유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정량적 DNA 결합 분석법을 시연하는 것이며, 이는 단백질-DNA 상호작용 조사, 유전자 발현의 전사 조절 인자 발견 및 새로운 항종양제 식별에 유용합니다. 이는 먼저 적절한 BIOTINYLATED DNA 표적이 포함된 스트렙타비딘 코팅 분석 플레이트를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 잠재적 억제제의 유무에 따라 핵 추출 단백질을 첨가하여 이들이 DNA 표적과 결합하도록 하는 것입니다.

다음으로, 결합된 전사 인자를 1차 항체와 서구마래(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체로 검출합니다. 마지막 단계는 색상 발현을 유도하기 위해 웰에 서구마래(horseradish peroxidase) 기질을 첨가하는 것입니다. 최종적으로, 분광광도계를 사용하여 색상 발현 정도를 측정합니다.

시간이 지남에 따라 색 변화의 정도는 DNA 결합 정도와 잠재적인 DNA 결합 억제제의 효과를 나타냅니다. 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay)과 같은 다른 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 정량적인 DNA 억제제 결합 분석이라는 점입니다. 우선, 테스트하는 각 조건당 최소 3 × 10⁷개의 세포로 구성된 적절한 수의 세포 배양물을 준비하십시오.

여기서는 run X2 단백질을 발현하는 인간 골수 내피 세포를 사용합니다. 세포의 밀도가 80%에 도달하면, 세포 성장을 G2/M 세포 주기 경계에서 정지시키기 위해 0.2 µg/mL의 nocodazole로 세포를 처리합니다.

이렇게 하면 run X two 단백질이 안정화되어 16시간 후에 최대의 DNA 결합력을 나타내게 됩니다. 함께 제공된 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 세포를 용해하고 단백질을 분리하십시오. 단백질 분리가 완료되면 표준 BCA 분석법을 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오.

그 다음, 샘플을 2~5 mg/mL 농도의 10 µL 분주량으로 나누어 -80 °C에서 보관하십시오. 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.1 M 탄산나트륨 용액 300 µL를 추가하여 고정합니다. 각 샘플을 3회 반복 실험할 수 있도록 충분한 수의 웰을 준비하십시오.

플레이트를 실온의 로킹 플랫폼(rocking platform)에서 2시간 동안 배양합니다. 그 다음 300 µL의 strep avid 및 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척하고, 웰당 1.25 nM의 비오틴 표지 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 100 µL를 넣어 로킹 상태로 2시간 동안 배양합니다. 이어서 strep din 세척 버퍼로 플레이트를 3회 더 세척합니다.

그 다음, 1X DNA 결합 버퍼, 웰당 3~9 µg의 DNA 결합 단백질, 그리고 웰당 1 µg의 poly DIGC가 포함된 마스터 믹스를 웰당 100 µL씩 추가합니다. 이어서 비타민 D3와 같은 잠재적 억제제 또는 에탄올과 같은 용매 대조군의 적절한 희석액이 포함된 마스터 믹스를 각각의 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 덮고, 핵 추출물과 함께 배양한 후 4 °C의 로킹 플랫폼에서 하룻밤 동안 둡니다.

플레이트를 strep avid 및 세척 버퍼로 3회 세척합니다. 그다음 0.2 ng/µL로 희석한 run X two 특이적 단클론 항체를 strep avid 및 세척 버퍼에 섞어 웰당 90 µL씩 첨가합니다. 플레이트를 덮고 쉐이커(rocking platform) 위에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다.

그 후 well을 strep avid 및 wash buffer로 다시 헹구고, strep AVID 및 wash buffer에 희석하여 5 ng/µL 농도가 되도록 조정한 fab 특이적 친화성 정제 HRP 접합 항체가 포함된 2차 항체 혼합물을 well당 90 µL씩 첨가합니다. 2차 항체를 쉐이킹 플랫폼 위에서 상온으로 30분 동안 배양합니다.

그 후, 웰당 300 µL의 Strp 및 세척 완충액으로 6회 세척합니다. 다음으로, 샘플을 지속적으로 모니터링하기 위해 스톡 병에서 50 µL의 tetraethyl benadine 기질을 각 웰에 직접 첨가하여 결과를 발색시킵니다. 샘플을 분광광도계에 넣고 635 nm에서 흡광도를 연속적으로 측정합니다.

단회 측정의 경우, 샘플을 상온의 암소에서 10분에서 20분 동안 배양하십시오. 이 과정 동안 웰의 색상이 투명한 상태에서 다양한 정도의 푸른색으로 변해야 합니다. 각 웰에 50 µL의 황산을 첨가하여 반응을 중단시키십시오.

그 다음, 96-웰 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 여기에 제시된 그래프는 생물학적으로 활성인 비타민 D3가 Runx2-DNA 결합에 미치는 영향을 지속적으로 모니터링한 예시입니다. 테스트한 농도들은 Runx2-DNA 결합에 거의 영향을 주지 않았습니다.

다른 비타민 D3 화합물들이 극적인 효과를 보이는 것으로 나타났으나, 본 실험에서 테스트한 화합물 5 2 2 1 9 7 5는 컴퓨터 보조 약물 설계(computer-assisted drug design)를 통해 식별되었습니다. 테스트 결과, 이 화합물은 1 nM에서 100 µM 범위에서 RUNX2 결합에 대해 용량 의존적 억제 효과를 보였으며, 단 0.01 µM의 화합물만으로도 RUNX2-DNA 결합의 50%를 억제할 수 있었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 DNA 결합 분석을 수행하고 DNA 결합의 잠재적 억제제를 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.