬립이 놓여 있으며 일반적으로 계수 챔버에서 약 0.1mm 위에 있습니다.

각 큰 사각형의 면적은 1mm2이므로 각 큰 사각형에 포함된 부피는 0.1mm3 또는 ml의 1/10,000입니다.

세기 전에 항상 잠시 시간을 내어 에탄올과 김닦이를 사용하여 커버슬립과 계수실에서 보푸라기, 지문 또는 워터마크를 청소하고 말리십시오.

그런 다음 각 커버슬립 장착 지지대에 소량의 물을 조심스럽게 추가하면 물의 표면 장력이 커버슬립을 제자리에 고정합니다.

이제 세포 현탁액을 부드럽게 분쇄하거나 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 제거합니다. 마이크로피펫을 사용하여 현탁액의 약 10μl를 흡입한 다음 주입 포트 중 하나에 샘플을 로드합니다. 용액은 모세관 작용에 의해 계수 챔버로 유입되며 전체 그리드를 덮어야 합니다.

세포가 안정화되는 동안 목표를 선택합니다. 그런 다음 혈구계를 무대에 로드합니다.

다음으로 현미경으로 세포를 봅니다. 각 큰 사분면에 5개 미만의 셀이 있는 경우 샘플을 다시 스핀다운하고 펠릿을 더 작은 부피로 재현탁해야 할 수 있습니다. 세포가 서로 겹치거나 너무 조밀하여 서로 쉽게 구별할 수 없는 경우 더 많은 양의 용액으로 샘플을 희석해야 할 수 있습니다. 세포를 희석하는 요인을 추적하십시오. 나중에 계산할 때 필요합니다.

이제 세포를 셀 차례입니다!

앞서 이야기했듯이 계수실은 레이저로 에칭된 그리드로 덮여 있습니다. 사분면의 선을 사용하면 계산하고 있는 셀을 더 쉽게 추적할 수 있습니다. 샘플에 있는 세포의 밀도에 따라 계수할 크기 사분면을 선택하십시오. 예를 들어, 셀 수가 적으면 모서리 사분면 중 하나에 있는 모든 셀을 셉니다. 중간 정도의 세포가 있는 샘플의 경우 16개의 작은 사분면 중 하나를 선택합니다. 세포 밀도가 매우 높으면 25개의 중앙 사분면 중 하나에 있는 세포를 세십시오. 어떤 사분면을 선택하든 세포 샘플의 밀도에 관계없이 편향제당 최소 20-50개의 세포를 계수하십시오.

모든 셀이 사분면 내에 깔끔하게 떨어지는 것은 아닙니다. 위쪽 및 왼쪽 선에 닿는 셀은 셀 수 있지만 아래쪽 또는 오른쪽 선에 닿는 셀은 무시할 수 있습니다. 가장 정확한 개수를 얻으려면 셀 카운터를 사용하여 셀을 추적하고 동일한 크기의 4개 사분면에 있는 셀 수의 평균을 구합니다.

1ml 부피의 세포 수를 계산하려면 앞에서 언급했듯이 그리드의 각 큰 사각형이 ml의 1/10,000이기 때문에 계산된 세포 수에 10,000을 곱합니다. 이 더 큰 사분면 중 하나를 세었다면 이 숫자 1을 곱하기만 하면 됩니다. 모서리 사분면 중 하나에 있는 작은 사각형 중 하나를 세었다면 이 숫자에 16을 곱합니다. 25개의 중앙 사분면 중 하나에 있는 모든 셀을 세었다면 이 숫자에 25를 곱합니다. 혈구 측정기를 로드하기 전에 세포 현탁액을 희석한 경우 희석 인자도 곱해야 합니다.

그런 다음 이 샘플의 1ml에 있는 세포 수를 계산하기 위해 이 중앙 사분면에 있는 20개의 셀에 104와 25를 곱하여 1ml의 샘플에 총 5 x 106 셀을 얻습니다.

이제 샘플 1ml에 있는 총 세포 수를 알았으므로 이 숫자에 용액의 총 부피를 곱해야 합니다. 예를 들어, 1ml에 5 x 106 셀이 있는 경우 2ml에는 총 1 x 107 셀이 있습니다.

그런 다음 잘못된 계수, 불균일한 세포 분포 또는 파이펫팅 오류로 인한 오류를 방지하려면 챔버의 다른 쪽을 로드하고 세포 샘플을 두 번째로 계수합니다.

현미경으로 세포를 계수하는 것도 샘플에 있는 세포의 생존력을 평가할 수 있는 좋은 시간입니다. 중요한 염색제인 트리판 블루(Trypan blue)는 이러한 목적으로 혈구계에 로드되기 전에 샘플과 혼합되는 경우가 많습니다.

살아있는 세포는 이 염료를 제외하는데, 이는 살아있는 세포가 막을 통해 허용하는 것에 대해 매우 선택적이기 때문입니다. 그러나 죽은 세포에는 온전한 막이 없기 때문에 트리판 블루가 세포질을 통과하여 염색할 수 있습니다.

세포 샘플의 생존력을 확인하려면 세포 현탁액의 부분 표본을 trypan blue로 희석한 다음 일반 세포 샘플과 마찬가지로 trypan blue 염색 샘플을 로드합니다. 위상차 아래에서 살아있는 세포는 밝고 황금색으로 보이며 계산해야 합니다. 칙칙하고 죽은 파란색 세포는 하나도 세지 마십시오.

이전과 같이 셀 수를 계산하고 이번에는 최종 숫자에 trypan blue dilution factor를 곱합니다. 따라서 원래의 대표 샘플이 먼저 트리판 블루로 희석되었다면, 총 세포 수에 1:10 트리판 블루 희석을 곱하여 샘플에 총 1x108 세포가 생성되었을 것입니다.

계수가 끝나면 커버 슬립과 계수 챔버를 청소하는 것을 잊지 마십시오!

이제 세포 계수 전문가이므로 특정 실험에서 얼마나 많은 세포가 있는지 알아야 할 수 있는 몇 가지 이유에 대해 이야기해 보겠습니다.

정상 조직이나 실험 조직에서 세포를 분리한 후에는 얼마나 많은 세포를 회수했는지 아는 것이 중요합니다. 여기서 연구자들은 이 쥐의 비장에서 얼마나 많은 비장 세포 또는 비장 세포를 분리했는지 알고 싶어할 것입니다.

두 개의 서로 다른 세포 집단이 어떻게 반응하는지 확인하기 위해 실험을 수행할 때 B 세포와 T 세포를 사용한 공동 배양 실험에서와 같이 각 세포 유형이 얼마나 많이 혼합되고 있는지 아는 것이 중요합니다.

다른 많은 유형의 세포 기반 분석을 위해 얼마나 많은 세포가 있는지 알고 싶을 것입니다. 여기에서 인유두종 바이러스에 대한 반응으로 염증성 단백질인 IFN?을 분비할 샘플의 세포 수를 결정하기 위해 ELISPOT 분석이 설정되고 있습니다.

관심 세포에서 mRNA를 추출하거나 분리해야 하는 실험을 수행할 때 실험에 필요한 충분한 양의 mRNA를 획득하기 위해 얼마나 많은 호출로 시작하는지 아는 것이 중요합니다.

혈구계는 세포 계수에 저렴하고 비교적 사용하기 쉬운 도구이지만 지루할 수 있으며 인적 오류가 발생할 가능성이 있습니다.

Scepter Handheld Automatic Counter는 이름에서 알 수 있듯이 혈구계에 비해 계수 정확도가 향상되고 세포 샘플에서 세포의 크기와 부피를 모두 구별할 수 있는 휴대용 계수 장치입니다.

TC10 자동 세포 계수기는 세포 수와 생존도를 모두 평가하고, 시료의 총 세포 수를 자동으로 계산하며, 판독 화면에서도 세포를 볼 수 있습니다.

당신은 방금 세포 계수에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 비디오에서는 혈구계가 무엇인지, 세포를 계수하고 세포 생존력을 결정하는 방법, 세포를 계수해야 하는 몇 가지 다른 이유를 검토했습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 파란색 셀을 세지 않는 것을 잊지 마십시오!