유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석
2013년 8월 31일
우리는 DNA 전사 인자와의 상호 작용을 측정하는 정량적 DNA-결합, ELISA 기반 분석법을 개발 하였다. RUNX2 단백질에 대한 높은 특이성은 합의 DNA 인식 올리고 뉴클레오티드 및 특정 단일 클론 항체를 달성했다. 효소 결합 항체 반응 기질과 발색 검출은 실시간으로 모니터링 하였다.
이 절차의 전반적인 목표는 단백질 DNA 상호 작용을 검사하고 유전자 발현의 전사 조절자를 발견하며 새로운 항종양제를 식별하는 데 유용한 정량적 DNA 결합 분석을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 BIOTINYLATED DNA 표적이 있는 streptavidin 코팅된 분석 플레이트를 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 잠재적 억제제가 있거나 없는 핵 추출물 단백질을 첨가하여 DNA 표적과 결합할 수 있도록 하는 것입니다.
다음으로, 결합된 전사 인자는 1차 항체 및 무 과산화효소 결합 2차 항체로 검출됩니다. 마지막 단계는 발색을 유도하기 위해 우물에 무 과산화효소 기질을 추가하는 것입니다. 궁극적으로 발색은 분광 광도계로 측정됩니다.
시간이 지남에 따라 색상 변화의 양은 DNA 결합의 정도와 DNA 결합의 잠재적 억제제의 효과를 나타냅니다. 전기영동 이동성 이동 분석과 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 정량적 DNA 억제제 결합 분석이라는 것입니다. 먼저, 테스트된 각 조건에 대해 7개의 세포에 대해 최소 3개의 곱하기 10으로 구성된 적절한 수의 세포 배양을 준비합니다.
여기에서는 런 X 2 단백질을 발현하는 인간의 골수 내피 세포가 사용되고 있습니다. 일단 세포가 80% confluent가 됩니다. G 2 M 세포 주기 경계에서 세포 성장을 저지하기 위해 코나졸이 없는 밀리리터당 0.2마이크로그램으로 세포를 처리합니다.
이것은 run X two 단백질을 안정화시키고 16시간 후에 최대 DNA 결합을 생성합니다. 세포를 Lyce하고 동봉된 텍스트 프로토콜의 지시에 따라 단백질을 분리합니다. 단백질이 분리되면 표준 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
그런 다음 섭씨 영하 80도의 샘플을 10마이크로리터 분취액에 1밀리리터당 2-5밀리그램 사이의 농도로 보관합니다. 96 웰 플레이트를 0.1 몰 농도의 탄산나트륨 용액으로 300 마이크로 리터의 혼합물을 첨가하여 고정합니다. 글쎄, 각 샘플이 세 번 실행되도록 충분히 잘 준비하십시오.
실온의 흔들 플랫폼에서 2 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 연쇄상구균 및 세척 완충액으로 플레이트를 세 번 세척하고 흔들면서 2시간 동안 웰당 1.25나노몰의 속도로 100마이크로리터의 비오틴 표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 배양합니다. 다음으로, 연쇄상구균 딘 세척 버퍼로 플레이트를 세 번 더 세척합니다.
그런 다음 웰당 3-9마이크로그램의 XDNA 결합 완충액 DNA 결합 단백질 1개와 웰당 1마이크로그램의 폴리 DIGC를 포함하는 마스터 믹스당 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 비타민 D 3와 같은 잠재적 억제제 또는 에탄올과 같은 용매 대조제의 적절한 희석액을 포함하는 마스터 믹스를 각각의 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 덮고 핵 추출물로 배양 한 후 밤새 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에 놓습니다.
연쇄상구균 avid 및 세척 버퍼로 플레이트를 세 번 세척합니다. 그런 다음 런 X의 웰당 90마이크로리터, 마이크로리터당 0.2나노그램으로 희석된 2개의 특정 단클론 항체, 연쇄상구균 및 세척 완충액을 추가합니다. 접시를 덮고 흔들 플랫폼에서 실온에서 한 시간 동안 배양합니다.
그런 다음 웰을 연쇄상구균 아비드로 다시 헹구고 완충액을 세척하고 마이크로리터당 5나노그램의 특이적 친화도 정제된 HRP 복합 항체를 함유하는 2차 항체 혼합물을 웰당 90마이크로리터씩 추가합니다. AVID 및 세척 버퍼. 2차 항체를 흔들 플랫폼에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 Strp와 세척 버퍼당 300마이크로리터로 6번 세척합니다. 다음으로, 샘플의 지속적인 모니터링을 위해 50마이크로리터의 테트라에틸 베나딘 기질을 스톡 병에서 직접 각 웰에 추가하여 결과를 개발합니다. 샘플을 분광 광도계에 넣고 635나노미터에서 흡광도를 연속적으로 측정합니다.
일회성 측정의 경우 어두운 곳에서 실온에서 10-20분 동안 샘플을 배양합니다. 이 기간 동안 우물은 맑은 파란색에서 다양한 정도의 파란색으로 변해야 합니다. 각각에 50마이크로리터의 황산을 첨가하여 반응을 중지합니다.
그런 다음 96웰 플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 여기에 표시된 그래프는 run X 2D NA 결합에 대한 생물학적 활성 비타민 D 3의 효과를 지속적으로 모니터링하는 예입니다. 테스트 된 농도는 run X 2D NA 결합에 거의 영향을 미치지 않았습니다.
다른 비타민 D는 세 가지 화합물이 극적인 효과를 발휘하는 것으로 나타났습니다. 여기에서 테스트된 화합물 5 2 2 1 9 7 5는 컴퓨터 보조 약물 설계를 사용하여 확인되었습니다. 테스트 결과, 화합물은 1 나노 몰에서 100 마이크로 몰까지 rux 2 결합의 용량 의존적 억제를 나타 냈으며, renx 2D NA 결합의 50 %는 화합물의 단 0.01 마이크로 몰로 억제 될 수있었습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 DNA 결합 분석을 수행하고 DNA 결합의 잠재적 억제제를 테스트하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 단백질-DNA 상호작용, 특히 전사 인자에 중점을 두고 단백질-DNA 결합을 연구하도록 설계된 정량적 DNA 결합 분석법을 소개합니다. 이 분석법은 스트렙타비딘 코팅 플레이트와 바이오틴화된 DNA를 사용하여 색상 측정을 통해 RUNX2 단백질 상호작용의 검출을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생화학
- 분자 생물학
- 전사 조절
배경
- 단백질-DNA 상호작용의 이해는 유전자 발현 조절에 중요합니다.
- 전사 인자는 세포 과정 및 질병 메커니즘에서 중요한 역할을 합니다.
- 정량적 분석법은 전사 조절인자를 식별하는 데 필수적입니다.
- 색상 검출 방법은 상호작용의 실시간 모니터링을 제공합니다.
연구 목적
- DNA에 대한 전사 인자 결합을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 분석법을 개발합니다.
- 유전자 발현의 잠재적 전사 조절인자를 식별합니다.
- 단백질-DNA 상호작용 분석을 통해 새로운 항암제를 탐색합니다.
사용된 방법
- 스트렙타비딘 코팅 분석 플레이트의 준비.
- 결합 분석을 위한 바이오틴화된 DNA 표적의 사용.
- 핵 추출물 단백질 및 잠재적 억제제의 통합.
- 특정 항체를 사용한 결합된 전사 인자의 검출.
주요 결과
- 합의 DNA-인식 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RUNX2에 대한 높은 특이성을 달성했습니다.
- 실시간 색상 검출이 성공적으로 구현되었습니다.
- 이 분석법은 단백질-DNA 상호작용의 효과적인 측정을 보여주었습니다.
- 전사 조절인자 식별에 대한 잠재적 응용이 강조되었습니다.
결론
- 개발된 분석법은 전사 인자 상호작용을 연구하는 데 귀중한 도구입니다.
- 암 연구에서 새로운 치료 표적의 발견을 돕는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 이 분석법의 다양한 생물학적 맥락에서의 응용을 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of protein-DNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. This D-ELISA assay enables precise measurement of transcription factor binding and inhibitor effects, supporting predictive confidence at key inflection points in oncology and gene regulation portfolios. Its quantitative outputs facilitate robust triage and prioritization of candidate modulators for further development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of transcription factor-DNA binding for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying inhibitor effects on protein-DNA interactions.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation and target engagement.
Screening & Assay Development
- Provides a quantitative, reproducible platform for screening DNA-binding inhibitors.
- Standardizes detection of transcription factor activity using colorimetric readouts.
- Enables scalable, multiwell assay formats suitable for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant transcriptional regulation in oncology models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of anti-tumor agents.
- Reduces biological risk by confirming target modulation in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative DNA-binding assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging target validation, lead identification, and translational research for transcriptional regulators.
- Discovery Biology: Quantifies transcription factor-DNA interactions to clarify pathway roles and validate targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for inhibitor screening and assay standardization.
- Analytics: Provides absorbance-based measurements for comparative analysis of binding and inhibition.
- Translational Research: Supports preclinical evaluation of candidate anti-tumor agents targeting gene regulation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse protein-DNA interaction studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility, scalability, and standardization across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust inhibitor evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transcriptional regulator programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein extraction, antibody-based detection, and quantitative assay design.
- Needs access to multiwell plate readers and validated antibody reagents.
- Demands cross-team standardization of controls and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various transcription factors and DNA targets with appropriate optimization.
- Dependent on rigorous specificity controls to ensure meaningful quantitative outputs.
