2.2: 계대 배양

세포의 계패 작용 또는 하반배양(subculturing)은 주어진 배양액의 세포를 새로운 배양물로 분할하거나 "분할"하고 추가 확장을 촉진하기 위해 새로운 배지를 공급하는 일반적인 절차입니다. 개념 자체는 비교적 간단하지만, 이 동영상에서는 세포주의 성공적인 유지 및 확장을 위한 몇 가지 중요한 단계에 대해 설명합니다.

독성 대사 산물은 시간이 지남에 따라 세포 배양 배지에 축적됩니다. 세포를 증식시킬 때는 세포 건강을 유지하기 위해 배지를 정기적으로 교체하고 세포 과증식을 방지하기 위해 세포 증식을 모니터링하는 것이 특히 중요합니다.

일반적으로 두 가지 주요 유형의 세포가 하대배양됩니다: 불멸화된 세포주와 줄기 세포주

불멸화된 세포주는 세포주기 조절에 영향을 미치는 일종의 돌연변이를 경험하여 무기한 증식할 수 있는 다세포 유기체에서 파생된 세포입니다. 아마도 가장 유명한 불멸의 세포주는 1951년 Henrietta Lacks의 생검에서 발견된 자궁경부암 병변에서 파생된 HeLa 세포주일 것입니다.

암에 의해 불멸화되는 세포주와 대조적으로, 줄기세포주는 성체 조직과 배아 조직의 다양한 조직에서 자가 재생 및 다분화능 세포를 분리하여 생성됩니다. 적절한 조건하에서 이러한 세포는, 여기 보시는 인간 배아 줄기 세포처럼, 배양에서 무기한으로 유지될 수 있습니다.

세포는 혈액에서 분리된 불멸의 세포와 같이 현탁액에서 최적으로 배양되거나, 많은 조직 유래 세포의 경우와 같이 표면에 부착될 때 가장 잘 자랍니다.

이러한 부착 세포의 성장은 세포 건강을 보장하기 위해 면밀히 모니터링해야 합니다. 세포 유형에 따라 대부분의 부착 세포는 70-90% 융합 상태, 즉 배양 용기 표면의 70-90%를 덮을 때 계대배양해야 합니다.

세포주는 원래 세포 배양의 많은 특성을 유지하지만, 연속적인 각 계대마다 확장된 배양에 고유한 특성을 획득하기 시작할 수도 있다는 점을 명심하십시오. 따라서 개별 세포 배양을 계속 계대배양하는 횟수를 제한하는 것이 좋습니다.

세포를 통과시킬 때는 멸균 기술과 적절한 시약 및 장비를 사용하는 것이 중요합니다.

세포주의 최적 성장과 확장을 위해 적절한 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 각 세포주에는 특정 성장 보충제 칵테일이 필요하지만, 대부분의 세포주는 최소한 다음과 같은 보충제를 필요로 합니다: 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)과 같은 혈청은 소 보체를 비활성화하기 위해 열처리해야 하며 세포에 중요한 성장 인자를 제공하는 항생제, 배양액의 오염 성장을 제한하는 데 도움이 되는 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 항생제, 및 섬유아세포 성장 인자와 같은 다른 성장 인자는 세포주의 성장과 확장을 연장하는 데 도움이 됩니다. 보충 또는 "완전한" 세포 배양 배지를 사용하지 않을 때는 4C에 보관하십시오.

먼저 조직 배양 배지의 색상을 기록해 둡니다. 신선한 세포 배양 배지는 영양소가 풍부하고 맑은 주황색으로 나타나는데, 이는 부분적으로 pH 지시약인 페놀 레드가 첨가되었기 때문입니다.

세포가 배지의 영양분을 소모하기 시작하면 세포 배양에 폐기물과 산이 축적되기 시작하여 pH가 낮아집니다. 이러한 이유로 많은 조직 배양 배지에는 페놀이 적색이 포함되어 있으며, 이는 세포가 배양물을 산성으로 변할 때 배지를 주황색에서 노란색으로 바꿉니다. 이 색으로 변하기 전에 미디어를 교체하십시오!

페놀 레드가 배지를 분홍빛이 도는 색으로 바꾸면 pH가 건강한 세포 성장을 위해 너무 염기성이 좋아졌음을 나타내므로 CO2 탱크와 배지를 교체해야 할 때일 수 있습니다.

대부분의 부착 세포주는 코팅되지 않은 플라스틱에 자연적으로 부착됩니다. 따라서 페트리 접시 또는 6웰 플레이트와 같은 플라스틱 세포 배양 플레이트는 세포 계대배양에 자주 사용됩니다.

플라스틱 세포 배양 플라스크도 사용됩니다. 예를 들어, T25 세포 배양 플라스크는 작은 세포주 집단을 확장하거나 천천히 확장되는 세포주의 성장을 시작하는 데 자주 사용됩니다. T75 배양 플라스크는 일반적으로 더 빠르게 증식하거나 T25 플라스크에 들어갈 수 있는 것보다 더 많은 수의 세포를 생성하는 세포주에 사용됩니다.

부착 세포를 제거할 때는 세포를 플라스틱에 결합하는 단백질을 먼저 절단해야 합니다. 이를 위해 소화 효소인 트립신(trypsin)이 자주 사용된다. 트립신에 너무 오래 노출되면 다른 세포 표면 단백질이 손상될 수 있으므로 신중하게 시간을 맞추는 것이 중요합니다.

세포 배양 배지에는 트립신 중화제가 포함될 수 있습니다. 따라서 인산염 완충 식염수(PBS)는 종종 트립신화 전에 세포를 세척하는 데 사용됩니다.

칼슘 킬레이터인 EDTA는 때때로 트립신의 단백질 분해 기능을 향상시키는 데 사용되기도 합니다.

세포 콜로니의 확장을 위해 갓 배양된 세포는 일반적으로 약 37°C, 5% CO2 및 95% 습도에서 해당 세포주에 적합한 조건 하에서 세포 배양 인큐베이터에서 성장합니다.

시작하기 전에 세포를 얼마나 자주 모니터링해야 하는지 이해하는 것이 중요하며, 이는 세포가 얼마나 빨리 증식하는지에 따라 달라집니다.

이제 미디어가 행복한 주황색이므로 문화가 흐린지 여부와 같은 다른 문화 조건을 관찰하십시오. 아마도 오염을 나타낼 수 있습니다 -- 세포 군집의 크기와 밀도, 그리고 세포의 전반적인 품질.

세포가 약 90% 밀도에 도달한 경우 조직 배양 배지를 제거하고 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 세척합니다.

이제 세포에 트립신을 첨가한 다음 37°C에서 배양합니다. 약 5분 후 세포가 분리되었는지 확인한 다음 새로운 조직 배양 배지를 추가하여 단백질 분해를 중단합니다.

원심분리를 위해 세포 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 회전시킨 후 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 새로운 배지에 재현탁시킵니다. 얼마나 많은 세포를 수집했는지 세고 즉시 또는 나중에 확장하기에 적합한 밀도에 따라 세포를 파종합니다.

이제 세포를 계대에 넣는 방법을 알았으니, 이 방법의 몇 가지 다른 응용 프로그램을 살펴보자.

앞서 언급했듯이 인간 배아 줄기 세포는 계대배양이 필요한 세포의 일종입니다. 이들은 일반적으로 마우스 배아 섬유아세포(MEF)와 공동 배양되며, 이는 줄기세포가 만능 상태를 유지하는 데 도움이 되는 요인을 제공합니다.

공급세포에서 자란 줄기세포 군집은 ?피킹(pickion)이 필요한가요? 일단 그들이 적절한 발달 단계에 도달하면. 마이크로피펫으로 선택하거나 유리 피킹 도구로 부드럽게 긁어낸 다음 확장을 위해 새로운 배양으로 도금할 수 있습니다.

일부 세포주는 효소 분해에 민감하거나 너무 단단히 부착되어 트립신 처리만으로는 재현탁할 수 없습니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 배양 플레이트의 바닥에서 세포를 부드럽게 제거할 수 있습니다. 세포가 특히 부착되어 있는 경우, 세포 용기 바닥을 배지 또는 다른 적절한 용액으로 헹구면서 세게 긁는 동작으로 혈청학적 피펫을 움직여 보십시오. 이 기계적 해리 방법에 의해 섬세한 세포가 손상될 수 있으므로 이 방법에 주의하십시오.

단층 플라스크에서 달성할 수 있는 것보다 더 빠르고 재현성 있게 세포 확장을 확장하기 위해 단층 플라스크에 비해 세포 배양을 3-5배 확장할 수 있는 다층 플라스크를 사용할 수 있습니다.

당신은 방금 세포를 통과시키는 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 비디오에서는 세포주가 무엇인지, 세포주를 하대배양하는 방법, 그리고 세포주를 계대배양하는 방법, 그리고 세포주를 계대배양하는 몇 가지 다양한 응용 분야에 대해 살펴보았습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 미디어를 최신 상태로 유지하는 것을 잊지 마십시오!